核酸检测专题知识讲座.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,文章内容来源于网络，如果侵权或者不当的地方，请联系我删除或者改正。文章内容仅可参考，不能作为科学依据。谢谢！,The content of this article comes from the Internet.If there is any infringement or improper place,please contact me to delete or correct it.The content of the article can only be referred to,not as a scientific basis.thank you!,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,文章内容来源于网络，如果侵权或者不当的地方，请联系我删除或者改正。文章内容仅可参考，不能作为科学依据。谢谢！,The content of this article comes from the Internet.If there is any infringement or improper place,please contact me to delete or correct it.The content of the article can only be referred to,not as a scientific basis.thank you!,内容,一、基本技术,（一）核酸提取,1.,基因组DNA提取,2.,非基因组DNA提取,3.,RNA提取,（二）PCR扩增,1.,普通,PCR,2.,荧光定量,PCR,(,三,),核酸、,PCR,产物的鉴定,1.,琼脂糖凝胶电泳,2.,紫外分光光度法,二、相关技术,三、分子平台使用流程及仪器设备操作规范,（一）核酸提取,提取,DNA,目的：,主要是对基因和基因组进行分析。,提取,RNA,目的：,主要是对基因表达进行分析。,基因组,DNA提取基本步骤,材料准备,破碎、裂解细胞,核酸分离和纯化,沉淀或吸附核酸，去除杂质,核酸溶解在适量缓冲液或水中,组织,培养的细胞,细菌,外周血,（一）基因组DNA提取,组织匀浆或液氮研磨,培养细胞蛋白酶,K,外周血,-,裂解液,细菌,-,裂解液,氯仿或吸附柱,异丙醇、吸附柱,70的乙醇洗涤,蛋白质的去除,盐离子的去除,1,、材料准备,基因组,DNA,来源：组织,/培养的细胞/外周血,最好使用新鲜样本，低温保存的样品不要反复冻融,提取外周血,DNA时，要选择有核细胞（单个核细胞）,培养的细胞培养时间不能过长，否则会造成核酸降解,含病毒的标本DNA含量较少，提取前先富集,（一）基因组DNA提取,取组织块,0.3-0.5cm,3,剪碎，加,TE,缓冲液,0.5ml,，转移到匀浆器中匀浆。,将匀浆液转移到,1.5 ml,离心管中。,加,20%,SDS,25,l,，,蛋白酶,K,(2 mg/ml)25,l,，混匀。,60,水浴,1-3 h,。,蛋白酶K使多种蛋白质水解，并且蛋白酶K可在SDS存在下有活性。,a,匀浆法,TE缓冲液是弱碱性,对DNA的碱基有保护作用,不易破坏其完整性或产生开环及断裂。,SDS能使DNA和蛋白质分开。,b,液氮研磨法,组织标本的处理,：,（一）基因组DNA提取,2,、破碎裂解细胞,液氮研磨组织注意事项,确定起始样品量，在研磨前称量好。,研磨过程中要及时添加液氮，边研磨边添加。,可以将研钵放在大小合适的泡沫盒里面研磨，这样可以保温，减小液氮挥发的速度。,研磨成粉末，在液氮挥发尽，应立即加入裂解溶液（裂解溶液一定要含有抗氧化剂，防止DNA被氧化降解。常用的抗氧化剂有PVP，-巯基乙醇等）。,裂解液加入后继续研磨，直至标本融化成液态。,b,液氮研磨法,培养细胞处理：,将培养细胞悬浮后，用PBS洗涤一次。,离心4000 g，5min，去除上清液。,加10倍体积的裂解缓冲液。,50-55水浴1-2 h。,要散细吹胞团块，使细胞被充分裂,（一）基因组DNA提取,破碎裂解细胞,外周血的处理,红细胞裂解法,将,1 ml EDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5 ml离心管中，加入1 ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500 rpm离心15 min倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用0.7 ml DNA提取液混悬白细胞沉淀，37水浴温育1 h。,（一）基因组DNA提取,破碎裂解细胞,分离单个核细胞,Ficoll-hypaque,（葡聚糖泛影葡胺）,密度梯度离心法，因为血液中各有形,成分的比重存在差异，因此得以分离。,红细胞和粒细胞密度大于分层液，同,时因红细胞遇到,Ficoll,而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。本法分离单个核细胞纯度可达,95,，淋巴细胞约占,90,95,，细胞获得率可达,80,以上，其高低与室温有关，超过,25,时会影响细胞获得率。,细菌的处理,将菌株接种于液体,LB,培养基,，,37,震荡培养过夜。,取,1.5 ml,培养物,12000 rpm,离心,2 min,。,沉淀中加入,500l,的,TE,缓冲液,，反复吹打使之重新悬浮，加入,30 l,10%SDS,和,15 l,的,蛋白酶,K,，混匀，于,37,温育,1 h,。,（一）基因组DNA提取,破碎裂解细胞,核酸分离、沉淀、洗涤和溶解,暴露出的,DNA,（一）基因组DNA提取,吸附材料或,氯仿抽提,吸附柱或异丙醇沉淀,漂洗液或,70%,乙醇洗涤,TE,缓冲液或双蒸水水溶解,分离,洗涤,沉淀,溶解,质粒,DNA,的提取,细菌质粒是重组,DNA 技术中常用的载体，提取后可用作构建基因表达载体。,（二）,非基因组DNA提取,培养细菌使质粒扩增,收集和裂解细菌,分离和纯化质粒DNA,分离质粒的三大步骤,材料准备,使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）,培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失,尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量,菌株不要频繁转接（质粒丢失）,质粒DNA提取,（二）,非基因组DNA提取,当用碱处理DNA溶液时，变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而共价闭合环状的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将其分开,质粒DNA提取,（二）,非基因组DNA提取,裂解法原理：,裂解细菌,质粒,DNA碱裂解法流程,对数期菌体,溶液III中和,溶液I充分重悬,溶液II裂解,上清液,抽提,离心洗涤,酒精沉淀,干燥溶解,酒精沉淀,质粒DNA溶液,质粒DNA提取,（二）,非基因组DNA提取,溶液1作用是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部，抑制DNase的活性，螯合二价金属离子。,溶液2：溶液2中的NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。,溶液3：是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入,酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，,暴露出的,DNA,吸附材料或,氯仿抽提,吸附柱或异丙醇沉淀,漂洗液或,70%,乙醇洗涤,TE,缓冲液或去离子水溶解,质粒,DNA,纯化,质粒DNA提取,（二）,非基因组DNA提取,核酸纯化时所需试剂,蛋白质的去除：,酚,/氯仿抽提,使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）,高盐洗涤,蛋白酶处理,盐离子的去除：,70的乙醇洗涤,DNA提取常见问题,DNA样品不纯,DNA,中含有蛋白、多糖、多酚类杂质,DNA,在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应,DNA,中残留有金属离子,原因,对策,重新纯化DNA，去除 蛋白等杂质（具体方法见前）,重新沉淀DNA，让酒精充分挥发,增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）,（一）DNA提取及鉴定,DNA提取常见问题,DNA降解,原因,材料不新鲜或反复冻融,未很好抑制内源核酸酶的活性,提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断,外源核酸酶污染,DNA反复冻融,对策,尽量取新鲜材料，,液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔,所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌,将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融,（一）DNA提取及鉴定,RNA提取基本步骤,破碎细胞或者组织,抽提RNA,沉淀、洗涤和晾干,溶解,（三）RNA提取及鉴定,TRIZOL,氯仿,异丙醇、酒精,同,DNA,提取处理,无,RNA,酶水,注意RNA酶的污染,如何避免RNA酶的污染,订购去RNA酶的一次性耗材,在无菌的环境下进行分装,使用后的枪头盒进行冲洗晾干,培养细胞：,通常可直接加TRIZOL裂解,酵母和细菌：,一般TRIZOL可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁,动物组织：,先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻,外周血：,直接加,TRIZOL,或提取单个核细胞后加入,TRIZOL,裂解,（三）RNA提取及鉴定,材料准备,TRIZOL可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。,（三）RNA提取及鉴定,裂解细胞,影响,RNA提取因素,标本：,标本新鲜切忌反复冻融,如果标本来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将标本贮存在,TRIZOL,或样品贮存液中，于80保存,如要多次提取，请分成多份于80保存,样品量：,保证充分裂解，样品和裂解液比例适当（100mg组织样本加1ml裂解液，细胞数,110,6,加,1ml,裂解液）,DNA污染：,为了减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量,（三）RNA提取及鉴定,RNA提取常见问题,RNA 的降解,OD260/OD280 比值偏低,RNA效率低,（二）RNA提取及鉴定,正常,RNA,琼脂糖凝胶电泳图,RNA,降解的琼脂糖凝胶电泳图,避免,RNA,降解的方法,新鲜细胞或组织：,组织取出后马上进行提取或冷冻,提取的RNA沉淀短期保存于-20，-80长期保存,如果用胰酶消化细胞要充分洗去胰酶，以免影响后续操作,溶液或离心管要去除RNase，将一次性耗材进行分装使用，必要时进行高温高压。,冷冻样品：,样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至,-80冰箱保存。,先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；,样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。,紫外吸收法,核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收,UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用来表示（即A值）,测得未知浓度核酸溶液的A,260,值，即可以计算出其中,DNA或RNA的含量。该操作方法简便，迅速，样品用量少。,DNA浓度（ug/ml）A,260,/0.020/L稀释倍数,RNA浓度（ug/ml）A,260,/0.024/L稀释倍数,OD260/OD280 比值偏低,检测吸光度时，,RNA,的吸收峰在,OD260,时最高，低离子浓度和低pH条件下，OD280值会较高,OD260/OD280 比值偏低的原因有,样品匀浆时加的试剂量太少,水相中混有有机相：苯酚残留,最后得到的RNA沉淀未完全溶解,获得,RNA效率低,样品裂解或匀浆处理不彻底,不同细胞和组织中RNA的丰度不同，如肝脏，胰腺，心脏等是高丰度组织(总RNA含量2-4g/mg)，脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢等是中丰度组织(总RNA含量0.05-2g/mg)，膀胱，骨，脂肪等是低丰度组织(总RNA含量0.05g/mg)。,最后得到的,RNA沉淀未完全溶解,核酸测定,1,、溴乙锭荧光法,2,、紫外吸收法,溴乙锭荧光法,(,电泳,),原理：荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA、RNA样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNA溶液（Marker)作标准对照，可相对比较出被测DNA溶液浓度。,紫外吸收法,核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收,UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用来表示为每升溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值（即A值）,测得未知浓度核酸溶液的A,260,值，即可以计算出其中,DNA或RNA的含量。该操作方法简便，迅速，样品用量少。,DNA浓度（ug/ml）A,260,/0.020/L稀释倍数,RNA浓度（ug/ml）A,260,/0.024/L稀释倍数,核酸的保存：,DNA保存,近期常用的4 保存,短期不使用的-20 保存,RNA保存,RNA样品溶于无,RNA,酶水中，-80 保存;长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中,常用的核酸实验流程,组织,培养的细胞,外周血,细菌,RNA提取,DNA提取,cDNA,逆转录,普通PCR,荧光定量PCR,多重PCR,电泳,凝胶成像,PCR技术,多聚酶链式反应,(polymerase chain reaction)简称,技术，是一种体外扩增特异片段的技术。,技术操作简便，可在短时间获得数百万个特异的目的序列的拷贝。80年代中期技术的发明，引起了生物技术发展的一次革命，目前已被广泛应用于与分子生物学相关的各个领域。,4种dNTP混合物 Taq DNA聚合酶 Mg,2+,双蒸水,引物 模板DNA,混合液,试剂公司合成,DNA,cDNA,PCR反应五要素,引物（,primer）,酶（Taq DNA polymerase）,dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）,模板（template）,Mg,2+,（,magnesium）,引物,引物是,PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度,理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增,常用软件primer5,验证引物特异性,BLAST,是,Basic Local Alignment Search Tool,的英文缩写，意即碱基局部对准检索工具，是一种序列类似性检索工具。它采用统计学记分系统，能将真正配对的序列同随机产生的干扰序列区别开来,即采用的是局部对准算法,(Local Alignment Algorithm),，而不是全序列对准算法,(Global Alignment Algorithm),。,www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi,1 atggggggct ggtttgcaca ccccatcttc aaaaacggag actaccctga ggtgatgaag,61 acacggattc gtgacagaag cctggcggca ggcctcaaca agtccaggct ccctgaattt,121 acagagagcg agaagaagat ccagagcacc tttgactttt ttgggttcaa ccactaca,cc,181,actgtcctag cctacaacct c,aactacgcc gctgctgttt cgtcttttga tgccgatagg,241 g,gagttgctt ccattacaga ccg,ctcctgg ccagactctg gctccttctg gctgaagatg,301 accccttttg gcttccggag gatcttgaac tggttgaagg aggagtacaa caaccctcta,361 atttatgtca cagagaatgg agtgtcccga cgaggagacc cagaactcaa tgacaccgac,421 aggatctact acctccgcag ctacattaat gaagccctca aagctgtacg agataaggtg,481 gaccttcgag ggtacacggt ctggagcatc atggacaact ttgaatgggc cacaggcttc,541 gcagagaggt tcggcgtgca ctttgtgaac cgctctgacc cttctttgcc aaggatcccc,601 aaggcgtcag ccaaggtcta cgcctccata gtccgctgca atggctttcc tgaccctgca,引物序列输入窗口,ATGTTGGGGAAATGCTTGACC,数据库的选择,在此，我们选择,第三个数据库,程序的选择,显示结果在新的窗口,点击此按钮，进入结果页面,输入方法可先输入上游引物，进行,blast,程序，同样方法在进行下游引物的,blast,程序。在结果分析特异性时要看能与上游引物的匹配的系列，还要看与下游引物匹配的系列,之后看两者的交叉。,等待若干秒之后，出现,results of BLAST,的网页。,该网页用三种形式来显示,blast,的结果。,（,1,）图形格式,通过点击相应的,bar,可以得到匹配情况的,详细信息。,（,2,）结果信息概要：,从左到右分别为：,A、数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序列的信息,B、系列的简单描述,C、高比值片段对（,high-scoring segment,pairs,HSP),的字符得分。按照得分的高低由大到小排列。得分的计算公式匹配的碱基20.1。举例：如果有20个碱基匹配，则其得分为40.1。,D、E值：代表被比对的两个序列不相关的可能性。E值最低的最有意义，也就是说序列的相似性最大。设定的E值是我们限定的上限，E值太高的就不显示了,E、最后一栏有的有UEG的字样，其中U代表：Unigene数据库 E代表：GEO profiles数据库 G代表：Gene数据库,A,B,C,D,E,（,3,）结果详细信息,序列的信息,上游引物与该序列的正链,【Plus/Plus】,的匹配情况：,共有,21,个碱基匹配，得分,42.1,分,【212,0.1,42.1】,，,E,值为,0.014,上游引物与序列的,1,21,位点匹配,结果判断：,验证文献报道的引物是否正确：如果你可以在所显示的结果中找出你的目的基因，一般说明你的引物正确性没问题。如果你,blast,后没有发现你的目的基因，或者分值很低，该引物就可能不适合用,检测该对引物是否可与其它序列匹配，引起,PCR,的非特异性扩增。如果找到了你的目的基因名称，而且找到了一大批同物种的不同基因，（上下游引物分别搜索到相同的基因），而且分数也较高。这时表明你的引物设计的特异性不高，极有可能在你的扩增产物中出现非特异性产物。,PCR反应条件的选择,PCR反应条件:,温度,时间,循环次数,温度与时间的设置,：,标准反应中采用三温度点法，对于较短靶基因（长度为,100300bp时）可采用二温度点法，将退火与延伸温度合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸,变性温度与时间：,变性温度低，解链不完全是导致,PCR失败的最主要原因,一般,9394lmin,足以使模板,DNA变性,若低于,93则需延长时间,但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。,此步若不能使靶基因模板或,PCR产物完全变性，就会导致PCR失败,退火(复性)温度与时间：,退火温度是影响,PCR特异性的较重要因素,变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞,退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度,对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想,延伸温度与时间：,延伸温度：一般选择在,7075之间,常用温度为,72,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。,延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定,1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）,34kb的靶序列需34min,扩增10Kb需延伸至15min,延伸时间过长会导致非特异性扩增,对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些,循环次数,循环次数,决定,PCR扩增程度,循环次数,主要取决于模板,DNA的浓度,循环次数：选在,3040次之间,循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多,琼脂糖凝胶制作,琼脂糖的浓度 如下表所示，不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。,一般,RNA,凝胶用,1%,浓度，,PCR,产物用,2%,凝胶浓度（,%）,线性,DNA长度（bp）,0.5,100030000,0.7,80012000,1.0,50010000,1.2,4007000,1.5,2003000,2.0,502000,正确选择凝胶浓度,对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在,0.52之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。,电泳的合适电压和温度,电泳时电压一般用,80-150,伏，电泳温度应该低于30，对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象,DNA、RNA的上样,正确的DNA、RNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。,每次上样6ul即可得到清晰均匀的条带。,PCR,产物一般,2-5,即可。,步骤如下：,1.制备,1%琼脂糖凝胶,(大胶用50ml,小胶用30ml):,称取0.5 g(0.3 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入50 ml(30ml)0.5TBE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,室温凉至微热（,60C,左右），加入EB（0.5ug/ml），摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液.,例如：,2.胶板制备:,制胶槽洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.将内槽置于水平位置,放好梳子.将冷却到6,0,左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,形成均匀胶层,.,室温下静置至完全凝固,垂直轻拔梳子,。,避免气泡的产生，操作要轻柔。,3.点样:,在EP管中混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面,例如：我们加3-5l样本时加1 ul 6X的loading buffer,加marker做对照。一定要弄清楚marker各条带片段的大小,4.电泳:,加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压,80,-1,50,V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当,溴酚蓝,移动到距离胶板下沿约1/3处时,停止电泳.,6.观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存.,PCR,实验新手入门,首先合成引物、订购试剂以及一次性耗材,1.,引物序列可以自己用软件设计、源于文献和公司设计,2.,找公司设计时需要提供目的基因的全基因序列,提取,DNA,或,RNA,，将,RNA,逆转录为,cDNA,验证所提取核酸的纯度与浓度（凝胶电泳法或紫外分光光度法）,摸索退火温度引物,Tm,值上下,5,(,是否有，特异性,),找出最佳反应条件,PCR,时加对照确保反应体系各种试剂好用,摸索实验：,PCR,实验新手入门,先少做、细做、严格按照实验程序以及实验室指定区域进行操作。,常与老师和同学进行交流遇到问题及时解决,在努力奋斗的同时保持一颗平常心,多查阅文献,实验阶段,PCR常见问题,1 无扩增产物,模板,:含有抑制物，含量低,Buffer对样品不合适,引物设计不当或者发生降解,退火温度太高,PCR常见问题,2.非特异性扩增,引物特异性差,模板或引物浓度过高,酶量过多,退火温度偏低,循环次数过多,PCR常见问题,3.拖尾,模板不纯或降解,Buffer不合适,退火温度偏低,酶量过多,循环次数过多,M 1 2,PCR常见问题,4.假阳性,交叉污染,操作时防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；防止,PCR,产物污染,各种试剂先进行分装，低温贮存。,设置阳性和,阴性对照,，重复实验,以RNA为模板，先逆转录为cDNA,然后再进行PCR反应利用内参法分析目的基因表达量的情况,由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18S rRNA等。因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。,RT-PCR（反转录PCR）,一种完全闭管式的,PCR和荧光探针杂交技术相结合的定量PCR方法,PCR的高效扩增特性,核酸探针的高特异性,光谱技术的高灵敏性和可计量性,Real-time PCR（实时荧光定量PCR),荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：,荧光探针,荧光染料,TaqMan荧光探针原理,：,PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。,ipd.pps.tv/play_33K8AW.html?qq-pf-to=pcqq.c2c,TaqMan荧光探针特点,优点,模板每复制次，就有个探针被切断，并有个荧光信号被释放。,被释放的荧光基团数和产物数是一对一的关系,光密度同被释放的荧光基团数也呈正比关系,可对模板进行准确定量。,不足,由于采用荧光和淬灭基团双末端标记，因此淬灭难以彻底，本底较高。,报告基团的水解利用的是酶的,一,外切活性，因此定量时容易受酶活性影响。,探针标记成本较高,Ct 值的定义,在,荧光定量PCR,技术中，有一个很重要的概念-Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数,荧光域值（,threshold）的设定,PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10 SDcycle 3-15,Ct值与起始模板的关系,研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始,拷贝数,的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,定量原理,SYBR荧光染料,原理,是一种能结合到双链小沟部位的具有绿色激发波长的染料，它只有与结合后才会发出荧光。在变性时，双链分开，不产生荧光；在复性和延伸时，形成,，发出荧光因此，荧光强度可以代表扩增产物的数量。,SYBR荧光染料,特点,优点：,成本较低，不需合成和标记探针；,适合初步筛查：选用筛查，再用探针法精确定量少数关键样品。,不足：,特异性差，不能分辨主带与杂带。但可利用熔点曲线分析将特异产物、引物二聚体和非特异性产物区别开来，不需要通过电泳鉴定,不能做多重检测，每孔只能检测个目标基因；,灵敏度低，适合于拷贝以上的基因定量。,实时荧光定量,PCR技术的应用,DNA或RNA的绝对定量分析。包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。,基因表达差异分析。例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等)，特定基因在不同时相的表达差异以及 cDNA 芯片或差显结果的确证,基因分型。例如SNP检测，甲基化检测等。,FQ-PCR,与普通,PCR,的区别,采用闭管检测，不需,PCR后处理，并采用dUTP-UNG酶的防污染系统，扩增和检测一次同时完成。不需开盖，不产生污染。避免了假阳性。,探针与被检DNA序列特异杂交，增强了特异性。,可定量结果，准确灵敏地反应了病原体的感染和治疗恢复情况。,光谱分析仪直读结果，自动分析，增强了灵敏性和客观性。,PCR,产物污染问题,2,、还有一种容易忽视，最可能造成,PCR,产物污染的形式是气溶胶污染：在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含,48000,拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。,PCR,产物污染问题,PCR,反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。,1,、,PCR,扩增产物污染：这是,PCR,反应中最主要最常见的污染问题,.,因为,PCR,产物拷贝量大（一般为,1013,拷贝,/ml,），远远高于,PCR,检测数个拷贝的极限，所以极微量的,PCR,产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。,目前常见,PCR,产物污染问题,PCR,产物污染自己的实验体系,PCR,产物污染环境进而污染他人,他人的,PCR,产物污染自己,解决办法：,严格按照实验操作规范进行操作。,每次,PCR,实验时一定要加阴性对照。,每次实验到指定区域进行。,控制,PCR,产物污染人人有责。,二、,PCR相关技术,基因克隆,SSCP、RFLP,杂交（southern/northern、原位杂交）,芯片杂交,测序,基因克隆,1、分离目的基因,2、切割目的基因和基因载体,3、连接目的基因和基因载体,4、转化至宿主细胞,5、筛选阳性细胞克隆,SSCP、RFLP,SSCP：单链构象多态性，是一种基于DNA构象差别来检测点突变的方法。相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。,RFLP：限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）用于检测DNA序列多态性。先将待测的靶DNA 片段进行复制扩增，然后应用DNA 限制性内切酶对扩增产物进行酶切，最后经电泳分析靶DNA 片段是否被切割而分型。,三、分子平台使用流程及规范,（一）分子平台实验区域,（二）仪器的使用规范,（一)分子平台实验区域,实验室分为三个区；,RNA,提取专用区，,DNA,提取室，,PCR,扩增及,PCR,产物分析区,严格遵守各区域专用，禁止混用,进入,PCR,扩增及,PCR,产物分析区，带进去的东西一律不准带出。,不做分子实验的同学禁止进入分子实验室。,为了大家共同利益请爱护实验室的设备以及环境,1、标本制备、,RNA,提取室,用途：,RNA,专用提取室,仪器：生物安全柜和低温高速离心机,注意事项：使用前进行预约登记严格按照各仪器设备使用规范进行操作使用后及时做好清洁工作。,2、标本制备、,DNA,提取室,用途：,DNA,提取、组织研磨以及核酸紫外检测,仪器：生物安全柜、超净工作台、低温高速离心机、PCR仪器（做逆转录用）和超微量紫外分光光度计,注意事项：严格按照各仪器设备使用规范进行操作,请爱护仪器设施，使用后及时做好清洁工作。,3、,PCR,反应及产物分析区使用注意事项,用途：为,PCR,反应及,PCR,产物分析专用区,仪器：水平制胶槽、微波炉、水平电泳仪、PCR仪和凝胶成相系统,注意事项：严格按照指定区域进行特定操作，切忌混用以免造成污染勿将,PCR,产物、凝胶、本室的一切物品和设备带出本室,实验室垃圾的处理,提取室的枪头等一次性物品一定要用塑料袋包好后扔到各实验区域指定的位置。,PCR,产物分析室的点样枪头、凝胶一定要包好后扔到指定区域。,（二）仪器的使用规范,使用前熟悉仪器设备的使用方法和注意事项,使用时进行登记,轻柔操作,使用后注意关闭电源,做好清洁工作,使用方法：,检查电源电压是否匹配后，接通电源。,生物安全柜工作前必须预先打开风机。,生物安全柜工作时先关闭紫外灯,工作时不要将移门移过安全线的高度。,注意事项:,工作台面禁放不必要的物品，以保持工作区的洁净气流不受干扰。,禁止在工作台面上记录书写，工作时尽量避免作明显扰动气流的动作；,禁止在预过滤进风口部位放置物品，以免挡住进风口造成进风量减少，降低净化能力。,生物安全柜使用后即刻以5%施康消毒液洗擦工作台面，再以75%酒精擦一次；紫外灯消毒30分钟后关机。,使用后做好登记,将垃圾包好扔到指定的位置,生物安全柜内的加样器只能在该柜内使用,生物安全柜使用操作流程,加样器使用注意事项,使用前注意加样器的使用方法,注意调节的方向。禁止调节超过最大量程,轻拿轻放，注意加样器的清洁。,什么地方的加样器只在该位置使用,离心机使用规范,离心前先将待离心物品的管壁擦干净，必须配平,先盖好离心机内盖再盖外盖，离心后将离心机外盖打开,用水池上面的抹布将离心机擦拭干净，白天不用关电源,晚上最后一个使用者关闭电源,低温离心后一定将盖子打开，晾干水汽,掌上离心机使用规范,用途：试剂、样品等短暂离心,注意事项：配平、清洁和仅在指定区域内使用,PCR扩增仪使用规范,使用期进行预约登记，使用后 登记仪器运行状态。,操作时按键要轻柔,使用后及时告知下一位预约者,严格区分做逆转录实验和PCR实验的PCR仪。,PCR产物不要带出PCR扩增区，电泳完用塑料袋包好后扔到指定位置。如需暂存请保存在PCR扩增区的冰箱内，严禁带出。,做逆转录时PCR仪使用规范,地点：DNA提取室,注意事项：此PCR仪为逆转录专用。绝对不能用于PCR实验,使用前预约登记，使用后关闭电源,PCR扩增产物暂存处使用规范,第一次使用前来夏妍处进行登记,产物严格存放在自己的区域,产物短期存放,及时进行清理,水平制胶区使用规范,使用前进行登记,此区域内的设备与物品只可在此处使用，严禁带出,使用时将排风打开,有毒物品（,EB）使用后要及时盖好盖子,枪头等一次性物品用一次性塑料手套包好后扔到该通风厨内的垃圾桶中,PCR产物点样区、水平电泳区使用规范,使用前进行登记,使用时将排风打开,PCR点样只能在此区域进行,使用后的枪头凝胶等用一次性手套包好后扔到该通风橱内的垃圾桶中,水平式电泳槽使用操作流程,使用方法,:,凝胶从制胶槽中取出，移入电泳槽；,在两水槽中加入电泳缓冲液，使凝胶全部被浸没，水位应高出液,面1mm.,电压的高低可根据凝胶的长短进行选择，调节电压旋钮,可选择电压高低.,使用完毕后,关闭开关。,注意事项:,电泳时应注意观察电泳的速度，注意凝胶条带不可泳出凝胶以外。,电泳槽内的缓冲液应将凝胶完全浸没。如缓冲液过少应及时添加。,连接电泳仪时应注意电源的正负极方向，不可连错。,凝胶成像系统使用规范,使用方法：,开启电脑至,WINDOWS处于正常工作状态；,双击桌面上的GIS图标,进入软件；,拍摄：打开拍摄界面(单击左侧数第五个图标),把胶置于灯台上,选择透射或反射键进行拍摄(选择后单击即可),单击拍摄键选 择曝光时间拍摄,并保存图像.,作完毕,关闭软件窗口；,关闭电脑。,注意事项：,使用后，将胶块从暗箱中取出，用,75%酒精棉擦拭暗箱放胶块平台。,保持好平台表面的光滑，洁净。否则会影响下一次的拍摄效果。,分子实验室有毒物品,EB,溴化乙锭（,ethidium bromide,），一种高度灵敏的嵌入性荧光染色剂。溴化乙锭可以嵌入碱基分子中,导致错配。强,诱变剂,吸入有极高毒性。