原核生物的转录及调控.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,原核生物的转录及其调控,RNA transcription,and regulation in prokaryotes,转录：,在,DNA,指导的,RNA,聚合酶催化下，以,DNA,链的一条链为模板，按照碱基配对原则合成,RNA,链的过程,。,不对称转录,：在,DNA,双链分子中，转录通常只在,DNA,的一条链上进行，另一条链则不能转录，但可能对转录起调节作用，这种转录方式称不对称转录。,转录单位,：就是从启动子到终止子的一段,DNA,序列。,第一节 转录概述,一、基因的编码链和有意义链,模板链：,用于转录,RNA,的链称为模板链，或负（）链，又称无义链。,编码链,：与模板链互补的,DNA,链称为编码链，或正（）链，又称有义链。,二、转录的基本要点,底物：,NTP；,模板：反义链；,方向：53；,酶：,RNA,pol；,产物：,RNA,单链,转录和复制：,都是遗传信息的传递,三、转录起始位点,转录起点位点核苷酸为1。,上游序列,upstream,：转录起点的前面的序列,，,用负数码（）表示，,起点前一个核苷酸为1。,下游序列,downstream：,转录起点的后面的序列,，,用正数码（）表示。,没有编号为的碱基。,第二节 原核生物转录的相关酶类,一、,E.coli RNA,聚合酶,E.coli,只有一种聚合酶；,E.coli,RNA pol,全酶,由5种亚基组成，即,2,，,480,kD；,2,构成核心酶,，,核心酶与,因子构成全酶,。,E.coli RNA,聚合酶的基本性质,RNA polymerase,in prok.,Core Enzyme,Holo Enzyme,for elongation,for initiation,依靠静电作用力,依靠空间结构,非专一性与非特异,DNA,结合,专一性与,特异,DNA,结合,半衰期；,60,半衰期；数小时,cover60bp,Richard Burgess and Andrew Travers(1969),150,kD,160,kD,70,kD,40,kD,Cartoon illustrating separation of the subunits of E.coli RNA polymerase by SDS-PAGE,1、核心酶：催化磷酸二酯键的形成,亚基,：2个，功能多样（核心酶的组建因子、促进双链的解开和重新聚合、启动子识别、促进,RNA pol,与,DNA,模板链上游转录因子结合）,亚基,：1个，结合核苷酸底物，催化磷酸二酯键的形成；,亚基,：碱性强，与模板链结合；,二、,RNA,聚合酶各亚基的功能,2、,因子,：,Reusable；,修饰,RNA pol,的构型；,识别启动子，但无催化活性。,不同原核生物具有,基本相同的核心酶,，但,亚基有所差别,，决定了原核生物基因的选择性表达。,3、原核生物,RNA,聚合酶抑制剂,：,利福平（,Rifampin,）,：与细菌,RNA pol,亚基结合，阻碍转录的,起始,作用；,利链菌素,（,streptolydigin）,：,与细菌,RNA pol,亚基结合，抑制转录的,延伸,。,肝素,：与细菌,RNA pol,亚基结合，阻碍其与,模板,DNA,的结合,。,第三节 原核生物转录的过程,RNA,的转录包括,promotion，elongation，termination,三过程；,从,promoter,到,terminator,称为,transcriptional unit,；,原核生物中的转录单位多为,polycistron,；,转录起始点记为,+1,，其上游记为,负值,，下游记为,正值,。,+1,-10,+10,upstream,start point,downstream,一、转录的起始,关键：全酶能以,很高的亲和性,结合在,启动子,promoter,；,启动子,：RNA,聚合酶识别、结合并起始转录的一段,DNA,序列。,promoter,由两个重要部分组成,（一）原核启动子的结构,-70 -40：,up element（,上游元件）,CAP-cAMP binding site,-35 -10：,core promoter（,核心启动子）,RNA pol.binding site,基因表达调控的正控制位点,CAP：,Catabolite gene Activator Protein,cAMP Acceptor Protein,（,cAMP,受体蛋白,）,（,分解代谢基因激活蛋白,）,1、,核心启动子：,Sextama Box：,（,R,site）,TTGAC（Sextama Box）,-35,site。RNA pol.loosely binding site,Pribnow Box：,TATAAT（pribnow Box）,-10,site。RNA pol.firmly binding site（,B,site）,Initiation site：,+1,site。,RNA transcriptional startpoint（,I,site）,A/G,-35,(,R),-10,(,B),+1,(,I),RNA,l,Sextama Box,与,Pribnow Box,间距,17,bp,，,有利于,RNA pol,启动,l,-35 Box,or,-10 Box,mut.,间距,趋近,于17,bp，,up,mutation,间距,远离,于17,bp，,down,mutation,17,bp,的,间距,比17,bp,的,序列,对转录更为重要,-35 Box,and,-10 Box,mut,.,转录效率下降,100倍,转录效率下降,1000倍,2、,上游元件：,CAP-cAMP binding site（Activator region，AR）,当：,ARI+,CAP-cAMP,AR I：,CAP-cAMP,的强结合位点（-70 -50）,AR II：,CAP-cAMP,的弱结合位点（-50 -40）,cooperative effect,提高,ARII,的结合效率,IR,-70,ARI,-40,ARII,IR,-50,RNA pol,AR II+CAP-cAMP,复合体：,促使,-35,box,附近,GC,岛区的双螺旋结构稳定性降低，,-10,box,的解链温度降低，有利于转录启动,ARI ARII GC Island -35 -10,Null AR II,RNA pol.into-10 Box,but,transcription off,ARII+,CAP-cAMP,promotion,RNA pol.into,-35 Box,into,-10 Box,starting transcription,RNA pol,RNA pol,-CTD,CAP-cAMP,ARI ARII,ARI ARII,Activation transcription,Up element+CAP-cAMP,RNA Polymerase,复合体,CAP-cAMP,与,RNA Polymerase,的,-CTD,结合，激活转录,（二）,原核基因转录的起始,1、,因子的作用：,降低,全酶与一般,DNA,的,非专一性,结合力（20000倍,）；,增强,全酶与启动子,R site、B site,的,专一性,结合力（100倍,）；,导致,RNA,链的延伸缓慢,Promoter,与,factor,间的结合专效性,决定了,strong promoter&weak promoter；,-35,box,-10,box,的差异影响启动子与,RNA pol,中,因子的,结合能力,；,不同启动子的-35，-10,box,间存在较为,保守的标准序列（标准启动子）,；,factor is responsible for recognition of,consensus sequence,of promoter and only required for initiation.,2、,RNA,pol,与启动子的结合,因子识别启动子上结合位点。,RNA pol,全酶与-35,box,结合,封闭型启动复合物,；,酶向-10,box,移动，并与之牢固结合，促使-10,box,及起始位点处发生局部解链,开放型启动复合物,；,DNA,解螺旋扩展到-10,box,下游17,bp,范围。,3、转录起始位点的决定,酶与-10,box,的结合，决定了第一个起始碱基的选择。,第一个被转录的碱基离,-10,box,的保守,T,约69,nts。,mRNA,的起始位点多为,G，,其次为,A,，,很少为,U,起始点核苷酸的两侧分别为,C,和,T。,4、三元复合物的形成和,因子的解离,RNA,合成一开始，就形成,模板-,RNA,pol-RNA,的,三元复合物,。,因子解离，核心酶与模板的亲和性下降到非特异性结合的水平，,RNA,pol,在,DNA,链上变得容易移动，为链的延伸创造了条件；,游离的,因子可以重新进行功能循环。,转录的起始,核心酶在,因子帮助下特异性结合到,DNA,上；,RNA,pol,与启动子-35,box,结合，形成,封闭型起始复合物,；,酶滑动到-10,box，,转变成为,开放型起始复合物,，启动子活化，双链解开，模板链暴露，插入最初的2个核苷酸；,酶继续加上开头的几个,NTP，,形成,三元起始复合物,，在,RNA,链合成了89个碱基后，,因子解离，转录开始。,Model of the interaction between E.coil RNA polymerase holoenzyme and a promoter,DNA,Incorporating the,first few Nt,二、原核生物转录的延伸,RNA,pol,沿着模板链移动，,RNA,链不断延伸，并保持三元复合物的结构；,转录泡中的,DNA,螺旋前开、后合，,RNA,延长，不断脱离,DNA；,RNA,链的延伸速度不是恒定的，在模板富含,GC,的区域，转录就会减慢/停顿。,17,bp,螺旋解开长度,12,bp,DNA-RNA,复合体长度,影响,RNA,延伸速度的因素：,RNA,pol,；,暂停信号,：导致转录速度突然出现变化的特殊序列。,GC,富集区,：产物,RNA,不易释放；,IR,：,产物形成茎环结构，妨碍上游的模板恢复双链。,其他配基：,ppNpp、NusA,蛋白。,NusA protein：,69,Kd,acid protein,RNApol-attaching factor,Impel RNApol.pausing in terminator for 1-15 and waiting for,Rho,factor to stop transcription of RNA,After initiation,substituting,NusA+core E,antitermination,N protein utilization substance,NusA binds to polymerase,and N binds to both NusA and,box B of the nut site region,of the transcript,creating a loop in the growing RNA.This complex is relatively weak and can cause antitermination only at terminators near the nut site(These conditions exist only in vitro.).,(,Nut N binding site,),antitermination N protein,三、,原核生物,转录,的终止,转录的终止依赖于,RNA,产物的特定序列；,原核和某些真核生物的终止子要求转录产物,RNA 3,端具有发夹的二级结构，茎部富有,GC,序列；,终止子的分类：根据终止反应是否需要,蛋白,1、不依赖于,因子的终止子（强终止子）,结构特点,：,RNA,具有一个发夹结构（富含,GC）,和随后,polyU,片段。,作用机制,：,RNA pol+,发夹结构 转录暂停 后随杂合分子不稳定的,poly(U-dA),RNA,容易从模板上脱落,RNA-DNA-RNA pol,解聚 转录终止,2、依赖于,因子的终止子（弱终止子）,因子,：55,kD,，六聚体。能够利用水解,ATP,释放的能量使,RNA,从三元复合物中释放出来；,结构,：仍然具有茎环结构，但,GC,碱基对含量较少，下游也缺乏,polyU,结构。,1、,2、,3、,终止类型,回文序列,后随序列,不依赖,因子的终止子,富含,GC,富含,U,依赖,因子的终止子,不富含,GC,不富含,U,第四节 原核生物转录的调控,基因表达的调控主要发生在转录水平；,转录水平上的调控是最为经济、灵活，又是最为重要、复杂的调控；,确定需要转录基因的起始位点；,精细调节基因表达的水平；,cis factor,与,trans factor,严格又灵活的互作；,保证,RNA pol,的连续转录，准确终止。,一、原核转录调控的相关概念,（一）诱导和阻遏,：,诱导：,酶的合成取决于特定物质（常为,substrate）,的存在。如培养基中乳糖的存在,促进,了,E.coli,的半乳糖苷酶的,合成,；,阻遏：,当培养基中某种物质（常为,product）,含量较高，细胞就关闭合成这种物质的能力。如培养基中,Trp,的存在,抑制,了,E.coli,Trp,的,合成,；,（二）调控的效应物,调节蛋白+,小分子物质,原核操纵子的诱导/阻遏。这些小分子是基因表达的调节物质-,效应物,。,诱导物,（,inducer）,：与调节蛋白结合，使其从,DNA,分子上脱落下来，,RNA pol,开始转录。,辅阻遏物,（,co-repressor）,：与调节蛋白结合，可以提高调节蛋白与操纵基因的亲和性，进而关闭结构基因的转录。,（三,）,正调控和负调控,正调控,：调节蛋白与操纵子结合后,促进,转录的进行。,负调控,：调节蛋白与操纵子结合后,抑制,转录的进行。,正、负调控都存在着诱导和阻遏。,positive,active,inactive,Ind.,Rep.,正调控+诱导,调节蛋白无活性转录不进行,诱导物+调节蛋白有活性调节蛋白转录进行,正调控,+,阻遏,调节蛋白有活性转录进行,辅阻遏物+调节蛋白无活性调节蛋白转录不进行,negative,active,inactive,阻遏蛋白有活性转录不进行,诱导物+阻遏蛋白无活性阻遏蛋白转录进行,负调控,+,诱导,负调控+阻遏,阻遏蛋白无活性转录进行,辅阻遏物+阻遏蛋白有活性调节蛋白转录不进行,Ind.,Rep.,Negative,二、操纵子理论（,operon concept）,定义,：原核生物基因表达和调控的单元。,包括,：,结构基因：编码控制某一代谢途径的相关的酶；,调控元件,：,是调节结构基因转录的一段,DNA,序列，包括启动子和操纵基因；,调节基因：其产物（调节蛋白）能够识别并结合操纵基因，决定结构基因的转录与否。,（,一）,lac,操纵子（,lactose operon）：,1、,lac,操纵子的结构,调节基因（,I,）：,编码阻遏物（,Repressor）。,启动子（,Promoter，P）：RNA,pol,的结合位点；,操纵基因（,Operator，O）：,进入结构基因的开关；,结构基因：,Z（-,半乳糖苷酶）,、Y（-,半乳糖苷透过酶,）,、,A（-,半乳糖苷乙酰基转移酶,）,；,-,半乳糖苷酶,：水解含,-,半乳糖苷键的底物，如乳糖。,-,半乳糖苷透过酶,：使外界的,-,半乳糖苷能透过,E.coli,细胞壁和原生质膜进入细胞内。,-,半乳糖苷乙酰基转移酶,：乙酰,CoA,+,-,半乳糖苷乙酰半乳糖。,当,E.coli,需要利用培养基里的乳糖时，前2种酶是必需的，而最后1种酶则是非必需的。,没有乳糖,lac,I,编码的阻遏蛋白具有活性牢固结合到操纵基因,O,上结合在启动区的,RNA pol,不能通过,Z、Y、A,不能转录（和表达）,2、,lac,操纵子的负向调控机制 负调控+诱导,加入乳糖,乳糖（诱导物）与阻遏蛋白结合阻遏蛋白构象变化 阻遏蛋白从操纵基因上脱落,RNA pol,开始,Z、Y、A,基因的转录表达乳糖被利用,3、,lac,操纵子,CAP,的转录激活作用 正调控,CAP,：二聚体，可同时与,DNA、cAMP,结合；,G,存在,细胞内,cAMP,CAP,二聚体不能单独与,DNA,结合,lac,操纵子关闭,G,缺乏,细胞内,cAMP,CAP,与,cAMP,结合,CAP-cAMP,复合物+,lac,操纵子启动子上游,DNA,链发生90,o,弯曲 增强,RNA pol,与启动子的结合,lac,操纵子打开,Z、Y、A,基因转录、表达,CAP,乳糖操纵子的协同调节(,coordinate regulation),负向调节与正性向调节协同合作,阻遏蛋白封闭转录时，,CAP,不发挥作用,如没有,CAP,加强转录，即使阻遏蛋白从,lacO,上,s,释放仍无转录活性,结论：,lac,操纵子强的诱导作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖,（二）,trp,操纵子,Trp,的合成：一系列酶促反应的结果（分支酸 邻氨基苯甲酸 吲哚甘油磷酸,Trp）,；,1、,trp,操纵子的阻遏系统转录起始的调节,有,Trp,：,Trp,结合并激活阻遏蛋白,，,阻断转录；,无,Trp,：阻遏蛋白无活性，操纵子基因开始转录。,2、,trp,操纵子的弱化系统转录提前终止的调节,（1）衰减子（,attenuator）：,定义：提前终止转录，调节基因表达的功能区域；,位置：结构基因上游前导区（,trpL）；,大小：162,Nts；,结构：茎环结构+,polyU，,是不依赖,因子的终止结构,衰减子结构,（2）前导肽,定义：,前导序列（,trpL,）可以产生一个含有14个,AA,的多肽，在翻译水平上调控前导区转录的终止。这个假设的多肽被称为前导肽。,证据：,前导肽编码区+,trpE,5端 融合蛋白质（具有与前导肽同样的,N,端序列）。,结构特点：,有相邻的2个,Trp,密码子（与其他具有衰减子的操纵子相似）,（3）转录衰减机制,依赖于转录和翻译的紧密偶联,Trp,少,tRNA,Trp,少翻译通过2个相邻,Trp,密码子的速度很慢当4区被转录完成时，核糖体才进行到1区前导区形成2-3配对（不能形成3-4配对的终止结构）转录继续进行；,Trp,多,tRNA,Trp,多核糖体顺利通过2个相邻的,Trp,密码子 4区被转录之前，核糖体就达到2区 3-4区配对形成富含,GC,的茎环结构转录停止,trp,操纵子中的结构基因被关闭，不再合成,Trp,3、衰减作用的重要性,衰减作用（10倍）与阻遏作用（70倍）协调作用能大大增强对,Trp,操纵子的调节作用（700倍）。,目前认为：当,Trp,高时，阻遏从有活性向无活性转变得比较慢，需要衰减作用来较快地作出反应，才能维持培养基中适当的,Trp,水平。,自然界中也存在着不同类型的合成体系，如,His,操纵子,，拥有在功能上与,trp,操纵子完全相同的衰减子（能够形成一个3个碱基配对的区域）。但,His,操纵子没有阻遏体系，完全受衰减子调节。,