蛋白表达纯化专业知识讲座.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。,研究目的：,生物学活性,纯度,数量,目的蛋白性质：,序列,相对分子质量,氨基酸组成,等电点,稳定性,亲水性,蛋白质表达系统,1.大肠杆菌表达系统2.酵母表达系统3.哺乳动物细胞表达系统,大肠杆菌表达系统,遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高,基本不分泌，容易形成包涵体，无糖基化等翻译后修饰,真核表达系统,可进行分泌表达，有天然立体结构及翻译后修饰,表达量较低，培养成本较高，操作较复杂,表达系统选择：目的蛋白性质，研究目的,大肠杆菌表达形式,可溶性表达：目的蛋白含有二硫键且需要正确的立体结构,包涵体表达：无活性要求，温度和诱导剂浓度影响,融合表达：小分子蛋白,大肠杆菌表达载体,融合表达：融合各种tag，GST,CBD,GFP等,单纯表达：pJLA系列，用NcoI/NdeI导入AUG的载体,NdeI 识别序列：5 CATATG 3,IPTG诱导：lac，T5，T7启动子,热诱导：lamda phage PL和PR启动子,表达载体选择：研究目的，目的蛋白性质和预计纯化方法,重组蛋白质在大肠杆菌中的表达和纯化,步骤1.目标基因全基因合成,步骤2.目标基因亚克隆,步骤3.E.coli 表达菌株转化及筛选,步骤4.目标蛋白表达及纯化,步骤1.目标基因全基因合成：,1.从基因库中搜索目标蛋白的cDNA序列。,2.根据选用的表达系统对cDNA进行密码子，mRNA二级结构等的优化。,3.合成设计好的基因序列，将目标基因亚克隆到合适的复制质粒上。,提取mRNA，逆转录PCR得到cDNA,步骤2.目标基因亚克隆：,1.扩增并抽提含有目标基因的载体质粒。,2.将目标基因亚克隆到合适的表达质粒上。,3.测序验证构建质粒的准确性。,步骤3.E.coli 表达菌株转化及筛选：,1.扩增并抽提构建好的表达质粒。,2.将表达质粒转化到高效的E.coli表达菌株中。,3.至少挑选5个阳性克隆于LB培养基中扩增并选择合适的条件，,SDS-PAGE 检测蛋白表达情况，筛选出合适菌株。,步骤4.目标蛋白表达及纯化：,1.对时间，温度以及IPTG浓度等表达条件进行优化，诱导表达目标蛋白。,2.培养重组细菌，通过亲和，离子交换，疏水及凝胶过滤等层析方法纯化表达的重组蛋白。,3.通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。,4.通过Western-blot验证目标蛋白正确性，根据蛋白质性质检测其活性,蛋白质纯化常用预处理技术：,1、菌体破碎。超声、冻融、溶菌酶,2、离心沉淀。利用离心沉降力将不溶性颗粒物与溶液分离的技术。,3、过滤。澄清过滤、除菌过滤,4、盐析。常采用硫酸铵、硫酸钠盐析,5、等电点沉淀。根据蛋白质、多肽在等电点时溶解度最小的特点进行。6、有机溶剂沉淀。采用冷的丙酮、乙醇沉淀蛋白质。例如人血浆蛋白的乙醇分级沉淀。7、变性沉淀。根据目的蛋白质、多肽对于温度或者酸碱性的耐受性，在较高的温度或者较极端的pH条件下处理样品，使杂质去除的方法。,蛋白质纯化常用层析方法,1、凝胶过滤。根据分子大小和形状进行分离的一种方法，分子量较大的先出峰，分子量小的后出峰。,2、离子交换色谱。蛋白质、多肽均属于两性电解质，在缓冲液pH小于其等电点时，带净正电荷，而在缓冲液pH大于其等电点时，带净负电荷。阴离子交换凝胶本身带有正电荷基团，阳离子交换凝胶本身带负电荷基团。由于静电相互作用而使样品结合到凝胶上，再采用盐浓度梯度或者更换缓冲液的pH值进行洗脱。对于等电点小于5.0的酸性蛋白质，推荐使用阴离子交换，对于等电点大于7.0的碱性蛋白质，推荐使用阳离子交换。3、疏水作用色谱。利用蛋白质、多肽在高盐存在下，可以结合疏水凝胶，而在盐浓度降低时又可以解脱的原理实现分离。4、亲和色谱。利用蛋白质、多肽与配基的特异性相互作用而进行分离。,5、反相色谱。常用于蛋白质、多肽的HPLC分析，以及多肽的精细制备分离，分辨率极高。,各种色谱的主要影响因素,填料性质,样品浓度,上样体积,洗脱流速,工作缓冲液的pH值，离子浓度,蛋白质纯化常用衔接技术：,1、透析。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜的透析袋进行透析，可以起到更换缓冲液以及去除一些低分子杂质的目的。2、超滤。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜截留分子量的超滤膜进行超滤。,3、脱盐。透析、超滤可用于进行脱盐，Sephadex G25、G50常用于蛋白质脱盐。,包含体表达蛋白的纯化：,在E.coli系统表达重组蛋白，表达量高时，常形成包含体，包含体易于与细胞其他组分分离，但需要注意的是蛋白复性的步骤。一般采用盐酸胍溶解包含体蛋白后，用稀释的办法进行复性，也可以利用透析、凝胶过滤色谱等方法进行复性。,举例：His-Taq DNA 聚合酶纯化,性质：6*His标签，DNA聚合酶活性，pI 5，热稳定,目的：95%以上纯度，大量制备，无核酸酶，保持聚合酶活性,纯化策略：,1、37度可溶表达，收集菌体后超声加溶菌酶破碎菌体，离心，上清液75度热处理20min，离心取上清,2、亲和层析纯化，阴离子交换层析去除核酸酶，根据聚合酶活性及核酸酶活性测定其活性及核酸酶残留量,