凝胶层析法分离蛋白质-生化分离技术.pptx

,学习目标,了解凝胶层析的原理；,掌握凝胶层析的介质及选择。,重难点,重点：掌握影响凝胶层析效果的因素；,难点：凝胶介质的再生。,凝胶层析的原理,1,影响凝胶层析效果的因素,3,目录,凝胶层析的介质及选择,2,凝胶介质的再生,4,一,.,凝胶层析的原理,一,.,凝胶层析的原理,分子筛过滤,一,.,凝胶层析的原理,分子筛过滤,一,.,凝胶层析的原理,凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。,葡聚糖凝胶是指由天然高分子葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。商品名分别为,Sephadex,和,Sephacryl,。,不同规格型号的葡聚糖用英文字母,G,表示，,G,后面的阿拉伯数为凝胶得水值的,10,倍。例如，,G-25,为每克凝胶膨胀时吸水,2.5,克，同样,G-200,为每克干胶吸水,20,克。交联葡聚糖凝胶的种类有,G-10,、,G-15,、,G-25,、,G-50,、,G-75,、,G-100,、,G-150,、和,G-200,。因此，“,G”,反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分布范围。,二,.,凝胶层析的介质及,选择,二,.,凝胶层析的介质及,选择,琼脂糖凝胶是以琼脂糖为支持介质制备的凝胶。琼脂糖分为一般琼脂糖和经化学修饰后熔点降低的低熔点琼脂 糖，琼脂糖的熔点在,6265C,之间，融化后在,37C,下可维持液态数小时，,30C,时凝固成胶。多用于对染色体,DNA,在凝胶内进行原位酶切及,DNA,片段回收。琼脂糖凝胶 由于孔径大常用于大分子蛋白质、,DNA,的分离。,二,.,凝胶层析的介质及,选择,琼脂糖凝胶是以琼脂糖为支持介质制备的凝胶。琼脂糖分为一般琼脂糖和经化学修饰后熔点降低的低熔点琼脂 糖，琼脂糖的熔点在,6265C,之间，融化后在,37C,下可维持液态数小时，,30C,时凝固成胶。多用于对染色体,DNA,在凝胶内进行原位酶切及,DNA,片段回收。琼脂糖凝胶 由于孔径大常用于大分子蛋白质、,DNA,的分离。,二,.,凝胶层析的介质及,选择,聚丙烯酰胺凝胶指的是由丙烯酰胺单体，以次甲基双丙烯酰胺为交联剂，经四甲基乙二胺催化、通过游离基引发,(,光引发、化学引发等,),聚合而成的交联聚丙烯酰胺。它是一种化学合成的人工,凝胶。,是实验室用来作凝胶电泳的材料。亦有人使用作隆胸整型手术用途，好处是无需开刀，可以直接注射入乳房，从而达致隆胸的效果,。,有香港妇女在上海做完手术之后引致乳房发炎含脓，而需要把一边乳房切除。另外，在香港亦有整型医生指出有求诊者在不合法的美容院做过手术后，由于注射位置出错，使凝胶沿着淋巴腺或血管游走至胸腔或身体其他地方。,二,.,凝胶层析的介质及,选择,聚丙烯酰胺凝胶指的是由丙烯酰胺单体，以次甲基双丙烯酰胺为交联剂，经四甲基乙二胺催化、通过游离基引发,(,光引发、化学引发等,),聚合而成的交联聚丙烯酰胺。它是一种化学合成的人工,凝胶。,是实验室用来作凝胶电泳的材料。亦有人使用作隆胸整型手术用途，好处是无需开刀，可以直接注射入乳房，从而达致隆胸的效果,。,有香港妇女在上海做完手术之后引致乳房发炎含脓，而需要把一边乳房切除。另外，在香港亦有整型医生指出有求诊者在不合法的美容院做过手术后，由于注射位置出错，使凝胶沿着淋巴腺或血管游走至胸腔或身体其他地方。,二,.,凝胶层析的介质及,选择,聚丙烯酰胺简称,PAM,、结构式为,CH2,CH(CONH2,）,n,，分子量,100,500,万。聚丙烯酰胺主要有两种商品形式，一种是粉末状的，另一种是胶体，还有聚丙烯酰胺乳液,(,上海合成树脂研究所研制）。易溶于冷水，速度很慢，高分子量的聚丙烯酰胺当浓度超过,10%,以后就会形成凝胶状结构。提高温度可以稍微促进溶解，但温度不得超过,50,，以防发生分子降解。难溶于有机溶剂。温度超过,120,时分解，中性，无毒。,二,.,凝胶层析的介质及,选择,1,）絮凝作用原理：,PAM,用于絮凝时，与被絮凝物种类表面性质，特别是动电位，粘度、浊度及悬浮液的,PH,值有关，颗粒表面的动电位，是颗粒阻聚的原因加入表面电荷相反的,PAM,，能使动电位降低而凝聚。,2,）吸附架桥：,PAM,分子链固定在不同的颗粒表面上，各颗粒之间形成聚合物的桥，使颗粒形成聚集体而沉降。,3,）表面吸附：,PAM,分子上的极性基团颗粒的各种吸附。,4,）增强作用：,PAM,分子链与分散相通过种种机械、物理、化学等作用，将分散相牵连在一起，形成网状。,二,.,凝胶层析的介质及,选择,二,.,凝胶层析的介质及,选择,选择依据,分离范围,分辨率,稳定性,三,.,影响凝胶层析效果的,因素,凝胶的选择,洗脱液流速,离子强度,PH,上样量,上柱的选用,三,.,影响凝胶层析效果的,因素,溶胀,温度,平衡,气泡,过夜,三,.,影响凝胶层析效果的,因素,加样,上柱,狭窄平直,三,.,影响凝胶层析效果的,因素,