实验步骤.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,实验操作,陈韵琳,农杆菌电转法,开电源按STE设电压（E.coli 1500v 农杆菌18000v）,用无水乙醇洗3次点转杯在冰上晾干,100ul感受态+1,l质粒，提前混入放于电转杯中,Push2两下时间在5-6s,将1mlLB液体培养基加入电转杯中轻吸打1-2次，吸出放入离心管中,28摇菌1h,4000rpm 2min 100,l涂平板,28过夜培养挑单克隆，摇菌，进行PCR检测,平板制备,农杆菌平板的制备：LB100ml+kam（50mg/ml）100,l+RFP利福平（50mg/ml）100,l,潮霉素(Hyg),RFP利福平（50mg/ml）：0.05g用1ml甲醇溶解，过滤灭菌,50mg/ml卡那霉素(Kan):1g卡那霉素+20ml灭菌水（过滤灭菌）,胶回收/纯化,1.2%琼脂糖凝胶电泳电泳-上样-切胶-称重+同体积mem bind,55-65水浴溶胶,倒入小柱-静止1min-12000rcf1min,700,l men wash 12000rcf,1min,500,l men wash 12000rcf,1min,空管离心12000rcf2min,换新离心管小柱中加入50,l去离子水静止1min-12000rcf,1min,拟南芥的种植方法,种子放入1.5ml的离心管中+20漂水1ml强烈震动20min，,灭菌水冲洗6次,0.1的琼脂糖悬浮种子，接种于1/2MS平板上，正放，在组培室培养7天，当种子长到2叶一心时，种于土中（蛭石和土等体积，于20min，121高压灭菌），第1,2天用保鲜膜将培养钵的口封上，在其上留有通风孔，8小时日照下进行营养生长15-20天，之后在12小时日照下进行生殖生长。,质粒大肠杆菌热激法的转化,(1)将质粒转入装有100,l感受态细胞的小离心管中,轻弹管壁混匀,冰浴30min;,(2)42度水浴热击60s,迅速置于冰浴2min,(3)加入室温的液体LB培养基1000,l,混匀,37度,150rpm摇床培养lh;4500rpm离心5min,(4)取200,L培养液涂布于含卡那霉素50mg/L的LB平板上,37度培养16h,直至单菌落产生,大肠杆菌质粒的提取,大肠杆菌质粒的提取,(l)挑取在卡那霉素的LB平板上的单菌落,接种于10ml含有相应抗生素的LB液体培养基中,37度,200rpm,震荡培养过夜(8-12h);,(2)取,4.5,ml的过夜培养菌液,12000rpm离心2min,弃上清;,(3)用250ul的Solutionl(含RNaseAI)充分悬浮细菌沉淀;,(4)加入250ul的Solution11轻轻的上下翻转混合5一6次,使菌体充分裂解,形成透明溶液;,静止,2min,(5)加入350ul的SolutionIII,轻轻上下翻转混合5一6次,室温静置2min;,(6)室温12000 rpm离心10min,取上清;,转移至SpinColumn中,12000rpm离心lmin,弃,滤液,（,将试剂盒中的SpinColunm安置于eoxlection,管,上,）,(,7,)500,l的HB buffer转移至SpinColumn中,12000rpm离心lmin,弃,滤液;,(,8,)将700,l的wash buffer加入SpinColumn中,12000rpm离心lmin,弃滤液;,重复操作,此,步骤,(,9,)将SPinColulnn安置于新的1.5ml的离心管上,在SPincofulnn膜的中央处加入50,l的灭菌蒸馏水,室温静置1min;,(,10,)12000rpm离心1min洗脱DNA,农杆菌感受态细胞的制备,(l),农杆菌,菌株划线培养，在农杆菌平板中进行,(,2,),取单克隆，于5,0ml,LB,液体,中,加入利福平,28度,180,rpm,培养过夜;使OD达到0.5;,(3),菌夜转入50ml离心管中，,4度,4,000rpm,离心10min,弃上清液;,(4),弃上清，10ml无菌甘油（20,）悬浮细胞，,4度,4,000rpm,离心10min,液;,重复3遍,(5),弃上清，1ml无菌甘油（20,）悬浮细胞，,每,50,l分装为一管;-,8,0度冰箱贮存各,备,用,根癌农杆菌介导的杨树遗传转化程序,(1)工程菌液的制备,挑取单菌落,接种到,1,0ml相应抗生素的LB液体培养基中,于28度,180-220rpm,过夜培养,晨,OD600值为0.5-1，4000rpm,离心5min,收集菌体,用不含抗生素的l/2MS液体培养基或无菌水悬浮,所得菌液用于侵染,即为工程菌液,(2)侵染,将工程菌液倒入无菌培养皿中,选取叶片,浸入工程菌液中,剪去叶片的四周，侵染45min,(3)共培养,取出侵染后的叶片用无菌滤纸吸干菌液后,转入到共培养基上,暗培养,(4)脱菌,将共培养的外植体放入50mg/L的cef水中进行脱菌，1-4次中每次头孢水中洗5min,其后头孢水洗20min,知道没有菌丝为止。,(5)选择培养,将经过脱菌的外植体转移到筛选培养基上进行筛选培养,筛选出抗性芽,(6)抗性芽的获得,选择培养一周后会有芽的产生,这时要使芽充分接触到培养基,在选择性培养基上正常分化生长的芽即为抗性芽,待芽长至3cm左右时,剪下来放置装有分化筛选培养基的培养瓶中,一周后在转入生根筛选培养基中。,(7)抗性芽的生根,将获得的抗性芽进行生根筛选,能够在选择生根培养基上生长!生根的抗性芽,可以进一步确定为转化芽。,带真菌的植株消毒,茎段于7530s,灭菌水冲洗3次,过氧化氢原液30min（前15分钟为原液，后15分钟加入同体积水）,1次氯酸钠10min,灭菌水冲洗3次,放入平板上晾干,1%次氯酸钠：1ml次氯酸钠+9ml水,75酒精（消毒）:100ml酒精+24ml水,总DNA的提取,(l)取适量新鲜幼嫩叶片放入预冷的研钵中,迅速加入液氮研磨成粉末,将其转入提前预热的装有700ulCTAB提取缓冲液的1.5而的离心管中,65度恒温水浴30min,其间不时轻轻摇动离心管,使叶片粉末均匀的分散在提取液中;取出放至室温后,12000rpm离心5min,(2)加入350,l酚:氯仿(体积比1:l),上下缓慢颠倒混匀,酚与氯仿配合使用可以增强除蛋白的效果;12000rpm离心5min;将上清转入另一离心管中,弃下层(不要将中间蛋白层吸出):重复步骤两次,直至中间层透明,取DNA相;,(3)加入与上清液等体积的氯仿上下缓慢颠倒混匀,12000rpm离心5min;将上清转入另一离心管中,弃下层(不要将中间蛋白层吸出):重复步骤两次,直至中间层透明,取DNA相;,(4)吸取上清液加入1.5ml离心管中,加入1/10体积的3mol/LNaAc和3倍体积的无水乙醇,混匀后,室温静置20分钟，12000rpm,离心15min,弃上清;75酒精洗沉淀，20,l去离子水,溶解DNA沉淀:,(5)加入1.5ulRNase,37放置30min;,(6)加,入,离子水到,3,00ul,加300ul氯仿:酚(1:1)抽提一次:,(7)吸取上清液加入1.5ml离心管中,加入l/10体积的3mol/LNaAc,3倍体积的无水乙醇混匀后,室温静置20分钟，12000rpm,离心15min,弃上清;75酒精洗沉淀，20,l去离子水,溶解DNA沉淀，电泳检测，测浓度,试剂,CTAB法提取DNA:CTAB5g+NaCl(0.5M)20.47g+EDTA(0.5M)10ml+TrisBase(1M)25ml定容到250ml,EDTA(0.5M)：18.2g定容到100ml,TrisBase(1M):12.11g定容到100ml,利用CTAB法提取毛果杨总RNA,1，,将液氮快速研磨，待液氮蒸干后，立即将样品转入已加好提取液并冰浴好的1.5毫升离心管内（700微升CTAB），加样过程易降解，所以加完样品应立即振荡后于65度水浴锅水浴5分钟，之后冰上静置2分钟，随后4离心机中12000 r min-1离心2min。,2，,上步骤处理后所得的上清液转入在冰上预冷好的1.5毫升离心管中（离心管中加入350微升氯仿+350微升水饱和酚），振荡后，4离心机中12000 r min-1离心2min，重复两次。,3，,取上清转入预冷好的600微升氯仿中，振荡后，4离心机中12000 r min-1离心2min，重复两次。,4，,1.5毫升离心管中加入350微升乙醇+350微升氯化锂（8 mol l-1）混匀，预冷。将上述上清加入其中，混匀。冰上沉淀20min。4离心机中12000 r min-1离心20min。弃上清，用75%乙醇洗涤2次。待沉淀表面乙醇蒸干（一直冰上），用40微升DEPC水溶解。电泳检测。用1%琼脂糖凝胶电泳，电泳液换新的并且用之前最好冰浴。,5，,40微升RNA溶液+5微升10buffer+8毫升DNase，37水浴30 min。,6，,加DEPC水稀释总体积至300微升，加300微升氯仿抽提一次,7，,取上清，加入预冷的900微升无水乙醇（上清体积3倍）+120微升3 mol l-1醋酸钠（上清体积的1/10），冰上静置15 min，4离心机中12000 r min-1离心15min。,8，,75乙醇洗涤2次，气干，20微升DEPC水溶解,，,电泳检测，同（,4,）,试剂,CTAB法提取RNA:硼砂(0.01M)0.38137g用去离子水定容到10ml，用盐酸调PH到8.5+EDTA(0.5M)1ml+CTAB2g+NaCl(1.6M)9.36g+DEPC水100ml用去离子水定容到100ml（37烘箱过夜,在高压灭菌）,Licl(8M):13.56g定容到40ml+DEPC水40ml 过滤灭菌,NaAc(3M):20.412g定容到50ml,用冰乙酸调PH到5.2+DEPC水50ml,DEPC水：100ml水+DEPC水100ml,75酒精:75,ml,无水乙醇+25ml水,反转录成CDNA,反转录第一链cDNA的合成,，,得到的RNA为模板，利用DRR037A反转录试剂盒（大连宝生物），按照说明书操作如下：,（1）按下列组份配制RT反应液（反应液配制请在冰上进行）。,试剂,使用量 终浓度,5 PrimeScript Buffer（for Real Time）2.0 l 1,PrimeScript RT Enzyme Mix I,0.5 l,Oligo dT Primer（50 M）*1,0.5 l25 pmol,Random 6 mers（100 M）*1,0.5 l50 pmol,Total RNA,RNase Free dH2O,up to 10 l,注：反应体系可按需求相应放大，10 l反应体系可最大使用500 ng的Total RNA。,（2）反转录反应条件如下:37 15 min（反转录反应）85 5 sec（反转录酶的失活反应）,（3）稀释：将得到的10 l cDNA中加入90 l的去离子水，即稀释10倍。-20保存备用。,逆转录PCR反应,取稀释后的反转录得到的cDNA 1 l，作为RT-PCR反应的模板，RT-PCR反应体系，反应结束后用琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR结果。,T载体的链接转入大肠杆菌中扩增,得到的PCR产物，利用A1360 pGEM-T Easy 载体系统（Promega）生产，按照说明书操作如下：,（1）按下列组份配制T-载体反应液（反应液配制请在冰上进行），于4过夜链接,A1360 pGEM-T Easy 载体系统,试剂,使用量,2Rapid Ligation Buffer,T4 DNA Ligase,5l,pGEM-T Easy Vector(50ng/l),1l,PCR product,2 l,T4 DNA Ligase,1 l,Nuclease-free water to a final volume of,to,10 l,（2）取T-载体连接产物10l于100l大肠杆菌感受态中放于冰上静止30min.,（3）42热激60s，于冰上静止2min,加入1000lLB液体培养基于37摇箱复苏一小时。,(4)4000rpm离心5min,涂布于LB平板中于37烘箱过夜培养，看蓝白斑生长状况。挑白斑于加有氨苄的LB液体培养基中，37摇箱培养2h后进行PCR检测，测序检测,Ampicillin（50mg/ml）:1g用20ml的灭菌水定容在过滤灭菌,IPTG（24mg/ml）：0.24g用10ml的灭菌水定容在过滤灭菌,X-Gal（20mg/ml）：0.1g用1ml的DMF(二甲基甲酰胺)溶解，用DMF定容到5ml,T载体链接平板的制备：LB100ml+Ampicillin（50mg/ml）100,l+IPTG（24mg/ml）100,l,+X-Gal（50mg/ml）200,l,培养基配方,1/2MS培养基：2.2gMS+蔗糖25g/L+琼脂5.5g/L,小黑杨生根培养基：1/2MS培养基+IBA0.2mg/l,小黑杨分化培养基：1/2MS培养+NAA0.05mg/l+6-BA0.5mg/l,大青杨生根培养基：2.2gMS+蔗糖20g/L+琼脂6.0g/L,大青杨分化培养基：2.2gMS+蔗糖20g/L+琼脂6.0g/L+NAA0.1mg/l+6BA0.5mg/l,LB,培养基:5g/L酵母提取物10g/LNaCl 10g固体培养基加1.5%琼脂,液体培养基不加琼脂,PH 7.0固体：琼脂900g/cm212g 1300g/cm28.3g 1100g/cm29.8g,6-BA:用lmol/LNaoH溶解后,配成0.5mg/ml母液,NAA:用lmol/LNaOH溶解后,配成0.lmg/ml母液,200mg/ml头抱霉素(Cef)：一瓶+5ml灭菌水,1MHCL:8.4mlHCL+91.6ml灭菌水,1MHCL:8.4mlHCL+91.6ml灭菌水,