WESTERNBLOT操作步骤图PPT课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,WESTERN BLOTTING,过程图解,1,图中绿色的是夹玻璃片的架子,2,玻璃板对齐后放入架中，把两侧的夹子卡紧。要使短玻璃靠外，长玻璃靠内。,3,然后垂直卡在架子上准备灌胶。操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。图示两块玻璃板放在一个架子上。,4,配10分离胶，加入,TEMED,后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10,ml,枪吸取5,ml,胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。,加水液封时要很慢,，否则胶会被冲变型。）,5,当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3,min,使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。,按前面方法配4的浓缩胶,加入,TEMED,后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。,6,均匀插入梳子,7,梳子已经插好。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。,8,浓缩胶干后，用手拿住梳子的两边均匀用力，拔起梳子,9,将玻璃板从夹子上取下，用水冲一下,10,将玻璃板放入电泳槽中。小玻璃板面向内，大玻璃板面向外,11,插入另一块玻璃板，也是小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外,12,两块玻璃板都放好后夹紧（拇指按下夹子）,13,放入电泳槽中,14,向内槽中加电泳缓冲液，如果不漏，在向外槽中加，如果漏，就要重新把玻板查好，使内外不交通。电泳液至少要漫过内侧的小玻璃板,。,15,测完蛋白含量后，,所有蛋白样品调至等浓度后上样。,取出上样样品至0.5,ml,离心管中，加入5,SDS,上样缓冲液至终浓度为1,。（上样总体积一般不超过15,l，,加样孔的最大限度可加20,l,样品。）上样前要将样品于沸水中煮5,min,使蛋白变性。加足够的电泳液后开始准备上样。用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染,16,电泳时间一般1-2,h，,电压为100,V,较好，也可用60,V。,电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳。,17,取出转移槽,18,2025/12/20 周六,可编辑修改,19,取下玻璃板,20,两块玻璃板都已经取下,21,要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）,22,将浓缩胶（浓缩胶影响操作）和分离胶上不用的部分切去,23,在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜，将夹子打开使白的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。,24,在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。依次加膜、加胶，再在膜上盖3张滤纸并除去气泡。,25,最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。,26,合起夹子,27,将夹子放入转移槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。,28,电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。,29,加上转移缓冲液,30,盖上盖子,放入乘有水的水槽中,水槽中加冰袋,31,电转移200,mA 2-3h,后，打开盖子，取出夹子,32,打开夹子，取出膜，如果所用,marker,是预染,marker,可见,marker,已经转移到膜上,如果不是预染,marker，,可以把膜转完后将膜用1,丽春红染液染5,min，,于脱色摇床上摇，然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。,33,将膜用,TBS,从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中,34,室温下脱色摇床上摇动封闭1,h。,35,按所需稀释浓度滴加一抗（直接加在封闭液里）4 过夜或37 3,h。,36,第二天取出膜，用,TBST,洗三次每次10,min，,然后加入,TBS,液中，按稀释浓度滴加二抗。室温孵育1,h,再用,TBST,洗三次每次10,min。,最后,DAB,显色或者化学发光法显影。,37,2025/12/20 周六,可编辑修改,38,