药物含量测定方法验证.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章药物含量测定方法验证,优选第四章药物含量测定方法验证,第二节,定量分析样品的前处理方法,一、概述,1.为什么要对定量分析的样品进行前处理？,含卤素、氮、硫、磷等有机药物,R-X（F，Cl,Br,I,，,N）,金属有机药物,R-O-Me（,有机酸或酚的,含金属有机药物 金属盐；结合不牢固）,有机金属药物,R-Me,（,结合牢固）,2.常用的处理方法 不经有机破坏的分析方法,药物分析中常用的分析方法,经有机破坏的分析方法,（一）直接测定法,例如：富马酸亚铁,溶于热稀矿酸，采用铈量法，邻二氮菲作指示剂,二、不经有机破坏的分析方法,（二）经水解后测定法,1.直接回流后测定法 例如：三氯叔丁醇的含量测定,CCl,3,-C(CH,3,),2,-OH+4NaOH (CH,3,),2,CO+3NaCl+HCOONa+2H,2,O,NaCl +AgNO,3,AgCl +NaNO,3,AgNO,3,+NH,4,SCN AgSCN +NH,4,NO,3,2.用硫酸水解后测定法 例如：硬脂酸镁的含量测定,Mg(C,17,H,35,COO),2,+H,2,SO,4,MgSO,4,+2C,17,H,35,COOH,H,2,SO,4,+,2NaOH Na,2,SO,4,+2H,2,O,二、不经有机破坏的分析方法,（三,）,经氧化还原后测定法,1,、碘他拉酸的含量测定,2.碘番酸、胆影酸、胆影葡胺注射液、泛影酸、泛影酸 纳及泛影葡胺注射液的含量测定,Zn,还原，后银量法,二、不经有机破坏的分析方法,3.利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量,（1）含锑药物 例如：葡萄糖酸锑的含量测定,Sb,5+,+2KI Sb,3+,+2K,+,+I,2,I,2,+2Na,2,S,2,O,3,2NaI +Na,2,S,4,O,6,（2）,含铁药物,2Fe,3+,+2KI 2Fe,2+,+2K,+,+I,2,I,2,+2Na,2,S,2,O,3,2NaI +Na,2,S,4,O,6,H,+,二、不经有机破坏的分析方法,湿法破坏,药物分析中常用的有机破坏的方法有,HNO,3,-HClO,4,法 干法破坏,(一)湿法破坏,HNO,3,-H,2,SO,4,法,H,2,SO,4,-,硫酸盐法（凯氏定氮法）,HNO,3,-H,2,SO,4,-HClO,4,法；,H,2,SO,4,-H,2,O,2,；H,2,SO,4,-KMnO,4,(二)干法破坏 加,Na,2,CO,3,或,MgO,以助灰化；温度控制在420,分为：高温炽浊法和氧瓶燃烧法,三、经有机破坏的分析方法,含氮有机药物,凯氏定氮法,在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，测出氮含量。,1.,原 理,2.,包括四个过程：,消化、蒸馏、吸收、滴定,2.,反应过程,1.,有机物中的氮在强热和,浓,H,2,SO,4,作用下，消化生成无机氮,NH,2,CHCOOH+2 H,2,SO,4,=SO,2,+H,2,O+2CO,2,+NH,3,2NH,3,+H,2,SO,4,=(NH,4,),2,SO,4,2.,在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出,NH,3,(NH,4,),2,SO,4,+2NaOH=Na,2,SO,4,+2NH,4,OH,4.,用已知浓度的,HCI,标准溶液滴定，根据,HCI,消耗的量计算出氮的 含量。,NH,4,H,2,BO,3,+HCl,=H,3,BO,3,+NH,4,Cl,3.,NH,3,收集于,H,3,BO,3,溶液中。,NH,3,+H,3,BO,3,=NH,4,H,2,BO,3,3.,反应装置,4.,反应试剂,1,、消化液：硫酸,2,、催化剂：硫酸铜、硫酸钾,3,、碱溶液：,40%,氢氧化钠,4,、吸收液：,2%,硼酸,5,、混合指示剂：（,1,：,1,）乙醇溶液,0.1%,甲基红：,0.1%,溴甲酚绿,6,、标准滴定液：,0.2M HCL,度的另一方法测定的结果进行比较。,软膏类样品：将适量样品置不含被测成分的蜡油纸中包裹严密，外层再用无灰滤纸包裹,Mg(C17H35COO)2 +H2SO4 MgSO4 +2C17H35COOH,是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应,无色、磨口、厚壁、硬质玻璃 锥型瓶,有利于将燃烧分解产物较快地吸收到吸收液中；,例如：富马酸亚铁,UV法：首先制备一个标准系列，浓度点n=5;A=0.,2030mg（半微量分析）,的样品均应呈现负反应。,偏差(deviation,d)d=测得值-平均值=Xi-X,(coefficient of variation,CV),含金属有机药物 金属盐；,经有机破坏的分析方法,HPLC法：制备一个标准系列，浓度点n=5 7;以C对h或A或与,5.,各种试剂的作用,硫酸：,1,.,脱水。使有机物炭化，生成,C,2.,氧化。,H,2,SO,4,将,C,、,H,氧化为,CO,2,和,H,2,O,蒸汽逸出，本身还原为,SO,2,，而药物则分解成无机氮，并与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中,硫酸铜：,1.,催化剂 加速反应,硫酸铜，氧化汞或硒粉作为催化剂以及加入少 量过氧化氢作为氧化剂，次氯酸钾防止污染。通常使用硫酸铜。,2.,碱性反应指示剂,有机物全部消化后，出现硫酸铜的兰绿色，可以作为指示剂。,40%,氢氧化钠,碱性条件下，使硫酸铵释放出氨气。,加入氢氧化钠溶液要过量；,要防止样液中氨气逸出。,硼酸,H,3,BO,3,：,半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收氨的作用。硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂变色反应。,盐酸：,HCl,滴定液,常量法中取,0.1M,比较合适，半微量法中则在,0.02,0.05M,之间比较合适。,6.,注意事项,取样量：,常量法：相当于含氮量,25,30mg,半微量法：,相当于含氮量,1.0,2.0mg,2.,蒸馏加浓碱,NaOH,，加的量为,H,2,SO,4,量的,4,倍,常量分析：,80ml NaOH,，,25ml,的,2%,硼酸，,半微量分析：例如,10ml,样品，,10ml NaOH,，,10ml2%,硼酸,3.,硼酸保持过量。,4.,标准酸浓度：一般常量用,0.1mol/L,半微量用,0.05mol/L,微量用,0.01mol/L,氧燃瓶燃烧法,(,oxygen flask combustion method),1.,原理,将含有待测元素的有机药物放入充满氧气的密闭燃烧瓶中进行燃烧，使有机结构部分彻底分解为二氧化碳和水，而待测元素根据电负性的不同转化为不同价态的氧化物（或无氧酸），被吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行检查或定量测定。,适用范围：,含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析。,特点：简便、快速、破坏完全，尤其适用于微量样品的分析。,2.,氧燃瓶燃烧法的适用范围及特点,3.,仪器装置,燃烧瓶为,500,、,1000,或,2000ml,无色、磨口、厚壁、硬质玻璃 锥型瓶,瓶塞,空心,底部熔封铂丝一根，下端呈螺旋状或网状,4.,称样用材料及称样,A.,固体样品 无灰滤纸,B.,液体样品 纸袋,C.,软膏类样品：将适量样品置不含被测成分的蜡油纸中包裹严密，外层再用无灰滤纸包裹,5.,吸收液,作用,将样品经燃烧分解所产生的各种价态的卤素、硫、氮、硒等，定量地吸收并转变为一定的便于测定的价态,吸收液的选择,氟 水 （,HF),氯,NaOH,溶液（,HCl,溶解 度低,）,溴,H,2,O,2,-NaOH,（,NaOH-,硫酸肼饱和溶液,碘,NaOH,硫酸肼饱和溶液,硫,NaOH,或,H,2,O,2,硒 硝酸溶液,6.,操作方法,燃烧瓶燃烧前的准备：用洗液洗净后，按各药品项下的规定 加入吸收液，将瓶口用水湿润，小心急速地通入氧气,1min,，立即用表面皿覆盖瓶口。,样品的准备：取样品适量，精密称定后按规定方法包裹，固定于铂丝下端的网内或螺旋处。,样品的燃烧：点燃包有供试品的滤纸尾部，迅速放入燃烧瓶中，按紧瓶塞，加水少量封闭瓶口，俟燃烧完毕（应无黑色碎片），充分振摇，使生成的烟雾完全吸入吸收液中，放置,15min,，用水少量冲洗瓶塞及铂丝，合并洗液及吸收液，同法另做空白试验。然后按各药品项下规定的方法进行鉴别、检查或含量测定。,Mg(C17H35COO)2 +H2SO4 MgSO4 +2C17H35COOH,溶出度或释放度中的溶出量测定：范围应为限度的20%。,它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。,NH3收集于 H3BO3 溶液中。,GC法变动因素有：色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检,优选第四章药物含量测定方法验证,第三节 药品质量标准分析方法验证,六、线性,硫 NaOH或H2O2,应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分,HPLC法：制备一个标准系列，浓度点n=5 7;以C对h或A或与,含金属有机药物 金属盐；,2Fe3+2KI 2Fe2+2K+I2,是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量，是限度检验,查、含量测定方法，均应考察其专属性。,根据被燃烧分解的样品量选用适宜大小的燃烧瓶。,ChP,（,2005,）规定的燃烧瓶体积为,500,、,1000,或,2000ml,三种，采用常量或半微量分析。,（,4,）,注意事项,待分解样品量,燃烧瓶的体积,35mg,（微量分析）,150250ml,2030mg,（半微量分析）,300500ml,5060mg,1000ml,0.60.7g,或更多,2000ml,或特殊结构的燃烧瓶,正确选用燃烧瓶的目的在于：样品能在足够的氧气中燃烧分解完全；有利于将燃烧分解产物较快地吸收到吸收液中；防止爆炸的可能性。,测定含氟有机药物时，用石英制燃烧瓶,铂丝燃烧时起催化作用,应同时做空白试验,燃烧时要注意防爆,燃烧要完全,燃烧产生的烟雾完全被吸收,应用示例：碘苯酯的测定,返 回,（二）数据要求,回收率%=（测定平均值 空白值）/加入量100%,要求制备高、中、低三浓度的样品，各测定3次。应,报告已知加入量的回收率，或测定结果平均值与真实值,之差及其可信限。,第三节,药品质量标准分析方法验证,一、准确度,是指用该方法测定结果与真实值接近的程度，用回收率表示,（一）含量测定方法的准确度,1.原料药 可用已知纯度对照品或样品进行测定；或与已建准确,度的另一方法测定的结果进行比较。,2.制剂 要考察辅料对回收率的影响。采用在空白辅料中加入原,料对照品的方法作回收率试验，然后计算,RSD。,具体做法：测定高、中、低三个浓度，,n=3,共9个数据来评价,回收率的,RSD2%；,用,UV,和,HPLC,发时，一般回,收率可达98%102%；容量法可达99.7%100.3%,二、精密度,是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次测定结果,之间的接近程度。,（一）精密度表示方法,1.偏差(,deviation,d,),d,=,测得值-平均值=,X,i,-,X,2.,标准偏差（,standard deviation,SD,或,S,）,S,=(,X,i,X,),2,/(n-1),1/2,3.,相对标准差(,relative standard deviation,RSD,),也称变异系数,(,coefficient of variation,CV,),RSD=,标准偏差/平均值100%=,S/X,100%,（二）重复性、中间精密度及重现性,1.重复性 在相同条件下,由一个分析人员测定所得结果的精密度.,2.,中间精密度 在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不,同设备测定结果的精密度。,3.重现性 在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度。,（三）数据要求,应报告,S,或,SD、RSD,和可信限。用统计学的可信性分析(,t,或,f）。,三、专属性,是指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，,采用的方法能准确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检,查、含量测定方法，均应考察其专属性。,（一）鉴别反应,应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分,的样品均应呈现负反应。,（二）含量测定和杂质测定,色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。,图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。在能,获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。在杂,质和降解物不能获得的情况下，可用以验证方法和药典方法进,行对照；也可用对试样加速破坏的方法，比较两种方法。,四、检测限（,limit of detection,LOD,),是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量，是限度检验,指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。,（一）常用的方法,1.非仪器分析目视法 用已知浓度被测物，试验出能被可靠地,检测出的最低浓度或量。,2.仪器分析方法,UV,法：,LOD,=,f,.3,S,空,=,C,样,/,A,样,3,S,空,Flu,法：,LOD,=,f,.3,S,空,=,C,样,/(,F,样,-,F,空,),3,S,空,GC,和,HPLC,法：,LOD,=,S,/,N,=2,或3,（二）数据要求,应附测试图，说明测试过程和检测限结果。,五、定量限（,limit of quantitation,LOQ,),是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应,具一定准确度和精密度。杂质和降解产物进行定量测定时，要求,LOQ,.,常用信噪比法确定定量限，一般以,S/N=10,时相应的浓度进行,测定。,六、线性,是指在设定的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接,呈正比关系的程度。,UV,法：首先制备一个标准系列，浓度点,n=5;A=0.3.0.7,建立回归方程,C=aA+b;r 0.9999。,HPLC,法：制备一个标准系列，浓度点,n=5 7;,以,C,对,h,或,A,或与,内标物的峰面积之比，建立回归方程,r 0.9999。,七、范围,是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法,适用的高低限度或量的区间,。,原料药和制剂含量测定：范围应为测试浓度的80%-,120%。,制剂含量均匀度检查：范围应为测试浓度的70%-,130%。,溶出度或释放度中的溶出量测定：范围应为限度的20%。,八、耐用性,是指在测定条件下有效的变动时，测定结果不受影响的承受,程度。典型的变动因素有：被溶液的稳定性、样品提取次数、时,间等。,HPLC,法变动因素有：流动相组成与,pH，,色谱柱，柱温，流速等。,GC,法变动因素有：色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检,测器温度等。,分析方法效能指标的具体应用,：,1.用于鉴别试验的方法：只要求专属性、耐用性，其余不要求。,2.,用于原料药中杂质测定和制剂中降解产物测定的方法：,用于定量：除了检测限不要求外，其余七项指标均要求。,限度检查：除检测限、专属性、耐用性要求外，其余不要求。,3.原料、制剂及溶出度测定：不要求检测和定量限，其余均要求。,返 回,练习与思考,A,型题,1 药品的鉴别是证明,A,未知药物的真伪,B,已知药物的真伪,C,已知药物的疗效,D,药物的纯度,E,药物的稳定性,2相对标准差表示的应是,A,准确度,B,回收率,C,精密度,D,纯净度,E,限度,3用移液管量取的25,ml,溶液，应记成,A25ml B25.0ml C25.00ml,D25.000ml E251ml,4,以下三个数字0.5362、0.0014、0.25之和,应为,A0.79 B0.788 C0.787,D0.7876 E0.8,图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。,NH3收集于 H3BO3 溶液中。,硫 NaOH或H2O2,半微量用0.,（二）重复性、中间精密度及重现性,GC法变动因素有：色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检,质和降解物不能获得的情况下，可用以验证方法和药典方法进,碱性条件下，使硫酸铵释放出氨气。,有利于将燃烧分解产物较快地吸收到吸收液中；,根据被燃烧分解的样品量选用适宜大小的燃烧瓶。,溶于热稀矿酸，采用铈量法，邻二氮菲作指示剂,是指在测定条件下有效的变动时，测定结果不受影响的承受,半微量法：相当于含氮量1.,分为：高温炽浊法和氧瓶燃烧法,常用信噪比法确定定量限，一般以S/N=10时相应的浓度进行,5表示两变量指标,A,与,C,之间线性相关程度常用,A,相关规律,B,比例常数,C,相关常数,D,相关系数,E,精密度,6减小偶然误差的方法是,A,做空白试验,B,做对照实验,C,做回收试验,D,增加平行测定次数,E,选用多种测定方法,B,型题,14,A1.23 B1.22 C2.54 D2.53 E2.51,11.2252,22.5351,32.5348,42.5068,A,C,D,E,58,A,空白试验,B,对照试验,C,回收试验,D,鉴别试验,E,检测试验,5以同量的溶剂替代供试品同法进行测定试验,6在供试液中加入已知量的标准物或已知量的被测物后，同法进行测定试验,7用已知量的纯物质作为试样，同法进行测定试验,8取少许水杨酸，加水溶解，加三氯化铁试液，显紫堇色,A,C,D,B,