蛋白质相互作用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,蛋白质相互作用的研究方法,DNA,mRNA,蛋白质,转录,翻译,基因,蛋白质,细胞特异性基因表达,生理状态,蛋白质相互作用,温度,应激状态,培养条件,药物作用,数量有限,结构相对稳定,复杂性,多变性,直接反应生命现象,复杂的调控,人类蛋白质组相用,有一些蛋白质可以以,单体,的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和,伴侣分子,或是与,其他蛋白质,一起发挥作用的。,蛋白质核酸间相互作用研究,蛋白质蛋白质,蛋白质,-,蛋白质相互作用的形式,1,、蛋白质亚基的聚合,2,、交叉聚合,3,、分子识别,4,、分子的自我装配,5,、多酶复合体,蛋白质之间的相互作用力,氢键,范德华力,疏水键,离子键,免疫共沉淀,荧光共振转移技术,噬菌体展示技术,酵母双杂交技术,基因外抑制子,合成致死筛选,分子生物学方法,亲和印迹,Pull down,试验,遗传学方法,蛋白质相互作用研究方法,生物物理学方法,融合蛋白,pull-down,实验,融合蛋白,pull-down,技术基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上,(,如,Sepharose),当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的,“,杂质,”,则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。,洗脱,（,2,）,结合,（,3,）,检测,（,6,）,收集,（,5,）,洗脱,（,4,）,固定诱,饵蛋白,（,1,）,为了更有效地利用,pull-down,技术，可以将待纯化地蛋白以融合蛋白地形式表达，即将,“,诱饵,”,蛋白,与一种易于纯化地,配体蛋白,相融合。,GST Pull-down,方法 此方法的基本原理是：利用重组技术将诱饵蛋白与,GST,（,Glutathione S,transferase,）融合，融合蛋白通过,GST,与固相化在载体上的,GTH,（,Glutathione,）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离,一是鉴定与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质,二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用,实验方法：,1,）,GST,融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（,a,单一明确的重组蛋白；,b,，细胞裂解蛋白混合液；,c,体外翻译,cDNA,表达得到的未知蛋白）,2,）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应,4,C 2h,3,）离心弃上清,4,）沉淀加入,2,蛋白,Loading Buffer,煮沸，离心,5,）取上清进行,SDS-PAGE,电泳，,6,）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确 定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做,Western Blot,来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白,该实验设立,GST,对照，反应均在,4,C,进行,GST-Pulldown Assay,GST pull-down assay,GST-fusion protein,GST alone,免疫共沉淀,(co-IP),技术,基于与蛋白质,X,与,Y,的生理性相互作用，如果用蛋白,X,的抗体免疫沉淀,X,，则蛋白质,Y,也可能沉淀下来。,Y,的这种免疫沉淀被称为,免疫共沉淀,(co-immunocipitation,Co-IP),，此法最常用于测定两种目标蛋白质在体内的结合。,Y,A,B,Y,裂解细胞,免疫共沉淀蛋白质,X,免疫共沉淀（,Co-Immunoprecipitation,）是以,抗体和抗原之间的专一性作用,为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。,是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。,原 理,当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质,x,的抗体免疫沉淀,x,，那么与,x,在体内结合的蛋白质,y,也能沉淀下来。这种方法常用于,测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。,原 理,Co-IP,工作示意图,Co-immunoprecipitation,binding,wash,elution,Y,Y,Y,Y,Y,收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解,30min,细胞裂解液于,4,c,，最大转速离心,30 min,后取上清；,取少量裂解液以备,western blot,分析，剩余裂解液加,1g,相应的抗体加入到细胞裂解液，,4,c,缓慢摇晃孵育过夜；,取,10l protein a,琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗,3,次，每次,3,000 rpm,离心,3 min,；,将预处理过的,10l protein a,琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中,4,c,缓慢摇晃孵育,2-4h,，使抗体与,protein a,琼脂糖珠偶连；,免疫沉淀反应后，在,4,c,以,3,000 rpm,速度离心,3 min,，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用,1ml,裂解缓冲液洗,3,4,次；最后加入,15l,的,2,sds,上样缓冲液，沸水煮,5,分钟；,sds-page,western blotting,或质谱仪分析。,实验步骤,利用,western blot,确定捕获蛋白,通过质谱确定捕获的蛋白,实验注意事项,（,1,）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（,np40,或,triton x-100),。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（,0.2 sds),，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的,cocktailer,。,（,2,）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用,（,3,）使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的,IgG,或另一类单抗；兔多克隆抗体：正常兔,IgG,(4),确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；,(5),要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；,(6),确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。,优 点,相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；,蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；,可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。,缺 点,可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用,两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；,如用,western blot,检验，必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果,。,实验的关键,实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在,IP,反应。建议仔细检查,抗体,的说明书。特别是多抗的特异性是问题。,为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。,考虑抗体,/,缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在,beads,上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。,Yeast Two Hybrid Assay,Benefits:,Simple,Inexpensive,Scalable and automatable,酵母双杂交,酵母双杂交系统,常用的,DNA,结合结构域,:,GAL4,（,1-147,）,LexA,（,E.coli,转录抑制因子）,常用的转录激活结构,:,GAL4,（,768-881,）,B42,（,E.coli,）,VP16,（,疱疹病毒,）,酵母或大肠杆菌的转录因子,(Gal4,、,LexA),的,DNA,结构域可以将一个与其融合的蛋白质分子,X(,诱饵,),带至报告基因的上游激活序列,(UAS),，并与之结合；,与转录因子的转录激活结构域,(,来自,Gal4,或,VP16),融合的蛋白质分子,Y(,靶蛋白,),，可通过其与,X,蛋白质的相互作用，将激活结构域带至报告基因的调控区；,DNA,结合结构域和转录激活结构域在空间上的靠近，重建了转录因子的功能，激活了下游报告基因的表达，表现为酵母可以在特定的缺省培养基上生长，或在有底物,X-gal,时，形成蓝色菌落,工 作 原 理,表达诱饵蛋白的载体，诱饵即我们感兴趣的蛋白，它和,DNA,结合结构域融合。,表达靶蛋白的载体，靶蛋白可以是一个已知的蛋白，也可以是,cDNA,或基因组文库编码的蛋白。靶蛋白和转录激活结构域融合。,一个或多个报告基因,(,如控制氨基酸合成的基因、大肠杆菌的,lacZ,基因等,),，位于,DNA,结合结构域识别的调控区的下游。,三个基本组成部分,Applications of YTH,高灵敏度地检测蛋白蛋白的相互作用,确定蛋白相互作用的结构域或重要活性位点,寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白,寻找具有药物治疗作用的小分子肽,寻找控制蛋白相互作用的化合物,蛋白相互作用图谱的绘制,Sources of yeast two-hybrid system,Matchmaker Yeast Two-hybrid System 3,DNA-BD:Amino acids 1-147 of the yeast Gal4 protein,binding to the Gal UAS upsream of the report genes,AD:Amino acids 768-881 of the Gal4 protein,a transcriptional activator,Reporter constructs in yeast strains AH109 and Y187,Sequence of the Gal4 DNA-BD recognition sites,MATCHMAKER Yeast Two-hybrid System 3 Vectors,LacZ,Gal4,激活域,Gal4,结合域,Gal4,结合域,LacZ,LacZ,Gal4,激活域,LacZ,Gal4,激活域,Gal4,结合域,X,Y,X,Y,Overview of performing a yeast two-hybrid screen,Protein interactions indicated by a YTH screen,False positives should be eliminated,Step 1:double screens avoid false positives,Step 2:independent validation of interaction,Pull-down assays(affinity isolation),Co-localization of protein expression,Verification of putative positive clones,Verification of putative positive clones(cond),Yeast mating to verify protein interactions,Genome Scale Yeast Two Hybrid Assay,Uetz,2001,Red:positive screen 1,Green:positive screen 2,Yellow:positive for both,Interactions in the yeast proteome,EXAMPLE,1,）已知蛋白之间相互作用的检测：,2,）蛋白质的功能域研究：通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检测是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨基酸；,3,）克隆新基因和新蛋白：将感兴趣的蛋白质基因与,BD,基因构建成,“,诱饵,”,表达质粒，将某一器官或组织的,cDNA,文库与,AD,基因构建成,“,猎物,”,基因库，共转化酵母细胞，可筛到与感兴趣蛋白质相互作用的蛋白质的,cDNA,序列，并推测其蛋白质序列。,用 途,蛋白质,-,核酸,（二）滤膜结合,（三）甲基化干扰,（四）,DNase,足纹,（五）核酸,-,蛋白质杂交,（一）凝胶滞后试验,（一）凝胶滞后试验,蛋白质可以与末端标记的核酸探针特异性结合，电泳时复合物较无蛋白结合的探针在凝胶中的泳动速度要慢，即表现为相对滞后。,该实验可以评价蛋白与核酸结合的特异性。,图：凝胶滞后实验结果示意图,DNA-,蛋白质复合物鉴定,延迟胶实验,(gel retardation),蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，这种复合物较无蛋白质结合的探针在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的泳动速度要慢，即表现为相对滞后。而且根据复合物分子量的不同在凝胶中表现为不同的带型，每一条带即代表一种核酸结合蛋白。,也称作,Band shift assay,或,Gel shift assay,等,基本原理,对含有特异结合位点的,DNA,片段进行末端标记；,进行,DNA,和蛋白质的结合反应；,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、干胶及放射自显影；,特点,简单、快速、具有高灵敏度和高分辨率,可以在,DNA,片段混合物中鉴别出特定,DNA,结合蛋白的靶序列,可以反映结合蛋白有否不同的亚基组合、几种不同的蛋白,之间有否相互作用以及多个蛋白竞争同一位点,通过加入竞争性抑制剂可以评价蛋白与,DNA,结合的特异性,DNA-,蛋白质复合物鉴定,AP-1 oligo(cold),unrelated oligo(cold),DNA-protein complex,AP-1 oligo(,32,P),free probe(,32,P),（二）滤膜结合法,利用硝酸纤维素滤膜不能结合双链,DNA,，但可与蛋白质结合的特性，将与蛋白质结合的,DNA,片段与游离,DNA,片段分离开。,（三）甲基化干扰,经甲基化修饰的,DNA,探针可以干扰蛋白质的结合。将,DNA,甲基化后与结合蛋白进行结合反应，只有在结合位点上未被修饰的,DNA,片段才能与蛋白结合。,DNA,探针的末端标记,及探针的甲基化,蛋白质与甲基化探针的结合,及,DNA,蛋白质,结合探针的分离,结合物及对照探针,的化学切割,DNA,片段的序列测定,甲基化干扰实验的基本步骤,利用硫酸二甲酯,(DMS),使,DNA,分子中的嘌呤碱基,G,与,A,发生甲基化，被甲基化修饰的,G,和,A,，会干扰,DNA,结合蛋白与所在部位的,DNA,结合；甲基化的探针可被化学试剂哌啶特异地切割，从而得到不同分子量的,DNA,探针片段。而与蛋白质结合着的,DNA,位点则不会被切割。,基本原理,用特殊方法将,DNA,从被修饰的碱基处进行切割，并经电泳分离，由于未结合蛋白的,DNA,可在随机修饰的位点被切割，而有结合蛋白的,DNA,在结合位点上未被修饰而不能被切割，由此可获得蛋白质与核酸定位结合的信息。,将待测双链,DNA,片段中的一条单链的一端用放射性核素标记,甲基化修饰,DNA,探针，并使之与,DNA,结合蛋白反应；,按电泳迁移率将游离,DNA,探针和,DNA-,蛋白质复合物分开，并回收,分别用,哌啶切割后在测序聚丙烯酰胺凝胶中电泳，放射自显影,基本步骤,哌啶切割,DNA-,蛋白质结合位点的检测,（四）,DNase I,足迹分析,(DNase I footprint analysis),也称作,DNase I,保护实验，是体外鉴定,DNA,结合蛋白在,DNA,分子上的结合位点的实验方法。,DNase,足纹分析是目前广泛用于蛋白质精确结合位点的研究方法。,原理：,DNase,可以随机水解核苷酸中的磷酸二酯键，将,DNA,切成单核苷酸，而结合有蛋白质的,DNA,免于,DNase,的水解。,DNase,足纹分析原理示意图,基本步骤,将待测双链,DNA,片段中的一条单链的一端用放射性核素标记；,加入待测蛋白质，使之与末端标记的,DNA,形成复合物；,加入适量的,DNaseI,进行部分消化，使,DNA,断裂为相差一个核苷酸的不同片段；,标本经变性后在测序聚丙烯酰胺凝胶中电泳，放射自显影，使之出现以相差一个核苷酸为梯度的,DNA,条带。,DNA-,蛋白质结合位点的检测,DNA,结合蛋白,有,无,DNA,探针测序反应,（五）核酸,-,蛋白质杂交实验,蛋白质杂交,SDS-PAGE,TBE,缓冲液中,DNA,蛋白质杂交,缓慢复性、封闭、预杂交,加入同位素标记的,DNA,片段作探针,多次洗膜,放射自显影,用于鉴定蛋白质与,DNA,的特异性结合和确定集合蛋白质的分子量。,基本步骤：,蛋白质杂交,SDS-PAGE,转移至,NC,膜或,Nylon,膜,缓慢复性、封闭、预杂交,加入同位素标记的,DNA,片段作探针,多次洗膜,Southwestern,印迹,一种核酸,-,蛋白质杂交实验，能够快速鉴定蛋白质与,DNA,的结合并测算所结合蛋白的分子量。,基本原理,待测的蛋白质样品经,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后由电印迹转移至硝酸纤维素膜上，然后加入经放射性核素标记的特定,DNA,片断,(,探针,),，在相应的缓冲液中进行,DNA,与蛋白质的杂交,洗膜后进行放射自显影。根据标记信号的有无，即可判断待测样品中是否存在与探针,DNA,结合的蛋白，以及结合蛋白质的分子量。,蛋白质组学的发展促进了多种研究技术的开发和完善，越来越多的技术趋向于大规模、高通量方向发展。同时，物理学、化学、信息学等基础学科研究的发展也大大促进了这些技术的改进。新近发展的计算机分析方法，以基因序列和基因组信息为基础预测蛋白质相互作用，并涉及对参与蛋白质相互作用的表面残基的预测。依赖基因序列来分析蛋白质相互作用的分析方法正在形成。而这些先进的、简易的、大规模分析蛋白质相互作用的技术发展又推动了蛋白质组学的进步。可以预见在不久的将来，随着基因组研究和蛋白质组学的不断深入，生命科学中的种种疑难将被逐一攻破。,展望,谢谢大家！,