课题2-土壤中分解尿素的细菌的分离与计数-(4).ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,课题,2,土壤中分解尿素的细菌的,分离与计数,思考,?,1,、通过什么方法可以将土壤中分解尿,素的细菌分离出来？,2,、可以用什么方法对分解尿素的细菌进行计数？,一、土壤中分解尿素的细菌的分离方法,1,、从自然环境中筛选细菌的原理：,根据它对生存环境的需求，从相应环境筛选,2,、实验室筛选,用选择培养基筛选,原理：,改变培养基成分或条件，利于目的菌株的生长，抑制其他微生物生长,一、土壤中分解尿素的细菌的分离方法,3,、筛选方法,分解石油的细菌：,耐盐细菌：,抗青霉素细菌：,自养微生物：,石油为唯一碳源 培养基,高浓度食盐 培养基,加青霉素 培养基,无碳源培养基,尿素为唯一氮源,的选择培养基,4,、其它举例,二、细菌的计数方法,活菌计数法,1,、显微镜直接计数法：,显微镜、血球记数板,2,、稀释涂布平板法：,间接记数法；菌落数代表细菌数,在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的,一个菌落,是由,一个细菌繁殖,而成的，即,一个菌落,代表原先的,一个细菌,。,每克（,ml,）样品中的菌落数,(CV)M,其中，,C,代表某一稀释度下平板上生长的,平均菌落数,，,V,代表涂布平板时所用的,稀释液的体积,(ml),，,M,代表稀释倍数。,计算方法：,原理：,为了保证结果准确，一般选择,菌落数,在,30300,的平板,上进行计数。,为使结果接近真实值可将,同一稀释度加到三个或三个以上的平板,中，经涂布，培养计算出,菌落平均数，至少,2,个平板菌落数相近,。,统计的,菌落,往往比,活菌,的,实际数目低,。,2,个或多个活菌形成一个菌落,三、如何设置对照？,1,、排除土壤不同：,其他同学用同样的土壤进行实验对照,2,、排除杂菌污染：,未接种土壤菌悬液的相同培养基（空白对照）,3,、排除混入其他氮源：,接种土壤菌悬液蛋白胨牛肉膏（其他氮源）培养基,三、如何设置对照？,基本（完全、通用）培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）接种后培养观察菌落数目。菌落数明显多于选择培养基。,思考,1,判断选择培养基是否具有筛选作用对照组应如何设置？,实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，,A,同学从对应的,10,6,倍稀释的培养基中筛选出大约,150,个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约,50,个菌落。分析其原因。,原因：土样不同，培养基污染,(3),培养基,混入了其他的含氮物质,),四、操作步骤,1,、土壤取样,2,、样品稀释,3,、涂布平板,4,、培养与观察,5,、菌落计数,四,、操作步骤,多数,细菌适宜在酸度接近,中性,的,潮湿,土壤中生长,有利于,筛选,细菌。,铲去土壤表层目的,:,从,肥沃、湿润,的土壤,(,天然培养基）中取样。先铲去表层土,3-8cm,左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,1,、土壤取样,2,、样品稀释,四,、操作步骤,土壤菌悬液进行,梯度稀释,；通常,选用一定稀释范围,的样品进行培养，以保证获得菌落数在,30,300,之间、适于计数的平板。,应在,火焰旁,称取土壤,10g,。,用,无菌水,稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在,火焰旁,进行,分离,不同的微生物,采用,不同的稀释度,3,、涂布平板,从稀释倍数为,10,4,10,6,稀释液中依次取样，每次吸取,0.1 mL,进行平板涂布操作，每种稀释液至少涂布,3,个平板（选择培养基）。,四,、操作步骤,实验时要对,培养皿作好标记,。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,如果得到了,2,个或,2,个以上,菌落数目在,30300,的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果,同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确,，需要重新实验。,4,、微生物的培养与观察,细菌：,放线菌：,霉菌：,培养温度及时间,观察,四,、操作步骤,在一定的培养条件下,同种微生物表现出稳定的相同的,菌落特征,，不同的微生物菌落特征不同。,30,37,0,C,的温度下培养,1,2d,25,28,0,C,的温度下培养,5,7d,25,28,0,C,的温度下培养,3,4d,思考：分离和计数的平板相同吗？,相同,1,、,结合对照，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。,2,、,是否获得了某一稀释度下，菌落数目在,30,300,的平板。在这稀释度下，是否至少有两个平板的菌落数相近？,3,、,你统计的每克土壤中含有能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？,五、,六、菌种的鉴定,方法：,以,尿素为唯一氮源,的培养基中加入,酚红指示剂,;,原理：,纤维素分解细菌能产生的脲酶使尿素分解为氨，,pH,升高，指示剂将变红,。,脲酶检测法,大肠杆菌,黑色,菌落,有金属光泽,大肠杆菌在,伊红,美蓝培养基,上典型特征,大肠杆菌鉴定？,计数还可用滤膜法,例,2,能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是,(),A.CO,2,和,N,2,B.,葡萄糖和,NH,3,C.CO,2,和尿素,D.,葡萄糖和尿素,D,C,例,3,用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是,(,),A.,未接种的选择培养基,B.,未接种的牛肉膏蛋白胨培养基,C.,接种了的牛肉膏蛋白胨培养基,D.,接种了的选择培养基,例,4,为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）,A.,较多的氮源物质,B.,较多的碳源物质,C.,青霉素类药物,D.,高浓度食盐,C,例,5,分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是,(,),加尿素不加尿素加琼脂不加琼脂加葡萄糖不加葡萄糖加硝酸盐不加硝酸盐,A.,B.,C.,D.,C,