non-coding-RNA——现代分子生物学课程.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,精选课件,精选课件 1,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,单击此处编辑母版标题样式,精选课件,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,精选课件,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,*,精选课件,精选课件 1,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,精选课件,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,*,精选课件,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,*,精选课件,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,*,精选课件,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,精选课件,Noncoding RNA,海南大学,园艺园林学院,1,精选课件,1,2,精选课件,RNA,的研究进展,RNA,组学：通过对 R N A的研究所取得的巨大成果而形成了 R N A组。,RNA研究已有百余年的历史，其间有两个阶段时期。,第一个阶段：20世纪的 50 60年代，各种,RNA,开始被发现，但对,RNA,的认识还不深入。,第二个阶段：20世纪的 80年代，,RNA,的功能逐渐被发现，越来越多的研究表明,RNA,在遗传方面的重要作用。,3,精选课件,Non-coding RNA,（非编码,RNA,）,非编码RNA是指不编码蛋白质的RNA。其中包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA 和microRNA 等多种已知功能的 RNA，还包括未知功能的RNA。这些RNA的共同特点是都能从基因组上转录而来，但是不翻译成蛋白，在RNA 水平上就能行使各自的生物学功能了。,4,精选课件,分类,非编码RNA 从长度上来划分可以分为3类：,小于50 nt，包括microRNA，siRNA，piRNA；,50 nt到500 nt，包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，SLRNA，SRPRNA 等等；,大于500 nt，包括长的mRNA-like 的非编码RNA，长的不带polyA 尾巴的非编码RNA等等。,5,精选课件,根据亚细胞定位可将非编码 RNA 分为：,细胞核非编码 RNA,与,细胞质非编码 RNA,。,根据是否具有polyA尾结构可将非编码RNA分为,具有polyA 尾的非编码 RNA(polyA-plus ncRNAs),和,不具有 polyA 尾的非编码 RNA(polyA-minus ncRNAs。,根据转录本的长度可将非编码 RNA 分为,小非编码 RNA,和,长链非编码 RNA。,6,精选课件,分类,根据生物学功能可将非编码 RNA 分为：,持家非编码 RNA,和,调控性非编码 RNA,。,持家非编码RNA,主要包括核糖体 RNA(rRNA)、转运 RNA(tRNA)、小核 RNA(snRNA)、小核仁 RNA(snoRNA)、引导RNA(gRNA)和端粒酶 RNA;,调控性非编码RNA,主要包括小干扰 RNA(siRNA)、微小 RNA(microRNA)、与 Piwi蛋白相互作用的 piRNA 和长链非编码 RNA(lncRNAs)。,7,精选课件,分类,调控非编码,RNA,：,长链非编码,RNA（,lncRNA,）,短链非编码,RNA,（,siRNA,、,miRNA,、,piRNA,）,非编码,RNA,看家非编码,RNA,8,精选课件,调控非编码,RNA,长链非编码,RNA（,lncRNA,）,长链非编码RNA通常是指长度大于200个核苷酸的非编码 RNA 转录本。该概念是在 2002 年由日本科学家首次提出,他们在小鼠全长 cDNA 文库的大规模测序中,鉴定了大量较长的非编码RNA转录本。,短链非编码 RNA（,siRNA,、,miRNA,、,piRNA,）,它们的转录本序列都比较短，不超过 40 nt 短链非编码 RNA 分子虽小，却参与了包括细胞增殖、分化、凋亡、细胞代谢以及机体免疫在内的几乎所有生命活动的调节和控制，在生命体内扮演着至关重要的角色。,9,精选课件,长链非编码,RNA（,lncRNA,）,lncRNA不参与或很少参与蛋白编码功能,位于细胞核内或胞浆内。,近年来的研究表明，lncRNA参与了X 染色体沉默、染色体修饰和基因组修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等过程，其调控作用正在被越来越多的人研究。,10,精选课件,1.,编码蛋白的基因上游启动子区转录，干扰下游基因的表达；,2.,抑制,RNA,聚合酶,II,或者介导染色质重构以及组蛋白修饰，影响下游基因的表达；,3.,与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，干扰,mRNA,的剪切，形成不同的剪切形式；,4.,与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，在,Dicer,酶的作用下产生内源性,siRNA,；,5.,与特定蛋白质结合，,lncRNA,转录本可调节相应蛋白的活性；,6.,作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；,7.,结合到特定蛋白质上，改变该蛋白质的细胞定位；,8.,作为小分子,RNA,（如,miRNA,、,piRNA,）的前体分子。,11,精选课件,RNA(smallnoncodingRNA),miRNA(microRNA),siRNA(smallinterferingRNA),piRNA(piwi-interactingRNA),esiRNA(endogenoussiRNA),12,精选课件,siRNA,siRNA:是一类外源性的双链小分子RNA，它的长度一般为2125 nt。它在RNA干扰途径中通过引导目的基因mRNA的降解，以抑制mRNA的表达。,siRNA也可经由多种不同转染（transfection）技术导入细胞内，并对特定基因产生具专一性的基因敲除（knockdown）效果，这使siRNA成为研究基因功能与药物目标的一项重要工具。也参与一些与RNAi相关的反应途径，例如抗病毒机制或是染色质结构的改变。,13,精选课件,miRNA,概念：miRNA是长约2125nt的单链RNA,其中50%定位于易发生结构改变的染色体区域。,特点：miRNA 是内源性的,是生物体基因的表达产物;miRNA 是由不完整的发卡状双链 RNA,经 Drosha 和 Dicer 酶加工而成。,14,精选课件,piRNA,piRNA 是近年来在哺乳动物细胞内发现的长度约为 2431 nt 的 RNA 分子,因在生理状态下能与piwi蛋白偶联,故命名piRNA。,由于 Piwi 为一表观遗传学调控因子,能与 PcG 蛋白共同结合于基因组 PcG 应答元件上,协助 PcG 沉默同源异型基因,因此推测与 Piwi相关的 piRNA 也应具有表观遗传学的调控作用,15,精选课件,piRNA,的形成及扩增,piRNA前体与,piwi,蛋白结合后，能在,u,位点进行切割形成,piRNA,反义链，,piRNA,反义链能与转座子识别，并使切割后的转座子与AGO3蛋白结合，从而进一步对转座子进行修饰切割，切割后的转座子可以与,piRNA,前体结合，并且在,U,位点切割前体，从而使切割后的前体与,piwi,蛋白结合，进过剪切修饰形成,PiRNA和PiRNA,与Piwi蛋白结合的复合体，从而使,PiRNA,数量增多。,16,精选课件,非编码,RNA,的比较,17,精选课件,非编码,RNA,的作用,1.,影响染色体的结构,2.,调控转录,3.,参与,RNA,的加工、修饰,4.,参与,mRNA,的稳定和翻译调控过程,5.,影响蛋白质的稳定和转运,6.,在植物适应环境胁迫中的调控作用,7.,在细胞发育和分化中的调控作用,18,精选课件,非编码,RNA,的检测技术,cDNA克隆策略,实时荧光定量（RT-PCR技术）,SAGE技术,微阵列芯片检测技术,Solexa测序法,表面增强拉曼光谱法,19,精选课件,cDNA克隆策略,长度在20500bp的RNA大多为非编码RNA。非编码RNA可将由变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离到的非编码RNA进行逆转录后加上接头，并克隆到标准载体中构建cDNA文库。为防止,5,端丢失常在 3 端加上C-尾巴，在T4RNA连接酶的作用下连上寡聚核苷酸接头，最后对连接产物进行RT-PCR扩增。,cDNA克隆策略可鉴别已知的高丰度非编码RNA，如tRNAs或小核糖体RNA。,20,精选课件,实时荧光定量（RT-PCR技术）,实时荧光定量PCR技术是一种高通量、灵敏的基因表达检测技术，常用于蛋白编码基因表达检测，也被广泛地应用于microRNA或其他非编码RNA的表达检测。,通过该技术，可定量监测目的基因的表达情况，筛选生物学功能相关的非编码RNA。,21,精选课件,SAGE技术,SAGE是一种高通量的研究技术，通过逆转录得到 c D N A,从而获得 S A G E 双标签,然后,通过连接、扩增双标签片段并进行克隆、测序，以同一标签在某组织中出现的频率，反映该标签所代表的基因在该组织中的表达丰度。,与微阵列芯片技术相比，SAGE可在未知任何基因或EST序列的情况下，对靶细胞进行研究，具有显著的优越性。,22,精选课件,微阵列芯片检测技术,微阵列芯片以高密度阵列为特征，在微阵列上固定大量探针分子，并将标记样本与微阵列探针进行杂交。通过检测杂交信号的强度，研究不同样本中特异基因的表达丰度，从而较为全面地比较不同样本中基因表达水平的差异。,被广泛用于mRNA的研究，也被用于非编码RNA的发现与表达分析。,23,精选课件,Solexa测序法,Solexa测序法是新发明并迅速得到广泛应用的一种高通量基因表达检测技术，该方法是利用单分子阵列来测定基因的表达情况。,首先，,将核酸从细胞中提取，将其片段化为100200碱基大小，分别连上接头，经接头引物的PCR扩增后制成文库；,然后，,将已加入接头的核酸片段固定在含有接头的芯片上，经反应后，将不同片段扩增。,在每个循环中，利用边合成边测序的原理，在单分子阵列中加入4种荧光标记染料的核苷和聚合酶，在酶的作用下，每个单链DNA分子通过互补碱基的配对被延伸，通过CCD采集荧光信号，快速扫描整个阵列，检测特定的结合在每个片段上的碱基，从而进行基因转录本的测序。,24,精选课件,尽管Solexa测序技术以高效率、高精确鉴定miRNA著称，但相对于传统、普遍使用的miRNA定量方法还存在一定的不足，这可能是由于测序深度不足，或一些microRNA存在特殊修饰而带来的问题。,25,精选课件,表面增强拉曼光谱法（,SERS,）,利用水的拉曼散射很微弱这一特点，高灵敏度和特异性的SERS检测技术逐渐成为研究水相中的生物和化学样品的理想工具，应用于病毒、细菌、蛋白和核酸等生物样品的检测。,26,精选课件,克隆非编码RNA的方法,基因克隆法,蛋白质-R N A复合物分离法,27,精选课件,基因克隆法,小鼠脑 组织匀浆 提取总RNA 8%PAGE回收50-110nt（fractional）和 110-500nt（fractional）Poly(A)聚合酶加尾 cDNApSPORTI PCR 高密度陈列 杂交除去高丰度已知的小RNA 未杂交的cDNA测序。,28,精选课件,蛋白质,-,RNA复合物分离法,分离蛋白质,-,RNA复合物，除去蛋白质，纯化RNA分子，反转录cDNA，克隆、测序、结果分析。所得RNA的cDNA分子必须进行Northern杂交，除去断裂的小RNA。,29,精选课件,microRNA,30,精选课件,31,精选课件,32,精选课件,33,精选课件,2001,年命名为,microRNA,2002,年入选为,science,年度十大发现之首,34,精选课件,35,精选课件,36,精选课件,37,精选课件,38,精选课件,39,精选课件,40,精选课件,41,精选课件,42,精选课件,Micro RNA,microRNA（简称miRNA）是一种非编码小RNA分子（约含22个核苷酸，19 25）存在于植物，动物和一些病毒,中，,其功能在RNA沉默和基因表达的转录后调控,。,43,精选课件,miRNA,的特点,单链RNA,19 25nt，非编码RNA,单一的目标miRNA可能,靶向数百个,基因,抑制翻译（动物）或降解靶,RNA,（植物）,对细胞的增殖、分化、凋亡、癌变及病毒感染起调控作用,保守性进化,44,精选课件,3.,miRNA,的鉴定方法和标准,2.,miRNA,的作用机理,1.,miRNA,的产生和特点,3.,miRNA,的鉴定方法和标准,2.,miRNA,的作用机理,1.,miRNA,的产生和特点,第一节,miRNA,的产生和特点,miRNA,的产生：,植物miRNA的形成包括,miRNA基因转录,、,加工成熟,和,功能复合体组配,三个过程。,miRNA,基因转录：,通过RNA聚合酶转录在细胞核中形成初级转录本，称为primary miRNAs（pri-miRNAs）。植物的pri-miRNA通常由腺苷酸开头，具有5 帽子和3-polyA尾，位于一个保守的TATA-box序列的下游40 个核苷酸序列处。,第一节,miRNA,的产生和特点,加工成熟：,植物 miRNA 的加工成熟过程是由存在细胞核内的,Dicer 酶类似物,，在,HYL1蛋白,的协助下，以一种ATP依赖的方式，通过,两次剪切,步骤生成。第一次剪切pri-miRNA后，产生具有茎环二级结构的pre-miRNA，接着在两个蛋白酶HYL1和SERRATE的协助下再次切割pre-miRNA，将miRNA/miRNA*二聚体从pre,-,miRNA 茎环结构的“茎”上剪切下来。miRNA 基因在细胞核中经由RNA聚合酶II进行转录、DCL1剪切后和HEN1介导的甲基化后，由转运蛋白家族中的核质转运蛋白HASTY（HST）从,细胞核,转运到,细胞质,中。,第一节,miRNA,的产生和特点,功能复合体组配：,miRNA/miRNA*二聚体中miRNA链在SDN的诱导下装载进入RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex,RISC），成熟miRNA与ARGONAUTE1（AGO1）蛋白结合，形成非对称的RISC，而miRNA*则被降解。miRNA引导RISC切割目标靶基因mRNA，在转录后水平发挥生物学功能,。,micorRNA的产生,50,精选课件,micorRNA的产生,51,精选课件,micorRNA,的产生,52,精选课件,micorRNA的产生,53,精选课件,RISC,：,RNA-Induced,Silencing Complex,一种多结构域的双链,RNA,专一性,RNase,54,精选课件,miRNA,如何行使功能？,与,mRNA,的,3,端非编码区特定位点,(,其第,28,个核苷酸,),绑定：,与,mRNA,完美互补时,会引发,mRNA,降解,；,不完美的与,mRNA,配对时，会引发转录后的,基因沉默,（,抑制,靶基因的,表达,）,从而抑制或阻止相应的,mRNA,翻译过程。,举例分析：在,DNA,修复通路中行使上述过程,1,）抑制或阻止正常细胞,DNA,修复产生,致癌,作用,2,）抑制或阻止癌细胞,DNA,修复达到,治疗,效果,55,精选课件,植物,miRNA,的特点,植物,miRNA,与动物,miRNA,的相类似特点,(1)miRNA,广泛存在于真核生物中。,(2)miRNA,的长度约为,20,24 nt,。,(3)miRNA,没有开放阅读框,(ORF),及蛋白质编码基因特点。,(4)miRNA,的基因成簇性。,(5)miRNA,的保守性。,56,精选课件,植物,miRNA,的特点,植物,miRNA,与动物,miRNA,的相类似特点,(6)miRNA,表达的时空特异性。,(7),几乎所有的,miRNA,从前体的,1,条臂中加工而来。,(8)miRNA,的,5,端多以,U,开头。,57,精选课件,植物,miRNA,的特点,植物,miRNA,与动物,miRNA,的不同特点,(1)植物miRNA前体的大小变化较大，一般为64303 nt，而动物miRNA前体的变化较小，一般为6075 nt。,(2)植物中的miRNA较动物中的更为保守，它们与互补序列的错配数也少于动物。,58,精选课件,植物,miRNA,的形成,miRNA,成熟所需的酶类,一种多结构域的双链,RNA,专一性,RNase 1II(Dicer,酶、类,Dicer,酶,),和,Argonaute,蛋白。,Dicer,酶包含,4,种结构域：,RNA,解旋酶结构域、,PAZ(PiwiArgonauteZwille),结构域、,2,个,RNase,结构域和,dsRNA,结合结构域,(dsRBD),Argonaute,蛋白具有,PAZ,和,PIWI,结构域。,59,精选课件,植物,miRNA,的作用机制,miRNA的作用方式可根据其与靶基因的互补程度不同而分为两种：转录产物裂解和翻译抑制。,a.当miRNA与靶mRNA完全互补或接近完全互补时，则会切割mRNA；,b.当植物miRNA与靶mRNA不完全互补时，则抑制其翻译。,近年来研究发现，miRNA也可以通过目标染色体位点的甲基化，或通过调控靶mRNA的定位或稳定性在转录水平上发挥作用。,60,精选课件,植物,miRNA,的功能,1,抗生物胁迫,植物中存在一类,miRNA,与多种植物病毒基因完全或不完全互补，推测这类,miRNA,可通过切割病毒基因抑制病毒侵染。,2,抗非生物胁迫,2,1,抗营养胁迫,(1),调节植物磷代谢平衡,Chiou,发现，在磷胁迫下，拟南芥中,miR399,大量表达；而在高磷条件下，未检测到,miR399,的表达。,(2),调节植物硫代谢平衡,miR395,在高硫条件下不表达，在硫缺失胁迫下表达。,61,精选课件,62,精选课件,植物,miRNA,的功能,2,抗非生物胁迫,2,2,抗环境胁迫,miRNA,可以使植物抵抗寒冷、高浓度,ABA,、干旱、高盐等极端自然环境 及抵抗环境引起的自身氧化胁迫。,63,精选课件,64,精选课件,miRNA,的检测,miRNA的获取,miRNA,的确认,miRNA的检测方法,65,精选课件,miRNA,的获取,miRNA,分子的序列短小,1,）在基因组中存在较多的互补序列,2,）在不同生物体内与靶基因结合的方式也不尽相同,3,）通常与多种蛋白相互作用,这使得建立一个有效而且普遍适用的研究方法异常困难。,#,到目前为止,miRBase,上公布的,miRNA,总数将近,3 000,种。,#,现在已知靶基因的,miRNA,多是通过基因克隆和生物信息学筛选的方法发现的。,66,精选课件,miRNA,的获取,基因克隆,1.1,基因克隆,直接克隆的方法通常是从,总,RNA,中提取大约,22 nt,的小,RNA,分子,制备一个小,RNA,的,cDNA,(complementary DNA),文库,。,将文库中的小,RNA,序列与基因组数据库中,BLAST,序列类似性 比对,排除非,miRNA,序列后,通过,Northern,印迹方法,(Northern blotting),得到最终确认,。目前大量的已知,miRNA,都是通过这种方法获得的。,基因克隆方法的优点是对于高丰度或常表达的基因来说,可以获得完整的,miRNA,序列。然而对于另一些,miRNA,它们在生物体内浓度很低,(,表达量低或表达产物极不稳定,或前体到成熟的加工效率低等原因引起,),或者某些只在生物体的特定时期或特定组织器官中表达,直接克隆法则无法获取。,注：,Northern,印迹杂交（,Northern blot,）。这是一种将,RNA,从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。,67,精选课件,miRNA,的获取,生物信息学筛选,1.2,生物信息学筛选,随着生物全基因组测序的完成,利用计算机对基因组序列进行搜索可以大大提高,miRNA,的鉴定效率。所以,人们,根据目前已知的,miRNA,基因序列总结它们的特征和规律,编写了一些计算机程序,通过对生物基因组数据库进行搜索,可以找到那些可能为,miRNA,的基因序列,然后通过,Northern blotting,来筛选真正的,miRNA,基因。,生物信息学方法是依据在不同的物种中，其,成熟的,miRNA,具有较大的序列同源性以及前体的茎环结构具有相当大的保守性,这一特征在基因组数据库中搜索新的,miRNA,基因。该方法根据比较基因组学原理并结合生物信息软件在已测序基因组中进行搜索比对，,根据同源性的高低再进行,RNA,二级结构预测,，,将符合条件的候选,miRNA,与已经通过实验鉴定的,miRNA,分子进行比较分析,，,最终确定该物种,miRNA,的分布及数量,。近年来随着,miRNA,预测方法的不断发展，人们发现的,miRNA,数量呈几何级数增长。这些预测方法从简单的序列比对搜索发展到现在的机器学习算法，程序设计越来越智能化，复杂化。,68,精选课件,miRNA,的获取,生物信息学筛选,随着人,miRNA,基因转录出的,pri-miRNA,迅速加工成具有茎环结构的,pre-miRNA,，随后被切割成,miRNA,：,miRNA*,双体，并被选择性地组合进核糖核酸沉默诱导复合体（,RISC,）并进行靶基因识别。在相似的物种中，,miRNA,是很保守的；但在相距较远的物种间，,miRNA,又有一定的分歧，尤其体现在,pre-miRNA,上。这些,miRNA,功能作用机制的阐明为预测软件的研发提供了理论依据，但仍需要不断修补和完善。近年来，几个基于这些规则的,miRNA,预测程序先后被开发（下表），并被广泛使用。,生物信息学手段可以说是一种更高通量的方法。通常有以下几种方法,:,Mirscan,是一种基于二级结构的预测程序,通过扫描两种系之间是否存在同源的茎环结构,应用于检测,脊椎动物和线虫,的候选基因。,69,精选课件,miRNA,的获取,生物信息学筛选,Mirseeker,是一种检查,RNA,序列茎环结构的预测程序,应用于筛选,昆虫,的候选基因。,它是根据,3,个标准来预测的,:,一是具有长度为,70,100 nt,茎环结构的,Pre-miRNA;,二是不同种系生物中,Pre-miRNA,的保守性,;,三是,miRNA,的核苷酸差异性。,ERP IN,是一种类似于,BLAST,的校对程序,用于搜寻,动物,基因组中与,miRNA,序列类似的序列。,MiPred,可以通过,random forest,预测模型和,miRNA,特征的结合,区分,miRNA,的真正前体和假冒前体。,70,精选课件,71,精选课件,72,精选课件,miRBase,序列数据库,miRBase,序列数据库是一个提供包括,miRNA,序列数据、注释、预测基因靶标等信息的全方位数据库，是存储,miRNA,信息最主要的公共数据库之一。,miRBase,提供便捷的网上查询服务，允许用户使用关键词或序列在线搜索已知的,miRNA,和靶标信息，详情请（,www.mirbase.org/,）。,2012,年,8,月,1,日正式发布。相比于以往版本的数据库（,Sanger microRNA,序列数据库），,19.0,版数据库进行了巨大的数据更新：,miRNA,发夹前体序列已升至,21264,条，新增,3171,条；成熟,miRNA,升至,25141,条，新增,3625,条；已发布的,miRNA,序列共涵盖,193,个物种，相比于,18.0,版新增,25,个物种。新版数据库对,miRNA,序列注释和命名进行了系统的修正，,miR*,命名已经终止使用，取而代之的是,-5p,和,-3p,的命名法。,73,精选课件,miRNA,的确认,判断标准,:,能够通过与特定大小的总,RNA,样品杂交得到,22,个碱基对,(,22nt),的产物,(,即需要,Northern,杂交或引物延伸反应验证表达,),。,所得的序列是从特定大小的,(,22nt),的小分子,RNA,库中克隆到的,并且必需与克隆的来源物种的基因组序列完全匹配。,经过前体的二级结构预测,有发夹状的二级结构,并且成熟的,miRNA,序列在发夹的一条臂上。,成熟的,miRNA,序列与预测的二级结构在不同物种间有保守性。,在,Dicer,突变的系统中,前体的积累增多。,要确认基因克隆获得的或生物信息学分析预测的基因是否为真正的,miRNA,就应该采用上面,5,个原则来检验,。,74,精选课件,miRNA,的检测方法,要了解,miRNA,在基因调控中扮演的角色,很关键的一个方法就是迅速、准确地定量检测,miRNA,基因的表达。检测,miRNA,的方法主要有以下几种,:,Northern blotting,是现在检测,miRNA,表达最主要的手段,所有克隆和生物信息学分析得来的,miRNA,都需要经过,Northern blotting,来,验证和确认,。,这种方法的缺点在于灵敏度较低且不能进行高通量的检测。,75,精选课件,miRNA,的检测方法,RT-PCR,（,reverse transcription PCR,，反转录,PCR,）也被用来检测,miRNA,前体的表达水平,但,miRNA,前体的表达水平并不一定和成熟,miRNA,的表达水平一致。因此,在,RT-PCR,的基础上,人们改进了一些技术,从而使得能够检测低表达量的,miRNA,。,实时荧光定量,PCR(real-time PCR),可以很精确的定量分析,miRNA,的表达,也经常用于验证预测的,miRNA,。,引物延伸法,就是在引物的,5,末端加一个特异标记,可以定量测定低丰度的,RNA,含量。,原位杂交技术,可以方便的检测,miRNA,的时空表达的差异。,原位杂交,是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。另有荧光原位杂交。,76,精选课件,miRNA,的检测方法,芯片技术,(mi-croarray),是一种更快、更广泛、更有前途的研究,miRNA,表达的方法。,Liu,等最先发表了关于微点阵能够获得高通量的结果。这些结果显示了组织特异性,miRNA,的表达标记,而且通过,Northern blot,和,real-time PCR,进行了验证。,芯片技术固然以其高通量和并行处理的特点在基因信息分析中占据重要地位,但信息量大并不等于质量高。实际上,基因芯片的一个突出弱点就是其信息质量的稳定性和可重复性比较差,且无法实现定量检测,因此后来又出现了多种改进的芯片技术,其中现在流行的就是液相芯片技术。,液相芯片,(liquichip),是美国纳斯达克上市的,Luminex,公司研制出的新一代生物芯片技术,它既能为后基因组时代科学研究提供强大的技术支持,又能提供高通量的新一代分子诊断技术平台。,77,精选课件,miRNA,的识别,多个研究小组采用生物化学结合是生物信息学的方法开展对,miRNAs,的研究工作。由于据推测都是由,Dicer,酶降解,RNA,得到的，,2123,个碱基大小、有,5,端磷酸基和,3,羟基的,RNA,片断，有的实验室采用,改良的定向克隆方法,来筛选具有相同特征的小分子,1.,筛选一定大小的,RNA,分子，连接到,3,和,5,的适配子,(adapters),2.,逆转录,3.,通过,PCR,扩增,4.,亚克隆,5.,测序。,在分子克隆中指从大片段的克隆中选取特定小片段再克隆,/subclone,78,精选课件,miRNA,前体在基因组上的定位和聚类是通过向基因组数据库查询进行。这个方法有助于判断,miRNAs,是否是,mRNAs,、,tRNAs,、,rRNAs,等分子的降解产物,。,生物信息学的方法被鉴别出来，已经鉴别出来的,miRNAs,只不过是沧海一粟，由于很多已经鉴别出来的,miRNAs,是从单个克隆中鉴别出来的，所以可以假设还有很多,miRNAs,在分离和鉴定过程中被“漏掉”了，测序工作还远远不够。,79,精选课件,miRNA,的靶基因,miRNA,的靶基因预测,miRNA,的靶基因检测,miRNA,的生物学功能,80,精选课件,miRNA,的靶基因预测,以前,研究,miRNA,的靶基因依赖于正向遗传学方法,包括突变体的产物、变形筛选、定位克隆和,miRNA,及其靶基因的确认,如,lin24,和,let27,及它们的靶基因的发现。在果蝇中,miRNA bantam,及其靶基因,hid,的发现就是正向遗传学研究,miRNA,的经典过程。,反向遗传学联合生物信息学的方法比正向遗传学更优越。,它主要是由软件来预测,miRNA,的靶基因并为分子实验提供指标，其基本原理是基于,miRNA,与其靶基因的自然配对。已知,miRNA,及其靶基因之间的对比和相关性,lin24,、,let27,和,bantam,基因的确认等都为计算机程序发展提供了更多的信息。,计算机程序预测方法在植物种属中运用的很成功,而在动物中则不是很成功,这可能是因为植物中的,miRNA,与其靶基因几乎完全配对结合。而在动物中,miRNA,与靶基因,mRNA,通常以不精确的碱基互补配对结合。,81,精选课件,miRNA,的靶基因预测,miRNA,的研究意义之重大是毋庸置疑的。然而，与新的,miRNA,的频频发现相比，,miRNA,的功能研究相对缓慢。,到目前为止，,在发现的,4449,多个,miRNA,中，确定功能的,miRNA,仅有几十个。,导致,miRNA,功能研究进展缓慢的非常重要的原因是,miRNA,的作用靶标难以确定,。,通过实验方法确定,miRNA,的作用靶标非常耗时，目前尚无高通量的靶标鉴定方法。,因此，通过理论方法预测,miRNA,的作用靶标成为当前识别,miRNA,作用靶标的较为理想的途径。以下重点介绍几种经典预测软件的算法分析，其他软件（见下表）：,82,精选课件,miRNA,几种常见的预测方法,下面概括介绍几种常见的预测方法：,()miRanda.,miRanda,是最早的一个利用生物信息学对,miRNA,靶基因进行预测的软件,由,Enright,等人于,2003,年设计开发,.,其对,3UTR,的筛选依据主要是从序列匹配、,miRNA,与,mRNA,双链的热稳定性以及靶位点的保守性三个方面进行分析,.,miRanda,软件首先选取了黑腹果蝇,(Drosophila melanogaster),中已知的,73,条,miRNA,作为探针,采用类似于,Smith-Waterman,的算法对,9805,个,3UTR,进行碱基互补分析,.,首先,互补参数被设定为,:G,C,A,U,为,+5,G,U,为,+2,其他配对方式为,3,同时起始空位,(gap-opening),罚分为,8,延伸空位,(gap-extension),罚分为,2;,*,序列比对,就是通过一定的算法对两个或多个序列进行比较,找出序列间最大的相似性匹配。,*,Smith&Waterman,算法,是一种经典的序列比对算法,在双序列比较的情况下具有比较好的速度和结果,但是在进行序列数据库搜索时则显得处理速度不足。,83,精选课件,miRanda,其次,为体现与靶基因作用过程中,miRNA5,端和,3,端的不对称性,5,端的前,11,个碱基的互补分值,(complementarity scores),将乘以一个,scale,参数,;,最后,miRNA,与靶,mRNA,的互补还要遵循以下,4,个规则,:,miRNA,第,24,位碱基和靶基因精确匹配,;,第,312,位碱基和靶基因错配不得多于,5,个,;,9L-5(L,为,miRNA,总长,),位碱基最少一个错配,;,最后,5,个碱基错配不得多于,2,个,.,84,精选课件,miRanda,在热稳定性方面,miRanda,采用,Vienna,软件包计算,miRNA,与,3UTR,作用的自由能,(G).,在物种间保守性方面,要求靶位点在多物种,3UTR,比对中相同位置处碱基相同,.,综合以上,3,条原则,miRanda,选取每条,miRNA,相对的,3UTR,中排名前,10,位的基因,作为,miRNA,的候选靶基因,对于多个,miRNA,对应于同一靶位点的情况,miRanda,则使用贪心算法,(Greedy Algorithm),选取其中得分最高且自由能最低的那一对,.,85,精选课件,TargetScan,()TargetScan,和,TargetScanS.,TargetScan,是,Lewis,等人在,2003,年开发的一款用于预测哺乳动物,miRNA,靶基因的软件,该软件将,RNA,间相互作用的热力学模型与序列比对分析相结合,预测不同物种间保守的,miRNA,结合位点,.,与,miRanda,不同,在,TargetScan,的算法中,要求,miRNA5,端,第,28,位碱基与,mRNA,的,3UTR,完全互补,这,7,个核苷酸被称作“,miRNA,种子区,/,关键区”（,seed region,）,.,种子区向两侧延伸直到出现碱基错配为止,这期间允许,G,U,配对,同时利用,RNAFold,计算结合位点的自由能,.,TargetScan,中引入了,信号噪声比,来评估预测结果的准确度,所谓信号噪声比即用已知,(,信号组,),和随机生成的,miRNA(,噪声组,),分别对,mRNA,的,3UTR,进行预测,所得靶基因数目的比值,.,86,精选课件,当仅针对人,(Homo sapiens),和小鼠,(Mus musculus),的,3UTR,对,miRNA,靶位点进行预测时,信号噪声比为,2,1,针对人、小鼠、大鼠,(Rattus norvegicus),的,3UTR,进行预测时信号噪声比为,3.2,1,研究范围扩大到人、小鼠、大鼠和河豚,(Takifugu rubripes),时,信号噪声比为,4.6,1.,随着物种数目的增多,预测得到的靶基因减少,但准确性得到了相应的提高,.,87,精选课件,TargetScanS,后来,Lewis,等人又对,TargetScan,进行了优化,即,TargetScanS.,TargetScanS,在人、小鼠、大鼠的基础上增加了狗,(Canis familiaris),和鸡,(Gallus gallus),的基因组数据,同时在算法上做了改动,将种子区由先前的,7,个核苷酸调整为,5,端第,27,位碱基共,6,个核苷酸,要求在种子区完全互补的情况下,miRNA,第,8,位碱基与靶基因互补或者,miRNA,第,1,位碱基是腺嘌呤,.,2007,年,Andrew,等人又将,TargetScanS,的算法中加入了新的条件,1,）即有效的,miRNA,结合位点多分布于,3UTR,中,AU,富集的区域,2,）功能上具有协同作用的,miRNA,靶位点相近,3,）,miRNA,的第,1217,个核苷酸与,3UTR,互补促进两者的结合,4,）有效的,miRNA,结合位点优先分布于,3UTR,的两侧,但距离终止密码子至少,15,个核苷酸,.,88,精选课件,动物中靶基因预测方法,89,精选课件,扩展,miRNA,命名,物种缩写,癌基因和相关,miRNA,的特征,基因数据库,Blast,简介,cancer genetics web,miRanda,应用,90,精选课件,miRNA,命名,(1)miRNA简写成,miR,-No.,它的基因简写成,mir,-No.如miR-21；,(2)高度同源的,miRNA,在No.其后加英文字母(小写,一般从a开始,),如miR-199a 和miR-199b；,(3)由不同染色体上的DNA序列转录加工而成的具有相同成熟体序列的,miRNA,，则在后面加上阿拉伯数字以区分,如miR-199a-1和miR-199a-2；,(4)如果一个前体的2个臂分别加产生,miRNA,，则根据克隆实验，在表达水平较低的,miRNA,后面加“*”，如miR-199amiR-199a*，或进行如下命名，miR-142-5