实验三_硝酸还原酶活性测定.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验,3,硝酸盐和光诱导对硝酸还原酶（,NR,）活性的影响,硝酸还原酶,植物从土壤中吸收的,NO,3,必须经代谢性还原才能被利用，因为,细胞组分中的,N,均呈高度还原态,，,而,NO,3,中的,N,为高度氧化态,。,硝酸盐的还原由,硝酸还原酶,(nitrate,reductase,NR),催化。硝酸还原酶存在于细胞液中，为一种诱导酶。,诱导酶,(induced enzyme):,植物体本来不含有，但在特定外来物质,(,如底物,),的诱导下,可以产生的酶。,受光促进,1.,实验目的意义,掌握硝酸还原酶活性的测定方法,了解硝酸还原酶的特性,硝酸还原酶（,EC.1.6.6.1,，缩写,NR,）是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响，因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。,硝酸还原,酶可将,NO,3,-,还原成,NO,2,-,，其反应为：,NO,3,-,+NADH+H,+,NO,2,-,+NAD,+,+H,2,O,NR,在一定条件下，,NO,2,-,的生成量与硝酸还原酶的活性呈正相关，因此，可以测定,NO,2,-,的生成量来代表硝酸还原酶的,NR,活性。,2.,实验原理,NO,2,-,含量测定,（磺胺比色法）,在酸性溶液中，,NO,2,-,与磺胺形成重氮盐，重氮盐再与,-,萘胺偶联，形成,紫红色的偶氮化合物,。该偶氮化合物在,540nm,有最大吸收峰，可以用分光光度计测定（,OD,540,）。,（,不稳定，见光容易分解，测定需迅速。,）,当磺胺与,-,萘胺均过量时，所生成的红色深浅与,NO,2,-,含量成直线关系。,NO,2,-,含量标准曲线：,NO,2,-,(,mol/ml)=0.0026,0.359OD,540,NR,活性,(NO,2,-,mol/,hgfw,)=,鲜重,(g),时间,(h),NO,2,-,(,mol/ml),稀释倍数,离体法：,将材料磨成匀浆，经过滤或离心除去残渣，以上清液为硝酸还原酶粗酶液进行测定。,缺点：,由于研磨中,NADH,受损失，必需外加,NADH,方可测定。,活体法：,直接用鲜活组织进行测定。环境中的,NO,3,-,进入细胞后被,NR,还原成,NO,2,-,，并扩散到细胞外在溶液中积累，测定溶液中,NO,2,-,的含量即可得知,NR,的大小。,优点：,不破坏细胞原有的酶反应系统，,NADH,可由代谢反应不断生成，无需外加。简便、快速，不需要贵重仪器设备及低温条件。,缺点,:,重复性欠佳，应作一定量的重复。,硝酸还原酶活性测定,3.,材料与试剂,两种处理的小麦：,水,(ck),，,KNO,3,（,N,）,A,液：,磷酸缓冲液,:,水,:DNP,溶液,:,蔗糖溶液,5:5,:,1,:,1,B,液：,磷酸缓冲液,:,KNO,3,:,DNP,溶液,:,蔗糖溶液,5,:,5,:,1,:,1,磷酸缓冲液,(pH7.5):0.2mol/L,；,KNO,3,溶液,:0.2mol/L,DNP(2-4-,二硝基苯酚,),溶液,:1mmol/L,；,蔗糖溶液,:,2.5mmol/L,磺胺试剂,-,萘胺试剂,取样前一天，用,50mM KNO,3,加到培养小麦的水中，,光照,，以诱导,硝酸还原酶,产生。,两种材料,水,(ck),，,KNO,3,(N),各取,2,份新鲜叶片中段，用蒸馏水洗净、擦干，剪成,1cm,小段，称取,0.3,克；将,4,份（,ck,、,N,）叶段分别置于含有,10ml A,、,B,溶液的两只试管中，即,ckA,、,ckB,、,NA,和,NB,四管；,用纱布将材料压于试管底部，将试管放在真空干燥器中抽气,30,分钟，,放气后摇晃直至叶段沉于溶液中,；,将试管置于,25,30,温箱中，,黑暗,保温,30,分钟；,取,A,液和,B,液,1ml,代替反应液，加入,2ml,磺胺试剂和,2ml-,萘胺试剂，作为测定样品吸光值的对照管,。,立即吸取,1ml,反应液，加入,2ml,磺胺试剂，,摇匀,，再加入,2ml-,萘胺试剂（,注意顺序,），,用漩涡仪混合摇匀,，,25,水浴（水浴锅）反应,5,分钟,取出后桌面静置,10,分钟，,随后,5,分钟内,，在,540nm,测定样品的吸光值。,4.,实验步骤,两种处理的小麦幼苗叶片中段各取,0.3g(,各,2,份,),麦苗,水,(ck),麦苗,KNO,3,（,N,）,10 ml,A,液,B,液,A,液,B,液,抽气,30,分钟,25,30,温箱中,黑暗,保温,30,分钟,取,1ml,反应液,+2ml,磺胺试剂,+2ml-,萘胺试剂,混匀,注意加液顺序,25,水浴反应,5,分钟,取出后桌面静置,10,分钟,540 nm,测定样品的吸光值,取,A,液或,B,液,1ml,代替反应液作为对照管,放气后摇晃直至叶段沉于溶液中,5.,结果与分析,处 理,A,液,B,液,吸光度,NO,2,-,NR,活性 吸光度,NO,2,-,NR,活性,（,uMol,/ml,）,（,uMol/hgfw,）（,uMol,/ml,）,（,uMol/hgfw,）,H,2,O,KNO,3,对照,NO,2,-,（,uMol,/ml,）,=0.0026,0.359OD,540,NR,活性（,NO,2,-,uMol/hgfw,）,=NO,2,-,10ml/1ml,（鲜重,g0.5h,）,分析硝酸盐对硝酸还原酶活性的影响。,6.,注意事项,抽真空放气后，摇晃直至叶段沉于溶液中；,硝酸还原过程应在黑暗中进行；,磺胺试剂和,-,萘胺试剂加入时，注意顺序；,正确使用分光光度计；,避免移液管使用交叉感染。,1,）为何提前一天施,KNO,3,，并且取样应在晴天进行？,2,）,NR,酶活性（,NO,2,-,，,uMol/hgfw,）,=NO,2,-,10ml/1ml,（鲜重,g0.5h,）,公式中的,0.5 h,指哪一个？,7.,思考题,酶反应要在暗条件下进行的原因是叶绿体在光合作用时可产生亚硝酸还原酶的辅酶铁氧还蛋白，与亚硝酸还原酶同时存在时可还原,NO,2,-,，所以在暗条件下进行反应可阻止,NO,2,-,的继续反应，以保证测定结果的准确。,