第二十六章 基因工程药物new.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二十六章,基因工程药物,张驰 副教授,第一节 概述,基因工程是通过对目的基因的掺入，拼接和重组而实现遗传物质的重新组合，再借助质粒，病毒或其他载体将目的基因转移到新的宿主细胞系统内进行复制和表达的新技术。基因工程是现代生物技术的主体及核心。又称,DNA,重组，基因克隆等。,定义,基因工程技术最成功的应用就是用于生物治疗的新型生物药物的研制。,1982,年人胰岛素在美国的问世，带来了巨大的经济和社会效益。生物技术用于疾病的预防和疑难杂症的治疗已经成为了现实。,主要的人和事,发展现状,美国作为最早开展基因及基因工程研究的国家，自基因工程诞生以来处于世界领先地位。拥有生物技术公司,2000,余家，其中,300,余家上市公司。欧洲约有,1000,余家生物技术公司。亚洲的日本，韩国和印度也获得了极大的发展。,我国生物技术起步较晚，但是受到了国家的高度重视，发展速度也是十分惊人。,1997,年,我国自主生产了,第一个基因工程药物重组干扰素,。目前世界上排名前十位的重要基因工程药物我国都能自主生产。,我国已批准上市的基因工程药物和疫苗表,26-1,基因工程药物的特点,稳定性差，易腐败。,使用用量,低，药理活性高。,具有细胞和组织,特异性。,给药方,式有特定要求。,主要的基因工程药物,基因工程技术的优点,可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障。,可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围。,利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质。,利用基因工程技术改良药物，获得新型化合物，扩大药物筛选来源。,基因工程菌的制备,目的基因的获取,载体的制备,目的基因与载体的连接,转化,转化子的鉴定和鉴别,目的基因的获取,反转录法,以,富含目的基因,的实验材料提取,RNA,，在逆转录酶的作用下获得,cDNA,，以此为模板进行,PCR,扩增，最终合成编码多肽的双链,DNA,序列，这是制取真核生物目的基因常用的方法。,人工合成法,化学合成,法：,利用特殊的化学试剂将相邻的两个核苷酸以,3,5-,磷酸二酯键,相连，逐渐延长获得目的基因序列。,聚合酶,链式反应：,根据已经基因的核苷酸序列，设计引物，利用,PCR,技术分,段和成基因片段最终获得全长基因。,载体的制备,外源基因,必须导入适合的细胞内才能实现克隆，表达。这一过程依赖于载体的转运，外源基因片段与载体连接是,DNA,重组技术的关机步骤之一。,根据受体细胞的不同，载体的选择也是不同的，主要包括以下载体：,质粒,载体,噬菌体,柯斯,质粒,单,M13,噬菌体,动植物病毒的衍生物,质粒载体,质粒载体是存在于细菌（酵母）细胞质中的一种独立于染色并能自主复制的一类遗传物质。大多数质粒成环状。通常是游离于染色体之外单独复制，也可在特殊状况下整合入基因组,DNA,中共同复制。提取大量完整的质粒是制备重组质粒的前提基础。,（天然：,pSC,，,RDF,；改进：,pUC,，,pBR,，,pET,）,噬菌体载体,噬菌体基因组长度,48.5kb,，基因组中处的一连串基因并非噬菌体形成所必需的，若用外源,DNA,片段取代这个区域，不会影响噬菌体的形成，这也是,噬菌体能够作为质粒载体的的前提条件。通过,人工,改造得到的,噬菌体载体可以分为,插入型,和,替换型,。,插入型：,可用于组建,cDNA,文库，可容纳,10kb,以下的片段。（组织细胞特异性）,替换,型：,可用于组建基因组文库，容纳,20kb,左右的片段。,柯斯质粒载体,柯斯质粒是一类人工构建的特殊质粒载体。含有,DNA,的,cos,序列,，,质粒复制子,，,抗药性标记,，,一种或几种限制性内切酶单一位点。,具有,噬菌体和质粒的优越性，又具有高容量的克隆能力，容纳外源,DNA,的长度可达,45kb,。,腺病毒,载体,腺病毒可以携带外源基因通过,受体介导的内吞作用,进入细胞核内，但不整合入基因组中，实现高效转染，复制。转染效率达,100%,。,脂质体,载体,是一种人工膜，可以和,细胞膜融合,从而实现外源基因的转染，可以做到缓释，毒性低。,方法一：加同聚尾连接。,用3,末端脱氧核苷酸转移酶催化，使载体与,cDNA,的3末端带上互补的同型多聚体序列，如载体加上,polyC（,或,A）,的尾巴，则,cDNA,加上,polyG（,或,T）,的尾巴，这两种粘性末端只能使载体与,cDNA,连接而不能自我环化，借助同型多聚体的退火作用形成重组分子，最后用,T4DNA,连接酶封口。,优点：,不易自身环化。,因为载体和外源片段的末端是互补的粘性末端，所以连接效率较高。,用任何一种方法制备的,DNA,都可以用这种方法进行连接,通用性好。,目的基因与载体,的,连接,方法二：加人工接头连接,用,T4DNA,连接酶在平末端接上人工接头可以使,DNA,发生连接。所谓人工接头是指人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切位点的寡核苷酸片段。,cDNA,连上人工接头后，用该种限制酶酶切就可得到粘性末端，从而能够与载体连接；,cDNA,中也可能也带有同样的限制酶切点，为了保护,cDNA,不受限制酶破坏，可在加接头前用甲基化酶修饰这些限制酶切位点。,目的基因与载体,的,连接,T4DNA,连接酶既可以“缝合”双链,DNA,片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链,DNA,片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。,CCGAATTCG,GGCTTAAGC,5,-,3,-,宿主细胞转化,含目的基因的表达载体构建完成后，需要导入宿主菌种进行扩增或表达，通常采用转化法。所谓转化就是指在特殊状态下即感受态状态时，可摄取外源遗传物质，摄入的外源物质可以单独复制也可以整合到宿主细胞染色体一同复制，是宿主菌具有新的形状。宿主细胞感受态的制备有多种方法包括：冷氯化钙，氯化铝，电转法等。,重组质粒,重组质粒,野生型,E.coli,感受态细胞,CaCl2,低温,短暂热刺激或电击,热激法：,大肠杆菌在,0 CaCl,2,低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的,DNA,形成抗,DNase,的羟基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经,42,短时间热冲击处理，促进细胞吸收,DNA,复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。,电,击,法：,使用瞬时高压电处理细胞悬液,，微生物细胞膜在高压电的作用下发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的孔洞进入细胞内部,。这种方法很直接,，转化效率,很,高,。做酵母等真核生物转化时一般都是电击。,转化方法,转化子的,筛选和鉴定,重组质粒转化的细胞在全部受体细胞中只占极少数，需要从大量细胞中筛选出海鸥重组子的菌株，主要的方法有抗药性筛选，单菌落快速电泳，序列测定，,Southern,印迹杂交等。,抗性培养基筛选,单菌落快速电泳,单菌落不需培养扩增，快速裂解单菌落，使内部的质粒释放出来，直接上电泳检测，判断是否还有重组质粒，也可以配合以,PCR,检测是否能扩增出目的基因。,序列测定,Sanger双,脱氧链终止法是Frederick Sanger于1975年发明的。测序过程需要先做一,个PCR。过程,中，双脱氧核糖,核苷酸,（,ddNTP,）,可能,随机的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于双脱氧核糖核苷酸多脱了一个氧原子，一旦它被加入到DNA链上，这个DNA链就不能继续增加长度。最终的结果是获得所有可能获得的、不同长度的DNA片段。目前最普遍最先进的方法，是将双脱氧核糖核苷酸进行不同荧光标记。将PCR反应获得的总DNA通过毛细管电泳分离，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下发出荧光。由于ddATP,ddGTP,ddCTP,ddTTP（4种双脱氧核糖核苷酸）荧光标记不同，计算机可以自动根据颜色判断该位置上碱基究竟是A，T，G，C中的哪一,个,。,Southern,印迹杂交,一,是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（,blotting,）；二是固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。,基因表达,基因表达是指结构基因在生物体中转录，翻译以及后加工过程。以下是主要的表达系统：,大肠杆菌表达系统,酵母表达系统,植物细胞,表达系统,昆虫细胞表达系统,动物,细胞表达系统,1.,宿主菌的选择,容易获得较高浓度的细胞；,能利用易得廉价原料；,不致病、不产生内毒素；,发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；,容易进行代谢调控；,容易进行,DNA,重组技术操作；,产物的产量、产率高，产物容易提取纯化,影响基因表达的因素,大肠杆菌,枯草杆菌,原核,酵母，真菌，,昆虫，动物细胞,真核,原核细胞,大肠杆菌,其为不需要修饰蛋白的首选表达宿主细胞。结构功能了解透彻，技术成熟。另外大肠杆菌可以进行高密度培养，培养介质简单，价格低廉，容易操作，优化手段丰富。,大肠杆菌,原核,大肠杆菌中的表达的缺点,：,不存在信号肽，产品多为胞内产物；,分泌能力不足，常形成不溶性的包含体，产物须在下游处理过程中经过变性和复性处理才能恢复其生物活性；,不存在翻译后修饰作用；,翻译通常从甲硫氨酸的,AUG,密码子开始，故目的蛋白质的,N,端常多余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应；,产生的内毒素难以除去；,产生的蛋白质酶会破坏蛋白质。,原核,枯草芽孢杆菌,分泌,能力强,，可以将蛋白质产物直接,分泌到培养液中,，不形成包含体。该菌也,不能使蛋白质产物糖基化,，另外由于它有,很强的胞外蛋白酶,，,会对产物进行不同程度的降解,，因此在外源基因克隆表达的应用中受到影响,枯草芽孢杆菌,原核,链霉菌,其,是重要的工业微生物，近年来作为外源基因表达体系正日益受到人们的重视。其主要特点是：不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，变铅青链霉菌限制修饰能力弱，可以作为理想的受体菌。现已构建了一系列有效的载体，下游培养工艺也已经,成熟。,链霉菌,原核,酵母,研究基因表达调控的最有效的单细胞真核生物。,特点：,真核生物细胞，故有后翻译过程；,基因组小，仅为大肠杆菌的4倍；,世代时间短，有单倍体和双倍体两种形式；,基因操作与原核生物相似；,可以建立有分泌功能的表达系统，将产物分,泌出胞外，分离纯化工艺相对简单。,酿酒酵母,真核,真核细胞,丝状真菌,特点：,有很强的蛋白分泌能力；能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和 糖基化等，而且其糖基化方式与高等真核生物相似；丝状真菌（如曲霉等）等又确认是安全菌株，有成熟的发酵和后处理工艺,哺乳动物细胞,哺乳动物细胞由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中，细胞培养成分完全由人控制，从而使产物纯化变得容易。,哺乳动物细胞分泌的基因产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。但动物细胞生产慢，产率低，且培养条件苛刻，费,用高，培养液浓度较稀。,表达体系 综述,虽然各种微生物从,理论,上来说都可以用于基因表达，但由于克隆载体、,DNA,导入方法以及遗传背景等方面的限制，目前使用最广泛的宿主菌还是,大肠杆菌,和,酵母,。一方面它们的遗传背景研究得比较清楚，建立了许多适合它们的克隆载体和,DNA,导入方法，另一方面许多外源基因在这两种宿主菌中表达成功，积累了许多实际操作经验。,当然，现在我们不仅要继续利用大肠杆菌和酵母，研究清除影响基因表达的各种因素之间的关系，提出更有效的解决方法，而且还要寻找更好的适合于不同外源基因表达的微生物宿主菌。,大肠杆菌表达体系的优点：,积累了充足经验，,有,多种,载体,可供应用；,操作,安全，致病能力低；,技术操作简便，培养条件简单，,成本相对低得多，大规模发酵经济；,真核生物的基因先在原核体系上构建克隆，称为亚克隆（,sub-clone,），然后采用其它方式转移至真核细胞上,表达。,2.,大肠杆菌体系中的基因表达,2.1,载体,-,表达载体必须具备的条件,载体能独立地进行复制：载体本身就是一个复制子，具有复制起点，分为严紧型和松弛型，前者伴随染色体的复制而复制，在宿主细胞中拷贝数仅13个，后者的复制不依赖于宿主细胞，在宿主细胞中拷贝数可高达3000个,应具有灵活的,克隆位点,和,方便的筛选标记,，以利于外源基因的克隆、鉴定和筛选，且克隆位点位于启动子序列后，以便外源基因表达,应具有,很强的启动子,，能为大肠杆菌的,RNA,聚合酶所识别。,2.1,载体,-,表达载体必须具备的,条件,应具有,阻遏子,，使启动子受到控制，只有当诱导时才进行转录。,应,具有,很强的终止子,，以便使,RNA,聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时，很强的终止子所产生的,mRNA,较为,稳定。,所,产生的,mRNA,必须具有翻译的,起始信号,，即,起始密码,AUG,和,SD,序列，,以便,转录后能顺利,翻译。,pBV220,系统（质粒载体系统,）,特点：,质粒拷贝数较多，小量简便快速抽提可满足需求。,温度诱导，外源基因的表达量可达到细胞总蛋白的,20%-30%.,正常情况下，产物以包含体的形式存在与细胞内，表达产物不易被降解，均一性好。,pBV220,系统,大肠杆菌常用载体,特点,：,克隆宿主与表达宿主分离。,可直接插入。,表达量可达总蛋白的,50%,。,有,Ned,I,，,Nco,I,酶切位点，切开后直接出现,ATG,用于表达。,带有组氨酸标签，可用于纯化。,pET,系统,pET,系统,2.2,提高,目的基因在大肠杆菌中的表达,提高翻译水平：,增加,mRNA,的稳定性；调整,SD,序列与,ATG,之间的距离；,选择偏好性密码子。,生长与表达过程分离：,减少宿主菌的代谢负荷，让宿主菌专一性的复制,重组合质粒达到一定数量后再诱导表达。,提高表达产物稳定性：,组建融合蛋白；定点突变，改变二硫键位置；选,用突变菌种；采用表达分泌蛋白的载体（信号肽，,从胞质到间质）。,2.3,真核,基因在大肠杆菌中的表达形式,融合蛋白的形式,短的原核多肽与真核蛋白结合，氨基端为原核序列，羧基端为真 核系列。不易被降解，操作简单，稳定，高表达，只能做抗原。,非融合蛋白形式,不存在细菌肽，完全是外源蛋白形式，容易被降解，有甲硫氨酸，易发生免疫发应。,分泌型蛋白,不含起始密码子编码的甲硫氨酸，直接能分泌到胞外。但产量不高，信号肽不易被切除。,3.,酵母体系中的基因表达,酵母具有,原核生物,和,真核生物,的双重特点，与,大肠杆菌不同,的是酵母可以对异源蛋白进行简单地,翻译后加工,。与,哺乳动物不同,的是酵母可以,在简单培养基上生长,，在各种酵母工程菌中酿酒酵母应用最为广泛。,与其它表达系统一样，酵母表达体系也包括,载体,、,启动子等控制序列,和,宿主细胞,3个部分。,3.1,载体,附加体质粒（,YEP,）,复制型,质粒（,YRP,）,着丝粒质粒（,YCP,）,整合型质粒（,YIP,）,3.1,载体,YEp,类,（,yeast episomal plasmid，,酵母附加体质粒）,最为常用。这类载体的复制序列为酵母2,质粒成分。,2,质粒,:,是多数酿酒酵母中天然存在的质粒，可独立复制。将,2,质粒中复制起点区及,REp3,基因区的序列引入载体，就足以维持在大多数酵母株系中的复制能力。以,2,质粒为基础的载体，因具有较高的拷贝数、转化频率和稳定性而被广泛使用,YRp,类,（,yeast replication plasmid，,酵母复制型质粒）,复制序列是非2,来源的自主复制序列,，,可来自酵母染色体，也可来自其他生物。此类载体稳定性差，拷贝数也少。,YCp,类,（,yeast centromeric plasmid，,酵母着丝粒质粒）,:,可以部分整合到染色体中，在子代细胞中精确地分配，因此有很好的稳定性。但它们的,拷贝 数只有1个,。,YIp,类,（,yeast inteegrative plasmid，,酵母整合型质粒,）,此,类载体含有可与酵母染色体重组的序列，可以完全整合到染色体,中一同复制，稳定性好，拷贝,数只有一,个。,3.2,启动子,启动子,是,外源基因表达的关键构件。酵母表达系统应用的启动子种类很多主要包括,：,组成型,诱导,型,分泌,型,复合型,4.,杆状病毒表达体系,杆状病毒可在真核细胞中大量表达外源蛋白，应用广泛，主要特点有：,为,真核,表达系统,，可对蛋白进行,修饰,，加工，,转运,，近似天然蛋白。,利用,多角体强启动子,构建表达体系，,高效,表达外源蛋白。,病毒,基因,组,较,大,，可以,插入较大,的,DNA,片段。,在,同一,个,感染的昆虫细胞内表达,多个,外源蛋白。,不,感染,脊椎动物，,安全性高,。,5.,哺乳动物表达体系,由于哺乳动物细胞内部存在质粒结构，所以只能利用可以感染哺乳动物细胞的病毒作为载体，携带外源基因进入进行复制表达。表达体系主要的组成部件包括：,原核,DNA,序列,启动子,增强子,拼接,信号,终止信号,筛选,信号,报告基因,主要基因工程表达体系比较,表达体系,产 物 产生部位 培养方式 提 纯 产物活性 潜在危性,大肠杆菌 多肽蛋白质 菌体内 容易 一般 对原核好 不大,融合蛋白质 部分高产 对真核差,酵 母 多肽蛋白质 菌体内 容易 菌体内 真核的接近 不大,糖基化蛋白 外分泌 可高产 稍复杂 天然产物,哺乳动物 完 整 外分泌 较难成本高 简单 可达天然 需注意,糖基化蛋白 可高产 产物 致癌,基因工程下游技术主要包括工程细胞的大规模培养，目的蛋白的分离纯化两个方面。,主要步骤和阶段：,1.,培养液的培养与预处理,2.,初步纯化（粗提）,3.,高度纯化（纯化）,4.,最后纯化（精制）,工程,菌的培养和预处理,下游操作的一般流程,工程菌的培养,培养的设备,机械搅拌罐：,常规发酵罐，用于好氧菌培养，放大技术成熟，搅拌,易伤害发酵细胞。,气体提升式,发酵罐：,利用气体的升力带动流体在整个发酵罐内循环，,能避免机械搅动造成的细胞损伤。,固定床反应器：,发酵时气泡的表面张力会破坏细胞，为防止两者接,触常采用固定板床反应器，将细胞固定在载体上，,并通过微孔气体分布器将空气很细的分布在培养液,中不产生气泡。,培养,方式,补料分批培养：,是指将种子接入发酵罐中培养一段时间后，间歇的补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。避免一次性高浓度基质加入对菌体造成的抑制作用。使细胞生长或产物形成处于最佳状态。,连续培养：,在连续加入新鲜培养基的同时连续放出发酵液。使菌体所处的生长，发酵环境相对稳定，能促使细胞不断生长合产物不断形成，连续收获产物，对分泌性和非分泌型蛋白都适用。,工程菌的培养,培养方式,透析培养：,利用半透膜原理使代谢产物和培养基分离通过去除培养液中的代谢产物来解除其对菌体的不利影响。,固定化培养：,将菌体固定在特定载体上能有效提高质粒的稳定性，便于进行连续培养。在连续加入新鲜培养基的同时连续放出发酵液。使菌体所处的生长，发酵环境相对稳定，能促使细胞不断生长合产物不断形成，连续收获产物，对分泌性和非分泌型蛋白都适用。,工程菌的培养,发酵过程的影响因素,培养基,的影响,培养基,的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达,。,常用,的碳源有：,葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等,。,常用,的氮源有：,酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、,硫酸,铵,、氯化铵等。还有无机盐、维生素等,工程菌的培养,接种量,的影响,接种量,是指,移入的种子液体积,和,培养液体积,的,比例。接种量,的大小影响,发酵的产量,和,发酵周期。,接种量小：,菌体,延迟期较长,，使,菌龄老化,，,不利于,外源基因,表达。,接种量大：,可,缩短生长延迟,期，菌体,迅速繁衍,，很快进入对数,生长,期,，适于表达,外源基因接种量,过高，使菌体生长过快,，,代谢物,积累过多，反而会抑制后期菌体的,生长。,3.,温度,的影响,温度对基因表达的调控作用表现在对,复制,，,转录,，,翻译,和,小分子调节分子的合成等,水平的影响。它影响各种,酶的反应速度,，,改变菌体代谢产物的反应方向。,高温或低温都会使发酵异常，影响终产物的形成并导致减产温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。,是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数。对菌体的生长和产物的合成都有着很大的影响。对于好氧发酵，溶解氧浓度是重要的参数。好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。若能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。,4.,溶氧,5.,诱导时机的影响,一般在工程菌的对数生长期或对数生长期后,进行,加温,或加入诱导剂诱导,表达，在对数生长期细胞快速繁殖，菌群数目倍增，对营养和氧的需求激增，对于营养和溶氧要求很高,。,pH,对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对,pH,进行适当的,调节如,采取两段培养工艺，培养前期重点是优化工程菌的生长条件，其最佳,pH,在,6.8,7.4,左右；培养,后期重点是优化外源蛋白的表达条件,其最佳,pH,为,6.0,6.5,。,6.,pH,值,目标产物的分离主要包括两个阶段,。,产物,的初级分离阶段,:,任务是分粒细胞和培养液，破碎细胞释放内容物，溶解包涵体，复性蛋白质，浓缩产物，去除大部分杂质。,精制,纯化阶段：,在初级分离基础上，利用各种高选择手段（各种色谱方法）将目标产物和干扰杂质尽可能的分开，使产物的纯度达到相关要求，最后制成可以储存，运输和使用的产品。,细胞破碎,与固液分离,细胞破碎,与,固液分离属于初级分离阶段,细胞破碎,按照,是否加作用力,分为,机械破碎法,和,非机械破碎法,。,机械破碎法：,高压匀浆法、超声破碎法、高速珠磨法、,高压挤压法。,非机械破碎法：,酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击法。,固液分离,分离细胞碎片可以用离心，膜过滤或双水相分配的方法。,离心：,高速离心，超速离心。,膜过滤：,微滤，超滤，反渗透。,双水相萃取：,将破碎后的细胞悬液与聚乙二醇,-,无机盐混合，然后,离心分相。,精制纯化,主要是各种色谱分离方法,：,名称,分离原理,吸附层析法,组份在吸附剂表面吸附，固定相是固体吸附剂，各能力不同,分配层析法,各组份在流动相和静止液相（固相）中的分配系数不同,离子交换层析法,固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂亲和力不同,凝胶层析法,固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同,亲和层析法,固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此和无亲和力的其它组份分离,纯度及活性检测,纯度检测,电泳法，色谱法，质谱法，和末端氨基酸分析法。,活性,检测,免疫学检测,：放射免疫，酶标法,生物检测,：抗原抗体反应，对细胞，组织和动物的生物功能影响,。,第三节 举例,hGM-CSF,IFN-,4,选择分离纯化方法的依据,（1）根据产物表达形式来选择,分泌型的表达：,产物通常体积比较大、浓度低，因此必须在纯化之前进行浓缩处理，以尽快缩小样品的体积，浓缩的方法可用,沉淀,和,超滤,可溶性表达产物：,产物破菌后，其上清液首选,亲和层析,的分离方法，若无单克隆抗体或特异性的配基 可用，一般选用,离子交换色谱,，处于极端等电点的蛋白用离子交换分离可以得到较好的分离效果，能去除大部分的杂质,周质表达产物：,周质表达是介于细胞内可溶性表达和分泌表达之间的一种形式,获得：菌体经溶菌酶破碎后，一般采用,渗透压休克,的方法获得,渗透压休克,:,突然改变,渗透,压并使细胞发生物理性破裂,不溶性的表达产物（包含体）,获得：通过,离心,，得到变性的包含体，再通过,复性剂,促使包含体复性，得到目的产品,（2）根据单元之间的衔接来选择,正确选择分离纯化的次序：尽早采用高效的分离手段，去除主要杂质；昂贵、费时的分离单元在最后阶段,通常先选用非特异性、低分辨率的操作单元，如,沉淀、超滤和吸附,等，这一阶段主要目的是尽快缩小样品的体积，提高产物的浓度，去除主要的杂质,随后采用高分辨率的操作单元，如具有高选择性的,离子交换,和,亲和色谱,凝胶过滤色谱,这类分离规模小、分离速度慢的操作单元放在最后，可以提高分辨效率,（,3）根据分离纯化工艺的要求来选择,具有良好的稳定性和重复性,要尽可能减少组成工艺的步骤,组成工艺的各技术或步骤之间要相互适应和协调、工艺和设备也能相互适应，从而减少步骤之间对物理的处理和条件的调整,（,3）根据分离纯化工艺的要求来选择,工艺过程中尽量少的使用试剂,时间尽可能短,工艺和技术必须高效、高收率、易操作，对设备要求低、能耗低,具有较高安全性（能去除有危险的污染）,第十一节 变性蛋白的复性,包含体：,重组蛋白在,E.coil,中的高水平表达经常导致蛋白聚集而形成不溶的、无活性的颗粒，即,包含体,大肠杆菌表达的重组蛋白易形成包含体,高效表达的目的蛋白,在大肠杆菌内形成大,量无活性包含体,因无法有效的解决复,性问题，在美国每年,造成的经济损失就达,几十亿美元,包含体电镜图,包涵体的组成与特性：,一般含有,50%,以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、,RNA,聚合酶、外膜蛋白等，环状或缺口的质粒,DNA,，以及脂体、脂多糖等，大小为,0.5-1um,，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等 一般得到包涵体后要进行超生破菌、与可溶性蛋白分离、洗涤、变性溶解、复性，最终拿到你的相对比较纯的目的蛋白,包含体可以富集目的蛋白、抗蛋白酶、对宿主的毒性小,包含体蛋白复性率低，大大增加了提取成本,解决方法：,使重组蛋白在,E.coil,中表达成可溶性的活性形式,优化包含体的复性,一 包含体形成的原因,高水平表达的结果,重组蛋白高水平表达时，新生肽链的聚集速率超过了蛋白的正确折叠速率导致了包含体的形成,重组蛋白表达时，缺乏一些蛋白在折叠过程中需要的酶和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣,二 包含体的分离和溶解,包含体的分离,：,收集重组菌进行破碎（高压匀浆、超声破碎 等），还可加入一定的溶菌酶,包含体抗剪切力，保持完整结构,离心除去破碎上清后的沉淀部分用含有低浓度的变性剂（尿、盐酸胍）、去垢剂等缓冲溶液洗涤,如需要对包含体进行纯化，还可采用,蔗糖密度梯度离心,的方法,二 包含体的分离和溶解,包含体的溶解,打断包含体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使得多肽链伸展,强的变性剂：脲、,盐酸胍,或硫氰酸盐,盐酸胍优于脲，因为盐酸胍是较强的变性剂、而且脲中常 含有异氰酸盐或酯会不可逆地修饰蛋白质的氨基或巯基,蛋白质复性概念,将蛋白质从结构不规则、无,活性的状态，恢复到有唯一,立体结构、有生物活性的 状态的过程称为,蛋白质复性,。,三 包含体蛋白复性的方法,三 包含体蛋白复性的方法,稀释、透析复性法,：除去变性剂、还原剂，促进蛋白复性,二硫键的复性：,空气氧化法：利用空气中的氧气在折叠期间,氧化巯基，金属离子的存在具有催化作用,加入氧化,-,还原转换试剂,复性前后，氧化型与还原型试剂的恰当使用,封闭蛋白的疏水簇复性：,疏水簇的存在增加了聚集，用特异性结,合疏水簇的单克隆抗体来封闭疏水簇，,可减少分子间结合引起的聚集,凝胶过滤层析复性,：层析介质的隔离作用，降低了蛋白之间相,互作用产生的凝集，提高了复性浓度和复性率,蛋白经过凝胶过滤层析本身可以得到一定的纯化,小分子添加剂复性：,小分子添加剂可以防止蛋白的凝集,稳定蛋白的活性状态、降低了非正确折叠分子的,稳定性，增加了折叠中间体的稳定性,添加剂并不加快折叠速率，只抑制凝集的发生,分子伴侣或折叠酶复性：,分子伴侣：,一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装，而且在组装完毕后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能时的组份,应用分子伴侣和折叠酶在体外帮助蛋白复性可以提高复性率，,但 分离较为繁琐，增加成本,人工分子伴侣复性,可加入去垢剂等，形成,蛋白,-,去垢剂,复合体，复合体的形成抑制蛋白的聚集，加入,环糊精,去除 去垢剂，促使蛋白折叠,透析法,:,简单,;,但费时,费缓冲液,蛋白质浓度不能过高,(,容易产生沉淀,),快速稀释法,:,最常用的小规模复性方法,;,但比较费时,费缓冲液,蛋白质的浓度不能高,(,容易产生沉淀,),超滤透析法,:,比较省缓冲液,处理量大,;,但费时,要控制好蛋白质浓度,凝胶过滤法,:,快速,可重复性高,不会产生沉淀,操作复杂一点,分子伴侣或折叠酶法：,复性率率高，,但 分离较为繁琐，增加成本,包含体来源蛋白质的复性,活性蛋白回收率高,正确产物易于分离,折叠复性后能得到浓度较高的蛋白产品,折叠复性方法易于放大,复性过程耗时少,有效理想的折叠复性方法的特点,第十二节 基因工程药物的质量控制,基因工程产品相对于一般药品，有着许多不同之处,活的细胞作为表达系统来制备产品，产品分子质量大、结构复杂,具有显著效应，在微量情况下就可以发挥作用，因此，产品的任何性质或数量上的偏差，都可能贻误病情甚至造成严重的伤害,杂质多，需严格控制产品的有效性、安全性、均一性,第十二节 基因工程药物的质量控制,一 原材料的控制,原材料的质量是要确保药品的,DNA,序列的准确性，重组微生物来自单一克隆，所用质量纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性，所以原材料的质量控制主要是对目的基因、表达载体已经宿主细胞的检查,1,目的基因,需明确目的基因的来源、克隆经过,对于改造过的基因应说明被修饰改过的密码子、被切除的肽段及拼接方法,使用,PCR,技术扩增得到的基因，应说明扩增的模板、引物及酶反应等情况，并以限制性内切酶图谱和核苷酸序列等分析方法确证基因结构的正确无误,2,表达载体,应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及其组成部分（如复制子、启动子等）的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标记等,3,宿主细胞,需提供宿主细胞的的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性,需阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态，是否整合到染色体内及拷贝数，并证明宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性,提供载体插入基因与表达载体两侧控制区内的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中，启动与控制克隆基因在宿主细胞中表达的方法和水平,第十二节 基因工程药物的质量控制,二 培养过程的质量控制,贮存中要求种子纯而稳定,培养过程中，要求质粒稳定,生产发酵中，工程菌表达稳定，能排除外源微生物污染,1,生产用细胞库,基因工程产品的生产采用种子批细胞系统。,需证明种子批不含致癌物质，无细菌、病毒、霉菌和支原体等污染，再由原始种子批建立生产用工作细胞库,在同一个实验室工作区内，不得同时操作两种不同的细胞或菌种，一个工作人员不得同时操作两种细胞或菌种,2,培养过程,培养过程中应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征,培养周期结束后，应监测宿主细胞,/,载体系统的特性：比如：质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体残留程度、含插入基因的载体的酶切图谱等,第十二节 基因工程药物的质量控制,三 纯化过程的质量控制,保证提纯分子批次间保持一致、提纯过程中能去除有害物质和热源质,纯化工艺的每一步完成后均应测定收获物纯度，计算提纯倍数、收获率等，要对每一步的纯化效率、活性回收率和蛋白回收率进行检测，只有当这两种回收率呈正相关时，纯化过程才是有效、可行的,四,目标产品的质量控制,基因工程的质量控制主要包括这些：产品的理化性质的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性,第十二节 基因工程药物的质量控制,1,生物活性的测定,多肽或蛋白质药物的生物活性是蛋白质药物的重要质量控制指标,生物学效价的测定必须采用国际上通用的方法,采用在动物体内或通过细胞培养进行体外效价测定,重组蛋白是抗原，具有相应的抗体或单克隆抗体，可采用放射性免疫分析法或酶标法测定其免疫学活性,2,理化性质的测定,采用多种方法对重组技术获得的蛋白质药物产品进行全面的鉴定,特异性鉴别、非特异性鉴别、相对分子质量测定、等电点测定、肽图分析、氨基酸组成分析、部分氨基酸序列分析、蛋白质二硫键分析,3,蛋白质含量的测定,根据蛋白质的物理、化学性质进行测定,Folin-,酚法、染色法、双缩尿法、紫外吸收法、,HPLC,法、凯式定氮法,质量鉴定中常用的方法是：,Folin-,酚法、染色法,4,蛋白质纯度分析,蛋白质纯度分析方法,SDS-PAGE,等电点聚焦,HPLC,毛细管电泳,5,杂质检测,蛋白类杂质：,纯化过程中残留的宿主细胞蛋白，可采用免疫学的方法测定,目的蛋白发生了某些变化，形成在理化性质上与原蛋白极为相似的蛋白杂质，比如一些目的蛋白的沉淀等,这些目的蛋白的变构体在体内往往会产生抗体，因此对这类杂质的质量控制也要严格限定,非蛋白类杂质,具有生物学作用的非蛋白类杂质主要有：病毒和细菌等微生物、热原质、内毒素、致敏原及,DNA,杂质和污染物,检测方法,杂质,内毒素,鲎（,hu,）试剂、家兔热原法,宿主细胞蛋白,免疫分析、,SDS-PAGE,、毛细管电泳（,CE,）,其他蛋白杂质,SDS-PAGE,、,HPLC,、免疫分析、,CE,残余,DNA,DNA,杂交、紫外光谱、蛋白结合,蛋白变异,肽谱、,HPLC,、等电点聚焦、,CE,甲酰基甲硫氨酸,肽谱、,HPLC,、等电点聚焦、,CE,甲硫氨酸氧化,肽谱、氨基酸分析、,HPLC,、质谱、,Edman,分析,产物变性或聚合脱氨基,SDS-PAGE,、凝胶 排阻色谱、,IEF,、,CE,、,HPLC,、质谱、,Edman,分析,单克隆抗体（亲和配基脱落）,SDS-PAGE,、免疫分析,氨基酸取代,氨基酸分析、肽谱、,CE,、质谱、,Edman,分析,污染物,微生物,微生物检查,支原体,微生物检查,病毒,微生物检查,基因工程产物的常见杂质和污染物及其检测方法,鲎（,hu,）试剂检测内毒素,美国鲎,亦称马蹄蟹。肢口纲剑尾目海生节肢动物，共,4,种，见於亚洲和北美东海岸。虽又称马蹄蟹，但不是蟹，而与蝎、蜘蛛以及已绝灭的三叶虫有亲缘关系,检测原理：来源于鲎血液中的循环变形细胞的凝固蛋白接触内毒素时，会发生凝胶化反应,五 产品的保存,目的产物的时候受多种理化因素的影响，保存时间要根据其不同的特征，采取不同的措施，防止变性、降解、保户其活性,第十二节 基因工程药物的质量控制,1,液态保存,低温保存：,-20,-10,下保存,在稳定,pH,下保存：目的蛋白稳定的,pH,范围内,高浓度保存：蛋白质在高浓度溶液中比较稳定,加保护剂保存：加入一些稳定剂，防止蛋白变性，如糖类、脂肪、多元醇等；有时候还可加入一些中性盐，稳定这些蛋白质,2,固态保存,固态保存比液态稳定，蛋白质含水量超过,10%,就容易失活，含水量在,5%,时，在室温或冰箱中保存均比较稳定,长期保持的最好办法是制成干粉或晶体,冷冻干燥法：,具有保持产品稳定、抑制微生物生长和酶的降解，使之可长期保存，非常适合于制备有热敏性和黏稠性特点的生物物质的干燥，是制备生物制品的常规方法,第十三节 基因工程药物制造实例,1.,基因工程用于生产蛋白质类药物,治疗糖尿病的,胰岛素,，是一种,51,个氨基酸残基组成的蛋白质,1982,年美国,EliLilly,公司推出基因工程制造的人胰岛素，商品名为,(Humulin),。,干扰素,用于治疗肝炎等病毒感染性疾病，有良好疗效,1,升发酵液中所得的干扰素相当于过去从,1000,升人血中所得。生产成本也大为降低,目前用基因工程生产的蛋白质药物已达数十种，许多以前本不可能大量生产的,生长因子，凝血因子,等蛋白质药物，现在用基因工程办法便可能大量生产。,2.,基因工程用于疫苗生产,常用的制备疫苗的方法,一种是,弱毒活疫苗,，一种是,死疫苗,。两种疫苗各有自身的弱点。活疫苗隐含着感染的危险性。死疫苗免疫活性不高，需加大注射量或多次接种。,利用基因工程制备,重组亚基疫苗,，可以克服上述缺点，,亚基疫苗指只含有病原物的一个或几个抗原成分，不含病原物遗传信息,。,重组亚基疫苗就是用基因工程方法，把编码抗原蛋白质的基因重组到载体上去，再送