全国结核病细菌学诊断培训.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,2006年10月,全国结核病细菌学诊断标准培训,结核病流行和防治策略,端木宏谨,北京结核病胸部肿瘤研究所,与结核病细菌学实验室诊断相关的结核分枝杆菌生物学性状要略,潘毓萱,结核病实验室工作质量保证,姜广路,国家结核病参比实验室,生物安全柜的使用,王秋娣,中国疾病预防控制中心,诊断试验研究与评价,史红,中华检验医学杂志编辑部,结核菌涂片、培养的标准化操作,刘宇红,国家结核病参比实验室,消毒和灭菌,胡继红,卫生部临床检验中心,结核病实验室诊断进展,赵雁林,国家结核病参比实验室,我国结核病防治形势与任务,肖东楼,卫生部疾病预防控制局,全球结核病负担,俄罗斯,1%,印度尼西亚,10%,孟加拉,4%,巴基斯坦,4%,尼日利亚,3%,菲律宾,s,3%,南非,2%,中国,15%,印度,30%,其他国家,28%,我国多达,5.5,亿的人口感染过结核菌,2004,年,WHO,估算,活动性肺结核病1,460,万人,涂阳,610,万人,新发结核病8,90,万人,新涂阳,390,万人,死于结核病,170,万人（我国：,37,万，居法定传染病之首）,结核病控制三大目标：,1.,近期目标：到,05,年，病人发现率达,70%,，治愈率达,85%,，,DOTS,覆盖率达,100%,2.,中期目标：到,2010,年，结核病患病率和死亡率在,1990,年的基础上各下降,50%,3.,长期目标：到,2050,年，基本消灭结核病，发病率,=,10,条,/,每视野,500,000,涂片阳性的意义？,涂片阳性说明病人痰标本中含有大量的抗酸菌，是最主要的传染源。,9,、玻片的保存,去除镜油,保存近期三个月量痰涂片,按实验序号存放于玻片盒中，置干燥阴凉处保存,假阴性,假阳性,技术错误,涂片,太薄,/,太厚、暴露在紫外线下,标本中的混杂物质,/,加热时间过长,/,使用污染的木签,染色,染色质量不佳、未热染、染色时,结晶,/,环境抗酸菌、,间太短、脱落、涂片未固定,交叉污染,脱色,脱色不佳 脱色不佳,复染,过染,染色不佳,镜检员,视力缺陷、仅观察少数视野,经镜油交叉污染,读片错误,未经培训 未经培训,记录,/,报告,笔误、,标签错误 笔误、,标签错误,产生错误结果的因素,分离培养相关的生物学性状,分离培养相关的生物学性状,BergysMannual of Systematic Bacteriology,倾向蜿蜒索状生长,大多数固体培养基上菌落粗糙，突起，致密，常有小结节、褶皱表面和不规则的边缘，常呈白色、暗黄色或黄色，,在无表面活性剂液体培养基中静止培养，呈膜生长，随着菌龄增加膜加厚、皱褶；,在含,Tween,液体培养基中震荡培养可分散生长，无扰动机群可分散；,试管内代期（,generation time),最适条件下,14 15 h,可生长温度,30 34,，最适生长温度,37,最适,pH 6,.4 7.0,5%CO,2,0,.,5%,丙三醇 促进早期生长,有氧条件下培养物急剧转向无氧条件，菌快速死亡，氧梯度逐步降低，可适应氧饥饿，在液体培养基中可呈同步生长；,营养要求,简单无机合成培养物中可生长,具有合成生长所需要的全部氨基酸、维生素、辅酶因子的基因,Koch,时代培养基,凝固血清、马铃薯切块、营养明胶、营养琼脂,营养要求研究；,快速培养（？）,提高检出率,现代培养基：,强化半合成液体培养基,7H9,11,固体培养基（天然营养物）,:,罗氏鸡卵培养基,7H 10,琼枝培养基,生长缓慢特性,-,指标 结核 耻垢 大肠,-,代期,(,小时,),试管,1524 3 0.5,巨嗜细胞,1560,家兔角膜,2022,菌落形成时间（,1mm,）,4,周 数日 隔夜,亲脂性胞壁屏障,+-,核苷酸参入,(,核苷酸,/,分钟,)3200,快,11,倍 快,1318,倍,基因组,DNA,复制时间,(,小时,)1018 1.81.9,mRNA,转录时间,(,小时,)0.12 0.013,rRNA,操纵子数,1 2 7,核糖体数,1700 20,000,调控,?,-,酸性罗氏,（,Lowenstein-Jensen,）,培养基,天门冬素,3.6g,或谷氨酸钠（纯度,99%,以上）,7.2g,KH,2,PO,4,14.0g,MgSO4.7H,2,O 0.24g,枸橼酸镁,0.6g,丙三醇,12ml,蒸馏水,600ml,新鲜鸡卵液,1000ml,2%,孔雀绿,20ml,一、,培 养 基,原理：,分枝杆菌对酸碱有相对强的耐受力。,目的：,液化标本、去除杂菌、分离出分枝杆菌,原则：,-,尽可能杀灭标本中的杂菌,-,尽可能保存标本中的分枝杆菌,二、标本前处理,操作,痰标本,1,2,倍,4%NaOH,振荡匀化,静置,15,分钟,37,竖直培养,8,周,均匀接种,0.1ml,2,支,/,标本,斜面向上，,37,水平放置,24,小时,三、接种和孵育,接种后第,3,、,7,天各观察一次菌落生长情况,此后每周观察一次，直至满,8,周,记录菌落生长及污染情况。,四、结果的观察与报告,结核分枝杆菌生长特性：,缓慢：在一般培养基上分裂一代需要,10,多小时，一般,10-30,天肉眼可见菌落生长。,菌落形态（罗氏培养基）：粗糙、凸起、致密，有表面皱折，呈颗粒、结节或菜花样，浅黄色或米色，不透明。,报 告 方 式,分枝杆菌培养阴性：斜面无菌落生长,菌落生长不足斜面面积,1/4,者，报实际菌落数。,分枝杆菌培养阳性,（,1+,）,：菌落生长占斜面面积的,1/4,分枝杆菌培养阳性,（,2+,）,：菌落生长占斜面面积的,1/2,分枝杆菌培养阳性,（,3+,）,：菌落生长占斜面面积的,3/4,分枝杆菌培养阳性,（,4+,）,：菌落生长布满整个斜面,可能原因,解决方法,标本保存不当,(,时间、温度）,涂片后标本于冰箱保存，,24,小时内培养。,标本选择不当,选择标本中脓样、干酪样可疑部分,过处理（时间、浓度,),4,NaOH,，,1,2,倍体积，,20,分钟,接种量太小,每管接种,0.1,毫升,温箱温度不当,温箱内置温度计，每日监测温度。,涂阳培阴率过高？,可能原因,解决方法,标本保存不当,(,时间、温度）,涂片留取后,24,小时内培养，不能及时培养的,4C,冰箱保存。,前处理不充分,4,NaOH,，,1,2,倍，充分混旋，,20,分钟。,材料灭菌不佳,接种用吸管需高压灭菌。,操作不当,培训，严格按操作规程操作。,培养基因素,统一供应，,4C,直立保存，,1,个月内使用,污染率过高？,痰涂片镜检质量保证体系,质量保证,(QA,）：,质量控制（,QC,）,室间质量评估（,EQA,）,现场评价,盲法复检,批量测试,质量提高（,QI,）,室内质量控制措施,SOP,自查,试剂的质控（染色液）,工作应有详尽记录,室间质量评估,(EQA,）,与其它实验室比较批量测试和盲法复检结果评价实验室能力。,痰涂片镜检质量保证体系,质量保证体系,(,QA),质量提高,(,QI),室间质量评估,(,EQA),室内质量控制,（,QC),批量测试,盲法复检,现场评价,为什么要进行,EQA,增加人员的责任心,推行标准化、规范化操作,确保实验室服务质量的提高,生物安全的需要,加强实验室网络、采集信息,痰涂片镜检,EQA,培训的意义,强化,EQA,的理解，有利于积极推广,提高实验室服务质量,提高对结核病实验室工作的重视,逐步提高结核病防治人员特别是结核病实验室工作人员的地位,控制结核病的五个主要阶段,结核杆菌被发现以前,1882年发现结核杆菌,1921年采用卡介苗接种,1944年链霉素用于抗结核治疗，随后多种抗结核药问世，开始了结核病的化疗时代,世界卫生组织（,WHO）,倡导结核病的短程督导化疗（,DOTS）,DOTS,策略,一、政府对国家控制结核病规划的政治承诺。,二、通过痰涂片显微镜检查发现传染性肺结核病人。,三、在直接观察督导下（至少治疗强化期），给予病人免费的标准的短程化疗方案。,四、定期不间断地供应抗结核药物。,五、建立和维持一个对结核病控制规划（主要是病人发现、登记报告和治疗结核）的监测系统。,病人发现的来源,（病人初诊单位）,（资料来源：2000年流调）,综合医院：34.1%,乡镇卫生院：28.7%,私人诊所：22.2%,中医院：3.7%,结防机构：4.3%,短程化疗的有效性,20,世纪,70,80,年代英国,W,Fox,教授首创短程化疗研究，先后进行了五次短化研究，设计了,26,套短程化疗方案，将传统的长程化疗疗程,18,24,个月缩短至,6,9,个月,。,6,个月短程化疗方案疗程结束时痰菌阴转率达到,97%,以上，停止化疗后随访,2,年细菌学复发率在,3%,以下。,化疗前后结核杆菌的定量分析,1976年,Yeager,报告对痰菌阳性病人在化疗前后做结核杆菌培养的定量分析,化疗前每,ml,细菌数10,6,10,7,化疗2周后减少至5,化疗4周减少至0.25,化疗后结核杆菌呈对数减少以至消失，降低了传染性,短程化疗的机理,利福平杀菌作用启动速度快，特别是对短暂生长繁殖的半静止菌群的高效杀菌作用,吡嗪酰胺对偏酸性环境中（如巨噬细胞内）结核菌的特殊灭菌作用,含有利福平和吡嗪酰胺的化疗方案可缩短疗程。这是短程化疗方案之所以能使疗程缩短为,6,个月的主要根据,细菌学诊断,显微镜检查术,培养,免疫学诊断,分子生物学诊断,Gen Probe,噬菌体检测方法(,FastPlaque),HPLC,其他,结核分枝杆菌的细菌学诊断,培养,on plates or in broth,identification by biochemical or serological tests on pure growth from single colony,显微镜检查,脱色,复染,染色,unstained or stained with e.g.Gram stain,药敏,血清学,DNA,方法,by disc diffusion methods,breakpoints or MICs,显微镜检查,Gram-,染色,抗酸染色,Ziehl-Neelsen,荧光染色,Direct,e.g.auramine,Immunofluorescence,培养,Solid media,Agar plates,For Identification,For Enumeration,Slopes,For safe long-term culture,e.g.Lowenstein-Jensen media for TB,Liquid media(broth),For enrichment or maximum sensitivity,菌种鉴定,形态学,生长条件,生化反应,酶,抗原,分子生物学方法,非培养的诊断方法,血清学检测,分子生物学方法,其他（,HPLC）,噬菌体生物扩增法 将分枝杆菌噬菌体感染结核分枝杆菌，未进入菌体内的噬菌体用特异的抗噬菌体物质灭活，进入菌体内的噬菌体得到保护而复制增殖，溶菌后释放子代噬菌体，将此噬菌体与快速生长的耻垢分枝杆菌混合，接种在固体培养基上培养，观察蚀斑的产生。蚀斑的数量与噬菌体数量有关，也与在含抗结核药物培养基上存活的结核分枝杆菌数有关。,噬菌体法（,Fast flaque),噬菌体生物扩增法原理示意图,噬菌体荧光素酶检测法,Jacobs,等将荧火虫荧光素酶基因导入分枝杆菌噬菌体，这种噬菌体感染分枝杆菌后，荧光素酶基因被代谢活跃的分枝杆菌活化，在菌细胞内,ATP,存在的条件下，可产生光子，通过荧光检测器测定发光信号。只有耐药的分枝杆菌才能在含药的培养墓上生长，产生光子，敏感菌和死亡菌不产生或产生后不能维持。,Gen Probe,方法检测结核分枝杆菌,1.原理,2.菌种鉴定,RNA/RNA,错配法,Nash,等(1997)首先将该法用于,RFP,耐药菌株培养物的检测。该法是基于双链,RNA,能抵杭,RNA,酶的消化的原理而建立的。将待检菌株以及药物敏感的参考菌株(,H37Rv),的,PCR,产物混合，加入,T7RNA,多聚酶和,SP6RNA,多聚酶，通过转录形成两条,RNA，,在进行杂交，若待检测株为敏感株，则形成两条互补的,RNA，,能抵抗,RNA,酶的消化，若待检测菌株有突变发生，则不能与参考株,RNA,链完全配对，加入,RNA,酶后，杂交产物将在突变位点被切开，通过电泳即可检测到。,Russia,Brazil,Tokyo,Sweden,Birkhaug,Danish,Prague,Glaxo,Tice,Frappier,Connaught,Phipps,Pasteur,Alpha,Methoxy,Keto,300,bp,200,bp,100,bp,Behr et al.J Bacteriol,2000,-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-,-,T-T-A-A-G-C-G-C-T-A-C,-,Bactec,放射呼吸测定 以含有放射标记的软脂酸为底物的液体培养基，自动测量分枝杆菌代谢14,C,软脂酸脱致过程中释放的14,CO2,的量。该法药敏报告可缩短为4一12天。,分枝杆菌生长指示管法,Bactec,放射呼吸测定法的替代方法。以培养基中加入荧光钌复合物代替放射性标记，其荧光衰减与细菌代谢过程中,O2,的消耗量有关。荧光衰减可通过一系列不同的紫外透照管检测。,Bactec,呼吸测定,流式细胞仪测定法,原理:分枝杆菌细胞内的非特异性脂酶能水解培养基中加入的荧光素复合物(,FDA),为游离的荧光素，因而分枝杆菌在生长过程中可造成荧光素的堆积，经,FCM,即可检测到。,比色法,MTT,法,MTT,法为线粒体琥珀酸脱氢酶的作用底物，可被活细胞还原形成不溶性的,Formazan,产物,其生成量与活细胞数量成正相关。,Formazan,经溶解后，可在酶标仪上测定其光吸收值。,微孔板美兰比色法 美兰为耗氧指示剂，有氧时为蓝色，无氧时为粉红色。,Franzblau,等以美兰为指示剂在96孔微量板中培养细菌，培养,基中加入抗结核药物，微量板用,Parafilm,封口膜封闭。若细菌为药物敏感株，可被加入的抗结核药物抑制或杀死，首先表现为氧消耗停止。而耗氧指示剂在各独立微小隔氧环境中的颇色变化可客观反映氧被消耗的程度，从而反映细菌的生长状态。,DNA,测序法,Hirano,等应用,DNA,测序法,DNA,测序法被认为是检测变异的“金标准”，可检测出待检基因上的所有突变位置和突变情况。利用,PCR,法扩增待检基因，,PCR,产物可直接测序，24一48,h,即可提供精确序列，并准确判定碱基突变的位点，已用于,RFP、INH、PZA、EMB,等耐药基因的检测。,基因芯片,基因芯片 将耐药基因的,DNA,或寡核苷酸序列标记到芯片上，从而快速的检测出突变位点，可以在3个小时内完成。,影响结核病控制的因素,DOTS(,直接面视下的短程化疗)；,全球范围的耐药结核病播散；,与,HIV,的共同感染；,流动人口中的结核病；,针对结核病新的特异性药物；,比,BCG,有效的新疫苗,耐药结核病,艾滋病和结核病,结核病与流动人口,抗结核药物耐药的发生,由染色体的自发突变而导致对某一种抗结核药耐药的发生频率为,10,-6,到,10,-8,不同药物耐药的突变位点不同，对同时使用的三种抗结核药同时耐药的频率为,10,-18,到,10,-20,联用三种有效的抗结核药物时，发生抗结核药物耐药的机率极少,WHO,（,2006,年）估算,每年,MDR-TB,新病例,30,万,-60,万,全球,MDR-TB,病例,100,万,我国2000年全国流调结核菌耐药状况,初始耐药：18.6%,初始耐多药率：7.6%,获得性耐药：46.5%,获得性耐多药率：17.1%,异烟肼、链霉素、利福平的耐药率无论在总耐药、初始耐药还是获得性耐药中，均居前3位，乙胺丁醇的耐药率较低。,利福平的耐药率有上升趋势，由,1984/85,年的第,5,、,6,位上升到第,2,、,3,位。,生长延迟（,lag period),-,药物 药物浓度 生长延迟,(,天）,g/ml,药物处理,6 h 24 h,-,异烟肼,1 0 6 9,利福平,0,.2 2 3 2 3,链霉素,5 8 10 8 10,乙胺丁醇,10 0 4 5,-,患者临床株的生长延迟,耐药性产生,自然耐药性和敏感性,:,种属性 突变耐药性：个体属性,1.,靶基因突变（基因型）,自发,无需药物存在固有频率,高度耐药,种属性、药物属性,频率,/,菌,/,代期,突变频率低：,INH 2.56,10,-8,SM 2.95 10,-8,RFP 2.25 10,-10,EMB 1 10,-7,结核杆菌错配修复限制：硷基选择（,亚基）,+,外切酶校正（,亚基）,-,复制后错配修复,-,2,.,药物失活酶 链霉素磷酸化酶,异烟肼乙酰华酶,3.,质粒耐药,:,基因型 接触传染,-,频率高,药物修饰酶,4.,生理耐药,:,耐药表型 持留菌的 药物耐受性,敏感基因型,靶编码基因及耐药相关突变,-,药物 作用机制 参与基因 编码蛋白 突变频率（,%,）,-,异烟肼 抑制分支菌酸,inhA,脂肪酸合成酶,21 34,氧自由基,katG,触酶,/,过氧化物酶,42 58,多效应,kasA,利福平 抑制,RNA,转录,ropB RNA,聚合酶,96 100,吡嗪酰胺 酸化胞浆,pncA,吡嗪酸酶,72 79,脂肪酸合成,fas,脂肪酸合成酶,链霉素 抑制蛋白合成,rps L,核糖体蛋白,L12 52 59,rrs 16S rRNA 8 21,乙胺丁醇 抑制脂阿拉佰,embCAB 47 65,半乳聚糖,喹诺酮 抑制,DNA gyrB B,亚基,回旋酶,-,艾滋病和结核病,结核病是,HIV,感染者的首要死亡原因,HIV,加剧了结核病的流行,结核病及,HIV/AIDS,规划之间的合作不密切,结核病是艾滋病病人最常见的机会性感染，一般约占20-50%艾滋病病人1/3死于结核病,1997,2004,年国内某医院,艾滋病65例中,合并真菌感染38例（58.5%）,合并结核病23例(35.4%),半年内死亡21例,合并结核病者死亡11例（占23例之47.8%）,未合并结核病者死亡10例(占42例之23.8%),-,中华结核和呼吸杂志2004,Vol.27,No.11,结核病与流动人口,流动人口群体急剧增加,1982,年，流动人口总量为三千万，,1985,年为四千万，,1988,年为七千万，,1994,年为八千万，,1997,年突破一个亿。,流动人口数量以平均每年五百万的速度增长，,2003,年达到一亿五千万。,到,2020,年将再增加,3,亿人。,流动人口的特点,劳动就业和生活居住问题。,流动人口多为青壮年劳动力，近年来流动人口中的女性所占比例逐渐增加，北京市丰台区，1996年流动人口的女性比例是21.8%，2000年达到31.4%；,流动人口中家庭化趋势，随着流动人口长期化和相对固定，流动人口中流动户逐渐增加，现约占外来人口总量的30%。,流动人口的经济、生活条件差，劳动力数量不断增加，劳动力供给与需求之间形成较大反差。家庭化倾向加重了经济负担，居住和生活条件更加困难。,抗结核病药物的研究前景,传统的药物是针对生长或分化期的结核菌，如细胞壁生物合成、染色体复制等，对慢生长或静息期结核菌的弱作用是需要很长时间治愈结核病的原因,需要新的抗结核药物治疗耐多药结核病,疫 苗,理想疫苗的要求：,安全经济；,不影响,PPD,用于诊断；,有保护性，能预防结核病的发生，也具有抗结核感染的作用，免疫效应持续时间长并能引起免疫记忆；单次小剂量的应用有保护性；,能纳入计划免疫，不干扰其它疫苗的保护性,未来可得的疫苗：,修饰的,BCG、,抑制相关基因的减毒株疫苗、活载体疫苗、死疫苗、亚单位疫苗及,DNA,疫苗,生物安全柜,中国疾病预防控制中心,王秋娣,安全设备和个体防护,生物安全柜是最重要的安全设备，是实验室形成最主要的防护屏障之一。,必要时实验室应配备其他安全设备。,必须给实验室工作人员配备必要的个体防护用品。,生物安全柜,在操作,具有感染性的实验材料时：,作为,一种隔离屏障,防止气溶胶的扩散。,将在操作过程中产生的气溶胶局限在安全柜内,保护,操作者本人,实验室环境,实验材料。,使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的,感染性气溶胶和溅出物而设计的。,个人防护装备,装备包括：,1、眼镜（安全镜、护目镜）,2、口罩、面罩、防毒面具,3、帽子,4、防护衣(实验服、隔离衣、连体衣、围群),5、手套,6、鞋套,7、听力保护器等。,个体防护的配备原则,BSL1,实验室,工作人员在实验时应穿工作服，戴防护眼镜。,工作人员手上有皮肤破损或皮疹时应戴手套。,个体防护的配备原则,BSL2,实验室,除符合,BSL1,的要求外，还应该符合下列条件：,在实验室中应穿着工作服或罩衫等,防护服,。离开实验室时，防护服必须脱下并留在实验室内。不得穿着外出。用过的工作服应先消毒，然后统一洗涤或丢弃。,当手可能接触感染材料、污染的表面或设备时应戴手套,如可能发生感染性材料的溢出或溅出，宜戴,两副手套,。不得戴着手套离开实验室。工作完全结束后方可除去手套。,个体防护的配备原则,一次性手套不得清洗和再次使用。,当微生物的操作不可能在生物安全柜内进行，而必须采取外部操作时，为防止感染性材料溅出或雾化危害，必须使用面部保护装置（护目镜、面罩、个体呼吸保护用品或其他防溅出保护设备）。,生物安全柜的定义,主要的保护屏障，防止生物有害气溶胶逃逸,.,保护操作人员,保护周边环境,可以保护样品,Class II,生物安全柜,在生物安全柜上工作,理想的工作台摆放原则（,清洁,-,污染区,）,在工作台面上的实验操作应该按照从清洁区到污染区的方向进行,被污染的区域,垃圾袋,干净的物品,废弃物托盘,病原微生物实验室的消毒与灭菌,卫生部临床检验中心,胡继红,2006.5.,亲脂类病毒或中等大小的病毒,（如：,HSV,CMV,RSV,HIV,HBV,）,细菌繁殖体（如：金葡，绿脓）,真菌（如，念珠菌属，曲霉属）,非脂类或小病毒（如脊,髓灰质炎病毒,柯萨奇病毒）,分枝杆菌（如,TB,，,M.terrae,）,Cryptosporidium,parvum,细菌芽孢,Prions,敏感,耐受,低效,中效,高 效,灭菌,（高，延时）,消毒剂水平,气体灭菌,蒸汽灭菌,消毒剂种类,（按照标签说明使用）,高效,（水平）消毒剂：杀灭所有微生物，除了,大量细菌芽孢。,中效,：杀灭所有微生物，除了细菌芽孢。,低效,：杀灭多数细菌繁殖体和脂膜（亲脂性）或,中等大小的病毒。,最低有效浓度,：液体化学杀菌剂能达到产品标明,能杀灭的微生物范围的活性。,常用化学灭菌剂的性能比较,杀菌剂,使用浓度（）,消毒水平,灭活,特征,细菌,亲脂类病毒,亲水类病毒,结核分枝杆菌,细菌芽孢,含氯,高效,+,+,+,+,+/-,过氧乙酸,0.001,0.2,高效,+,+,+,+,+,戊二醛,2,化学灭菌,/,高效,+,+,+,+,+,甲醛,3,8,高效,/,中效,+,+,+,+,+/-,酒精,60,95,中效,+,+,-,+,-,季胺 盐,0.4,1.6,低效,+,+,-,-,-,生物安全柜污染的清除,生物安全柜在移动以及更换过滤器之前，必须清除污染。最常用的方法是采用甲醛蒸气熏蒸。应该由,有资质的专业人员,来清除生物安全柜的污染。,仪器设备在使用时，有些操作可能造成微生物学危害，此外，还必须预测并预防与仪器设备相关的其他安全危害。,诊断试验研究与评价,中华检验医学杂志编辑部 史红,E-mail,：,shihong,内容,诊断试验概述,诊断试验的研究方法,评价诊断试验的指标,诊断试验指标的应用和意义,提高诊断试验效率的方法,研究和评价诊断试验的目的,正确认识诊断试验的临床应用价值,合理和正确选择诊断试验,最终目的,提高疾病的诊断水平,促进疾病的有效治疗,选择诊断试验的标准,诊断试验的效力（敏感性和特异性）,安全性,费用,可行性,结果的重复性,病人是否方便和舒适,是否能改善患者的结局,诊断试验的研究方法,1.,确定金标准,当前医学界公认的诊断某种疾病的最可靠方法,包括：,外科手术发现,病理学诊断（组织活检和尸体解剖）,细菌培养,影像学诊断,临床医学专家共同制订的诊断标准（诊断风湿热的,Johes,标准）,长期临床随访等,2.,合理选择研究对象,诊断试验的研究对象包括两组,金标准确认的病例组,金标准证实无该病的患者，称为对照组,诊断试验的临床价值,不是取决于是否能区分正常人与重型病例,而是取决于能否区分容易混淆的疾病或疾病的严重程度,诊断试验的研究对象不能选择正常人,3.,盲法、独立和同步比较诊断试验与金标准的结果,新的诊断试验与金标准盲法比较（,Blinding comparison,）,要求判断诊断试验结果者不能预先知道金标准划分研究对象的结果,将金标准划分的病例组和对照组，以及由诊断试验测试所有研究对象获得的阳性、阴性结果进行同步比较,列出四格表，计算相关指标,金标准,合 计,有病,无病,诊断,试验,阳性,真阳性,a,假阳性,b,a+b,阴性,假阴性,c,真阴性,d,c+d,合 计,a+c,b+d,N,4.样本含量计算,确定所需的最少样本量,诊断试验样本量的大小与下列因素有关：,试验的敏感度：用于疾病筛查要求敏感度高,试验的特异度：用于疾病确诊要求特异度高,允许误差范围：,0.05-0.1,采用敏感度计算病例组样本量、特异度计算对照组样本量,样本含量计算公式,n,：为病例组或对照组样本量,：正态分布中概率为,/2,时的值,：允许误差，一般为,0.05-0.1,p,：敏感度或特异度,n=,2,p(1-p),2,1.敏感度（sensitivity）,金标准诊断为“有病”的病例中，诊断试验检测为阳性例数所占的比例,真阳性例数愈多，则敏感度愈高，漏诊病例（漏诊率）愈少,Sen=a/(a+c),N,b+d,a+c,合 计,c+d,真阴性,d,假阴性,c,阴性,a+b,假阳性,b,真阳性,a,阳性,诊断,试验,无病,有病,合 计,金标准,2.特异度（specificity）,金标准诊断为“无病”的病例中，诊断试验检测为阴性例数所占的比例,真阴性例数愈多，则特异度愈高，误诊病例（误诊率）愈少,Spe=d/(b+d),N,b+d,a+c,合 计,c+d,真阴性,d,假阴性,c,阴性,a+b,假阳性,b,真阳性,a,阳性,诊断,试验,无病,有病,合 计,金标准,3.,阳性预测值,（,positive predictive value,）,诊断试验检出的全部阳性例数中，真正患病的例数（真阳性）所占的比例,+PV,a/(a+b),N,b+d,a+c,合 计,c+d,真阴性,d,假阴性,c,阴性,a+b,假阳性,b,真阳性,a,阳性,诊断,试验,无病,有病,合 计,金标准,阴性预测值（,positive predictive value,）,诊断试验检出的全部阴性例数中，真正“无病”的例数（真阴性）所占的比例,-PV,d/(c+d),N,b+d,a+c,合 计,c+d,真阴性,d,假阴性,c,阴性,a+b,假阳性,b,真阳性,a,阳性,诊断,试验,无病,有病,合 计,金标准,提高诊断试验效率的方法,1.选择患病率高的人群,一个诊断试验的敏感度和特异度已固定,阳性预测值受患病率影响，呈正相关,患病率高的人群，阳性预测值显著提高,2.采用联合试验,同时具有高敏感度和特异度的试验较少,可联合使用多个试验诊断某种疾病，提高敏感度或特异度,联合试验,平行试验（,parallel test,）,序列试验（,Serial test,）,谢谢大家！,