第十讲赖氨酸的生产工艺.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第十讲赖氨酸的生产工艺,第一页，共67页。,1.赖氨酸概述(i sh)(2),赖氨酸广泛存在于动物(dngw)蛋白质中，赖氨酸的生产最早是用酸水解酪素，经分离谷氨酸后制得，其后又从血粉中提取（猪血粉中赖氨酸含量约9%10%），但这种方法，工艺比较复杂，产量受到限制。,第二页，共67页。,1.赖氨酸概述(i sh)(3),1960年以来，用营养(yngyng)缺陷型的谷氨酸菌株直接发酵生产赖氨酸，其产量不断扩大。,1977年，东丽公司以合成的己内酰胺为原料，用酶法生产L-赖氨酸。,第三页，共67页。,1.赖氨酸概述(i sh)(4),目前，国际(guj)上赖氨酸产生菌种的生产水平一般为1214 g/L，对糖的转化率为45%。采用淀粉水解糖（或纯糖）发酵，其产酸率、提取率较高；而采用糖蜜发酵，其产酸率、提取率要低一些。,第四页，共67页。,1.赖氨酸概述(i sh)(5),采用淀粉水解糖(或纯糖)发酵(f jio)，其产酸率为9%11%，提取率为83%87%，原料消耗3.23.5t(淀粉)/t(赖氨酸)；,第五页，共67页。,而采用糖蜜(含糖50%)发酵，其产酸率7%9%，提取率80%85%，原料消耗68t/t。我国广西赖氨酸厂，采用甘蔗(gn zhe)糖蜜发酵，菌种产酸率8.2%，提取率82.4%，接近国际先进水平。,第六页，共67页。,2.赖氨酸的性质(xngzh)(1),赖氨酸盐酸盐的化学式为C6H14O2N2HCl，含氮量为15.34%，相对分子质量182.65。,由于游离的赖氨酸易吸收空气中的二氧化碳，故制取结晶比较(bjio)困难。一般商品都是赖氨酸盐酸盐的形式。,第七页，共67页。,2.赖氨酸的性质(xngzh)(2),赖氨酸的化学名为2,6-二氨基(nj)己酸，具有不对称的-碳原子，故有两种光学活性的异构体（L/D型）。,第八页，共67页。,2.赖氨酸的性质(xngzh)(3),赖氨酸盐酸盐熔点(rngdin)为263，单斜晶系，比旋光度+21。,在水中的溶解度为0时53.6g/100mL，25时为89g/100mL，50时为111.5 g/100 mL，70时为142.8 g/100 mL。,在酒精中的溶解度为0.1g/100mL。,第九页，共67页。,2.赖氨酸的性质(xngzh)(4),赖氨酸含有-氨基及-氨基，只有在-氨基为游离(yul)状态时，才能被动物机体所利用，故具有游离(yul)-氨基的赖氨酸被称为有效赖氨酸。故在提取浓缩中，要特别注意防止有效赖氨酸受热破坏而影响其使用价值。,第十页，共67页。,3.赖氨酸生物合成(hchng)途径,赖氨酸的生物合成途径与其他氨基酸不同，依微生物的种类而异。,细菌(xjn)的赖氨酸生物合成途径需要经过二氨基庚二酸（DAP）合成赖氨酸；,第十一页，共67页。,3.赖氨酸生物(shngw)合成途径(续）,酵母、霉菌的赖氨酸生物合成途径，需要经过(jnggu)-氨基己二酸合成赖氨酸。,同样是二氨基庚二酸合成赖氨酸途径，不同的细菌，赖氨酸的生物合成途径的调节机制有所不同。,第十二页，共67页。,4 赖氨酸的生产(shngchn)发酵,赖氨酸的发酵生产有直接（一步）发酵和两步发酵。,赖氨酸的直接发酵法可使用黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖(r tn)发酵短杆菌、诺卡杆菌等，碳源可为葡萄糖、醋酸、乙醇和石蜡。其转化率和产酸率也有所不同。,第十三页，共67页。,直接(zhji)发酵法工艺流程,第十四页，共67页。,赖氨酸的两步发酵法,先使用大肠杆菌的赖氨酸缺陷型菌株，因缺少二氨基庚二酸脱羧酶，不能生成赖氨酸，于是积累大量的二氨基庚二酸（DAP）。,然后再选用含有(hn yu)二氨基庚二酸脱羧酶的产气杆菌或大肠杆菌，进行酶法脱羧而生成L-赖氨酸。,第十五页，共67页。,4.1 L-赖氨酸生产(shngchn)菌种及扩大培养,直接(zhji)发酵法生产赖氨酸工艺生产菌种：,中科院北京微生物研究所选育的北京棒杆菌AS1.563和钝齿棒杆菌PI-3-2(AECr、Hse-)；AEC赖氨酸类似物S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸;Hse天冬氨酰半醛脱氢酶,黑龙江轻工研究所选育的241134及179等。,第十六页，共67页。,L-赖氨酸生产(shngchn)菌种（续）,这些菌种产酸水平一般(ybn)为78g/L,转化率25%35%，对我国赖氨酸的生产起了较大的作用。但产酸率和转化率均较低，与国外先进水平相比还有较大差距。,第十七页，共67页。,种子扩大(kud)培养,赖氨酸发酵一般根据接种量及发酵罐规模采用二级或三级种子(zhng zi)培养。,3/(m3 min)，搅拌转速200r/min。培养时间 811h。,根据发酵规模，必要时可采用三级培养。,第十八页，共67页。,4.2 赖氨酸发酵工艺(gngy)及控制要点,（1）发酵(f jio)工艺流程,第十九页，共67页。,赖氨酸发酵工艺(gngy)及控制要点(2),（2）发酵培养基组成(z chn),不同菌株，发酵培养基的组成(z chn)不完全相同，赖氨酸发酵培养基的组成(z chn)见有关文献。,第二十页，共67页。,赖氨酸发酵工艺及控制(kngzh)要点(3),（3）发酵工艺条件及影响因素,温度(wnd)、pH值控制、种龄和接种量、供氧对赖氨酸发酵的影响、生物素对赖氨酸生物合成的影响、硫酸铵对赖氨酸发酵的影响。,第二十一页，共67页。,如果洗脱(x tu)剂浓度太低，洗脱(x tu)时间长，收集不集中，赖氨酸浓度低。,5 赖氨酸的精制(jngzh),生物(shngw)素对赖氨酸生物(shngw)合成的影响（续）,5 赖氨酸的精制(jngzh),将赖氨酸盐酸盐粗结晶(jijng)加一定量的水，加热70 80使其溶解成16B浓度，加入3%5%活性炭，搅拌脱色，过滤得赖氨酸盐酸盐清液。,浓缩(nn su)与除氨(2),0被弱酸性阳离子交换树脂吸附。,第二十二页，共67页。,一般比上柱流速慢些，多用6 L/min的速度洗脱，可根据柱的大小而异。,上柱吸附(xf)上柱流速,1 赖氨酸发酵液的主要(zhyo)性质,L-赖氨酸生产(shngchn)菌种（续）,第三十七页，共67页。,赖氨酸的提取(tq)(4),另一方面，过量生物素使细胞内合成的谷氨酸对谷氨酸脱氢酶起反馈(fnku)抑制作用，抑制谷氨酸的大量合成，使代谢流转向合成天冬氨酸的方向进行。,由于游离的赖氨酸易吸收空气中的二氧化碳，故制取结晶比较(bjio)困难。,赖氨酸发酵工艺及控制(kngzh)要点(4),温度：,幼龄菌对温度敏感，在发酵前期(qinq)，提高温度，生长代谢加快，产酸期提前，但菌体的酶容易失活，菌体衰老，赖氨酸产量少。赖氨酸发酵，前期(qinq)控制温度32，中后期30。,第二十二页，共67页。,赖氨酸发酵工艺及控制(kngzh)要点(5),pH值控制(kngzh),赖氨酸发酵最适pH 值为6.57.0。控制(kngzh)范围在pH=6.57.5,在整个发酵过程中，应尽量保持 pH值平稳。,第二十三页，共67页。,赖氨酸发酵(f jio)工艺及控制要点(6),种龄和接种量 一般在采用二级种子扩大培养时，接种量较少，约2%，种龄一般为812h，当采用三及种子扩大培养时，种量较大约10%，种龄一般为68h。总之(zngzh)，以对数生长期的种子为好。,第二十四页，共67页。,赖氨酸发酵工艺(gngy)及控制要点(7),供氧对赖氨酸发酵的影响 赖氨酸是天冬氨酸族氨基酸，它的最大生成量是在供氧充足(chngz)，细菌呼吸充足(chngz)条件下实现的。供氧不足，细菌呼吸受抑制，赖氨酸产量降低，供氧不足只是轻微影响赖氨酸生成。严重供氧不足时，产赖氨酸量很少而积累乳酸。,第二十五页，共67页。,赖氨酸发酵工艺(gngy)及控制要点(8),生物素对赖氨酸生物合成的影响 在以葡萄糖，丙酮酸为唯一碳源的情况(qngkung)下，添加过量生物素（200500g/L），赖氨酸积累量显著增加。因为生物素量增加，促进了草酰乙酸的合成，增加了天冬氨酸供给。,第二十六页，共67页。,生物(shngw)素对赖氨酸生物(shngw)合成的影响（续）,另一方面，过量生物素使细胞内合成的谷氨酸对谷氨酸脱氢酶起反馈(fnku)抑制作用，抑制谷氨酸的大量合成，使代谢流转向合成天冬氨酸的方向进行。,第二十七页，共67页。,赖氨酸发酵(f jio)工艺及控制要点(9),硫酸铵对赖氨酸发酵的影响 硫酸铵对赖氨酸发酵影响很大。当硫酸铵含量大时菌体生长迅速，使赖氨酸产量低。但在无其他铵离子(lz)情况下，用量为4.0%4.5%时赖氨酸产量最高。,第二十八页，共67页。,6.赖氨酸的提取(tq)和精制,赖氨酸的提炼过程(guchng)包括：,发酵液预处理,提取,精制,第二十九页，共67页。,6.1 赖氨酸发酵液的主要(zhyo)性质,赖氨酸发酵液由于(yuy)所用的原料、培养基组成及浓度、菌种和发酵工艺不同，其组成也不同，一般由以下四部分组成：,氨基酸、菌体、培养基残留物、,第三十页，共67页。,（1）氨基酸,氨基酸,代谢主产物赖氨酸，含量(hnling)为78g/L；少量其他氨基酸，如缬氨酸，丙氨酸和甘氨酸，当发酵不正常时含有谷氨酸；少量有机酸，特别是发酵工艺控制不好时，含有乳酸。,第三十一页，共67页。,（2）菌体,菌体,一般(ybn)含量在1520g（干重）/L。,第三十二页，共67页。,（3）培养基残留物,培养基残留物,如残糖620g/L(随原料不同而异)，无机离子（如NH4+、Ca2+、Mg2+、K+和一些(yxi)阴离子，其中NH4+浓度较高）。,第三十三页，共67页。,（4）色素(s s),色素,发酵液中的这些杂质对赖氨酸的提取和精制影响(yngxing)很大，特别是菌体和钙离子等，应尽量除去。,第三十四页，共67页。,6.2 发酵液的预处理,发酵液的预处理，包括除菌体和影响提取收率的杂质离子。去除菌体的方法有离心分离法和添加(tin ji)絮凝剂沉淀两种方法。,第三十五页，共67页。,离心分离法,采用高速离心机分离除去，如菌体体积(tj)小时需反复分离，成本高。,添加絮凝剂沉淀法是先将发酵液调节到一定的pH值，加适宜絮凝剂如聚丙烯酰胺，使菌体絮凝而沉淀，加助滤剂过滤出去。,第三十六页，共67页。,发酵液的预处理(3),钙离子一般通过(tnggu)添加草酸或硫酸，成钙盐沉淀而除去。经验证明，发酵液经过预处理后，提取收率明显提高。,第三十七页，共67页。,6.3 赖氨酸的提取(tq),从发酵液中提取赖氨酸通常有四种方法：,a.沉淀法，利用(lyng)赖氨酸生成难溶性盐而沉淀分离，或使赖氨酸结晶析出；,b.有机溶剂萃取法；,c.离子交换法；,d.电渗析法。,第三十八页，共67页。,赖氨酸的提取(tq)(2),工业生产主要采用离子交换法提取赖氨酸，该法回收率高，产品(chnpn)纯度高。,赖氨酸是碱性氨基酸，等电点(pI)为9.59。在pH=2.0左右能最大程度地被强酸性阳离子交换树脂吸附。pH=7.09.0被弱酸性阳离子交换树脂吸附。,第三十九页，共67页。,赖氨酸的提取(tq)(3),强酸性阳离子交换树脂(shzh)和弱酸性阳离子交换树脂(shzh)对纯赖氨酸溶液和发酵液中赖氨酸的吸附量是不同的。,第四十页，共67页。,赖氨酸的提取(tq)(4),弱酸性阳离子交换(jiohun)树脂对纯赖氨酸的吸附能力大，但对发酵液中的赖氨酸吸附能力大为降低，这是因为发酵液中除赖氨酸外还有相当多杂质影响所致。因此，从发酵液中提取赖氨酸常选用强酸性阳离子交换(jiohun)树脂。,第四十一页，共67页。,赖氨酸的提取(tq)(5),强酸性阳离子交换树脂的氢型对赖氨酸的吸附(xf)比铵型容易得多。但是铵型强酸性阳离子交换树脂能选择性地吸附(xf)赖氨酸和其他碱性氨基酸，不吸附(xf)中性和酸性氨基酸，故容易与其他氨基酸分离。,第四十二页，共67页。,赖氨酸的提取(tq)(6),另外，选用铵型树脂，可以简化树脂的转型操作，如在用氨水洗脱赖氨酸的同时，树脂已转成铵型，不必再生。所以从发酵液中提取(tq)赖氨酸均选用铵型强酸性阳离子交换树脂。,第四十三页，共67页。,赖氨酸提取(tq)精制工艺流程,第四十四页，共67页。,6.4 离子交换(l z jio hun)法提取赖氨酸,离子交换法提取赖氨酸可用三柱串联(chunlin)的方式，以提高收率。,上柱吸附：上柱方式、交换量、上柱流速,洗脱剂（氨水洗脱、氨水+氯化铵洗脱、氢氧化钠洗脱）,第四十五页，共67页。,上柱吸附(xf)上柱方式,上柱方式 上柱方式有正上柱和反上柱两种。如果发酵液含菌体等固形物较多，流速(li s)较快时，容易造成树脂层堵塞，这是采用反上柱较好。,第四十六页，共67页。,上柱吸附(xf)交换量,交换量 正向上柱时，一般为每吨树脂可吸附90100kg赖氨酸盐酸盐，反向上柱可吸附7080kg赖氨酸盐酸盐。流出液pH=5时表明(biomng)吸附达饱和。,第四十七页，共67页。,上柱吸附(xf)上柱流速,上柱流速 上柱流速应根据上柱液性质、树脂的性质、柱大小及上柱方式等具体情况决定。应在小柱中进行试验确定适合的上柱流速。一般正向上柱速度大些，可以(ky)10L/min的流速吸附；反上柱流速小些。,第四十八页，共67页。,洗涤(xd),上柱后，需用水洗去停留在树脂的菌体、残糖等杂质，直至洗涤水清亮(qngling)，同时使树脂疏松以利洗涤。,第四十九页，共67页。,洗脱(x tu)剂,（1）氨水洗脱 优点是洗脱液经浓缩除氨后，含杂质较小，有利于后工序精制；缺点是树脂吸附(xf)的阳离子，如Ca2+、Mg2+等不易洗脱。,第五十页，共67页。,洗脱(x tu)剂（续）,残留在树脂中，随着(su zhe)操作次数的增加而积累，造成树脂吸附氨基酸能力下降。因此在树脂使用一段时间后需要用酸或食盐溶液进行再生处理。,第五十一页，共67页。,洗脱(x tu)剂(2),（2）氨水+氯化铵洗脱 特点是可以洗脱树脂吸附的Ca2+等阳离子，提高树脂的交换容量，由于在碱性条件下赖氨酸先被洗脱，然后才有Ca2+等离子被洗脱，采取分段收集不会导致(dozh)赖氨酸收集液中Ca2+含量增加。,第五十二页，共67页。,氨水(n shu)+氯化铵洗脱,通过调节氨水与氯化铵的物质的量之比为1:1，可直接(zhji)使赖氨酸成单盐酸盐形式存在，不需在中和。,第五十三页，共67页。,洗脱(x tu)剂(3),（3）氢氧化钠洗脱 特点是没有氨味，容易操作，但在洗脱液中Na+含量较高，影响(yngxing)赖氨酸的提纯精制。,第五十四页，共67页。,洗脱(x tu)剂(4),洗脱(x tu)剂的浓度对洗脱(x tu)效果有影响。一般来讲，为了分离只能用适当浓度的洗脱(x tu)剂。如果洗脱(x tu)剂浓度太高，达不到洗脱(x tu)目的。如果洗脱(x tu)剂浓度太低，洗脱(x tu)时间长，收集不集中，赖氨酸浓度低。,第五十五页，共67页。,洗脱(x tu)剂(5),使用氨水洗脱时，一般浓度为3.6%5.4%。如果用5的氨水洗脱，收集液赖氨酸平均(pngjn)浓度可达6%8%，洗脱高峰段，赖氨酸盐酸盐含量和达15%16%。,第五十六页，共67页。,洗脱(x tu)剂(6),洗脱操作及洗脱液收集，采用单柱顺流洗脱，为了使洗脱集中，赖氨酸浓度高，应控制(kngzh)好洗脱液流速。一般比上柱流速慢些，多用6 L/min的速度洗脱，可根据柱的大小而异。,第五十七页，共67页。,洗脱(x tu)剂(7),用茚三酮检查流出液，当有赖氨酸流出时即可收集。一般(ybn)为pH=9.512，前后流分赖氨酸浓度低而铵含量高，可合并于洗脱用氨水中，以提高收得率。一般(ybn)收得率可达90%95%。,第五十八页，共67页。,6.5 赖氨酸的精制(jngzh),浓缩与除氨,赖氨酸盐酸盐的结晶(jijng)与分离,赖氨酸盐酸盐的重结晶(jijng)与干燥,第五十九页，共67页。,浓缩(nn su)与除氨,经过离子交换提取的赖氨酸洗脱液，体积较大，赖氨酸含量较低（约为6080g/L），还含有较多的氨（约为1015g/L），因此需要进行浓缩(nn su)和除氨。为了收集蒸发出来的氨蒸气，可采用单效蒸发。,第六十页，共67页。,浓缩(nn su)与除氨(2),浓缩液浓缩至19 20B（赖氨酸盐酸盐含量约为340 360g/L）放出料液，用浓盐酸调节pH=4.9，再继续浓缩至22 23B。在碱性溶液中浓缩时，温度(wnd)不宜过高，时间不宜过长，否则会生成DL-赖氨酸。,第六十一页，共67页。,波美度与密度(md)换算,第六十二页，共67页。,赖氨酸盐酸盐的结晶(jijng)与分离,赖氨酸盐酸盐浓缩液放入搅拌(jiobn)罐中，搅拌(jiobn)结晶16 20h，为了使晶体不太细，结晶过程应控制温度，最好在5左右结晶完毕停止搅拌(jiobn)，用离心机分离。,第六十三页，共67页。,赖氨酸盐酸盐的结晶(jijng)与分离（续）,用少量水洗晶体表面附着的母液，母液经浓缩，结晶，再结晶，直至不能析出结晶时，将母液稀释，上离子交换柱吸附回收(hushu)赖氨酸。所得的晶体为赖氨酸盐酸盐粗晶体。,第六十四页，共67页。,赖氨酸盐酸盐的重结晶与干燥(gnzo),结晶(jijng)析出的赖氨酸盐酸盐粗晶体含量约为78%84%，除含有一定水分（15%20%）外，还含有色素等杂质，制造食品级和医药级赖氨酸盐酸盐需要进一步精制纯化。,第六十五页，共67页。,赖氨酸盐酸盐的重结晶与干燥(gnzo)(2),将赖氨酸盐酸盐粗结晶(jijng)加一定量的水，加热70 80使其溶解成16B浓度，加入3%5%活性炭，搅拌脱色，过滤得赖氨酸盐酸盐清液。,第六十六页，共67页。,赖氨酸盐酸盐的重结晶与干燥(gnzo)(3),将其清液在0.8MPa真空度，70以下，真空蒸发至21 22 B，放入结晶罐中搅拌结晶，16 20h后经离心分离除去(ch q)母液，晶体用少量水洗去表面附着的母液。,第六十七页，共67页。,