南农生物分离工程修改生物分离6凝胶.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第六章,凝胶层析,凝胶层析的基本原理,凝胶介质的基本性质,凝胶层析的基本操作,凝胶介质的选用原则,分子筛色谱（凝胶过滤）,Gel filtration chromatography,层,析法所用的,凝胶颗粒,大小要均一，,颗粒,內外,贯,穿,许,多小孔,径,的通路，分子量小的,物质,，比,较,容易,进入颗粒,中，因此被延,滞,流出。,对凝胶过滤介质的要求,亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任何化学或物理相互作用；,稳定性强，在较宽的,pH,和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长，,具有一定的孔径分布范围；,机械强度高，允许较高的操作压力（流速）。,凝胶特性参数,内水体积,V,i：,孔体积,外水体积,V,o：,颗粒间体积,柱床体积,V,t,V,t,=V,o,+V,i,+,Vg,Vt=Vi+Vo,洗脱体积,V,e,V,e,=V,o,+K,d,V,i,K,d,=(V,e,-V,o,)/V,i,凝胶特性参数,排阻极限（,exclusion limit,）,是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。例如,Sephadex G50,的排阻极限是30,kD。,分级范围（,fractionation range,）,能被凝胶阻滞并且,相互之间可以得到分离,的溶质的相对分子质量范围。,Sephadex G50,的分级范围为1.530,kD。,凝胶粒径,凝胶一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。,粒径越小，分离效率越高。,凝胶粒径多用筛目或微米表示。软凝胶粒径较大，一般为50150,m,（,100200,目），例如，,Sepharose,和,Sephadex,凝胶粒径分布为45165,m。,硬凝胶粒径较小，一般为550,m。,床体积（,bed volume,）,即,1 g,干燥凝胶溶胀后所占有的体积。,Sephadex G50,的床体积为91,1 cm,3,/g,干胶。,空隙体积（,void volume,）,即,V,0,值。空隙体积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定，一般使用平均相对分子质量为2000,kD,的水溶性蓝色葡聚糖,（,blue dextran,）。,对于商品化的凝胶过滤介质，厂商的产品目录中一般均给出其凝胶的各种性质，如分级范围、粒径、流速与压力的关系等，可参考使用。,GFC,的优点,溶质与介质不发生任何形式的相互作用，因此可采用,恒定洗脱,法洗脱展开，操作,条件温和,，,产品收率可接近100,；,每批分离操作结束后,不需要,进行介质的,再生,，故容易实施循环操作，提高产品纯度；,作为脱盐手段，,GFC,比透析法速度快，精度高；与超滤法相比，剪切应力小，蛋白质活性收率高；,分离机理简单，操作参数少，容易规模放大。,GFC,的不足之处,仅根据溶质之间分子量的差别进行分离，分离较慢、需严格,控制流速,；,经,GFC,洗脱展开后产品被稀释。因此需要在具有浓缩作用的单元操作（如超滤、离子交换和亲和色谱等）后使用。,凝胶的结构和性质,葡聚糖系,其中,Sephadex G,是最传统的软凝胶过滤介质之一，目前仍被广泛使用。,Sephadex G,是利用葡聚糖（右旋糖酐）交联制备的，交联剂一般采用环氧氯丙烷,。Sephadex,凝胶按交联度大小，分,G 10G 200,共八种型号。,G-10,G-15,G-25,G-50,G-75,G-100,G-150,G-200,吸水量,（,g/g,干凝胶）,1.0,1.5,2.5,5.0,7.5,10.0,15.0,20.0,工作范围（肽与蛋白）,D,700,1500,5000,1500-20000,3000-70000,4000-150000,5000-300000,5000-500000,性质,对稀酸、稀碱、盐溶液稳定,湿态的葡聚糖可加热到,110,，干的则能耐受,120,高温,交联度稳定性,凝胶含少量羧基，对阳离子轻微吸附，操作时使,I0.02mol/l,芳香族、杂环化合物有时,Kd,1,新凝胶柱非特异性吸附蛋白，先用廉价较惰性蛋白饱和吸附、洗涤,规格编号,间接反映凝胶孔径、渗入限、排阻限,G-50,分离限1500-30000,G-150：5000-400000,对蛋白、多糖分离范围不同,（多糖分子体积比相同,M,的蛋白大）,粒度：直径100-300,um,粗粒,20-80,um,细粒,40-120,um,中粒,保存,湿法：悬浮于水、缓冲液中，0.02%,NaN,3,，0-5,干法：乙醇分步处理（20%，40%，60%，80%）,脱水收缩，抽滤，60-80 吹干，室温,半缩法：60-70%乙醇悬液，封口，4,修饰葡聚糖凝胶,亲脂性 引入有机基团,Sephadex LH-20（,羟丙基）（原,Sephadex G-25）,流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂,氯仿、四氢呋喃,，,因此,适用于非水溶性溶质的凝胶过滤,交联葡聚糖离子交换剂,引入,CM-，DEAE-，,离子交换、分子筛,人工合成凝胶，控制,凝胶总浓度,和,交联剂,的用量可制成各种型号的凝胶，交联剂越多，孔隙越小。,商品名为,Bio-Gel，,型号从,P-2,至,P-300,共,10,种,（,数字,X1000,就相当于该凝胶的排阻限度）,特点：化学稳定性好,pH2-11，,无非特异性吸附，,不为微生物利用,粒度：粗150-300,um,中75-150,um,细40-75,um,极细40,um,聚丙烯酰胺,凝胶,是由,海藻多糖,琼脂中分离出来的天然凝胶，,常见的有,Sepharose,（,Sepharose 2B,、,4B,、,6B,，,数字代表,干胶的百分比）,Bio-Gel-A（,美国）,等,（,Bio-Gel-A,0.5M,、,1.5M,、,5M,、,15M,、,50M,、,150,M,，,数字,X10,6,代表排,阻限度。,骨架各线性分子间以氢键相连，,孔径依赖于浓度,琼脂糖凝胶,特点,：,1.化学稳定性差，,pH4-9,2.,脱水、干燥、冷冻、有机溶剂、,温度高于,40,便融化,3.与硼酸形成配合物，孔径变化，避免,4.,强度低,，随凝胶浓度而，弹性小，调整柱压,5.非特异性吸附力葡聚糖，,I0.01mol/l,无明显吸附,6.,分离的,M,范围大,（10,8,），随凝胶浓度而,架桥琼脂糖凝胶,Sepharose CL,1，3-,二溴丙醇,交联,，孔径均匀，,孔径大小和分离范围与普通,琼脂糖,一样，但,机械强度,，热稳定性，化学稳定性（,pH3-14）,超胶（,ultro-gel ACA),琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶,比,Sepharose,化学稳定性好，强度高，,pH3-10，,热稳定性不变,ACA 34：,丙烯酰胺3%，琼脂糖4%,分离范围：生物胶,P,超胶琼脂糖,多孔玻璃微珠,Bio-Glas 500,孔径500,将多孔硅酸盐玻璃加工制得，粉末状，可粘合,特点,：化学稳定性高，强度大，耐高压，,对糖、蛋白有吸附，用聚乙烯二醇浸泡钝化,实验操作,凝胶介质的选择,将样品中的大分子物质与小分子物质分开，其分,离策略,是,使高分子物质完全,被排阻,，,小分子物质完全渗入凝胶内。,类分离一般选用,Sephadex G-25,蛋白脱盐,（分子量范围,1000-5000,）或选用,G-50,。,对于小肽和低分子量的物质的脱盐可选用,Sephadex G-10,、,G-15（,分子量范围,-1500）,、,Bio-Gel P-2,或,P-,4,类分离,凝胶介质的选择,将样品中一些分子量比较接近的物质分开，,该策略是,使,M,尽量在分离范围的两侧 3个组分：,Kd 0 0.5 1,在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶,内部，但由于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。,分离血清蛋白可用,G200 5000-800000,强度低,或,G150 5000-400000,分级分离,粒度的选择,细粒：流速低，洗脱峰窄，分辨率高，精制或分析,粗粒：用于粗制、脱盐,凝胶的预处理,将干胶颗粒悬浮于10倍以上吸液量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀。加热可使溶胀加速，即在,沸水浴,5小时即可达到凝胶的充分溶胀。,加热法既可节省时间又可,排气,、消毒。,商品悬浮液去除保存液、抽滤、洗涤、平衡,不需溶胀,层析柱的选择,柱比：长度/直径、体积,类分离：柱床体积为样品体积,5倍,或略多,柱比,5:1-10:1,分级分离：,25-100倍,柱比,25-100,大柱、长柱流速慢、稀释严重、分辨率高,实验室用的层析柱,工业用的层析柱,装柱,1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。,2.,先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约,1/3,柱容积的洗脱液，将凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约,2-3,cm,后，打开柱的出口，使凝胶继续沉集，装柱完毕，关闭出水口。,不能出现分层、倾斜、气泡,凝胶柱的平衡,通过,2-3,倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，,以防加样时凝胶被冲起,，并始终保持凝胶上端有一段液体。,上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：,进样体积,进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的,10%,进行分级分离时，样品溶液的体积要小，这样洗脱出的峰形好，,蛋白类浓度4%,洗脱,用水、缓冲液、水-甲醇、水-丙酮、氨水、醋酸,温度、流速、柱压、阻力恒定,防止非特异性吸附,操作压流速快，峰宽,相当大柱压范围内,v=KP/L,相同操作压，编号小，交联度大，颗粒粗，流速大,部分收集器,部分收集器,返回,自动馏分收集仪（进口）,再生,重复使用,流速下降、板结可反冲，取出漂洗,凝胶床的检查和维护,使用时间过长、流速过大、柱高过大，流速,控制操作压：柱进出口液位差,凝胶的保存：,0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰,返回,蠕动泵,核酸蛋白检测仪,返回,记录仪,返回,国产柱层析系统,伯乐公司,（,BIO-RAD）,柱层析系统,注意事项,1）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损。,2）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免压紧凝胶。,3）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。,应用,生物大分子溶液的脱盐,用 大粒度、高交联度凝胶,使蛋白,Kd=0,，,盐类,Kd=1,蛋白脱盐后溶解度降低，吸附或沉淀，用稀盐（易挥发盐）洗脱，真空干燥 样品体积,Vi/3,去热原,Sephadex G-25,氨基酸,Kd=1,热原,Kd=0,样品体积 30%,Vt,分离纯化,GFC,可用于相对分子质量从几百到10,6,数量级的物质的分离纯化。,G-50,除去结晶胰岛素中前胰岛素、大分子抗原,G-25,除去青霉素中抗原性杂质、致敏、高分子杂质,右图是一例利,用高效,GFC,分离骨髓,血清蛋白质的结果。,色谱柱：,10,300,，,Superose 6,洗脱液：,0.05,mol,L,磷酸盐,0.15,mol,L NaCl,（,pH7.0,）,流量：,0.2,ml,min,1.IgA,高聚体,2.,IgA,二聚体,3.,IgA,单体,4.,IgG 5.,白蛋白,相对分子质量的测定,在凝胶过滤介质的分级范围内,蛋白质的分配系数（或洗脱体积）与相对分子质量的对数成正比,，所以,GFC,可用于未知物质相对分子质量的测定。,GFC,仅对球形分子的测量精度较高，对分子形状为棒状的物质，测量值将小于实际值。,理化性质鉴定,已知分子量的标准品,测未知分子量,：,将样品在同一凝胶柱上，同一条,件下层析、洗脱、测保留体积，并查出分子量。,此法简便、样品用量少，有一定的实用价值。,凝胶柱,洗脱体积,分子量的对数,2.理化性质鉴定,绘制标准曲线,凝胶层析技术进行测定,主要参数测算,Vo,通常占柱床30%,Vo、Vi,1.,重量法,Vt=Vo+Vi+Vg=,d,2,h/4,Vi=gWr g-,干胶重量,Wr-,吸液量/,g,干胶,Vo=Vt-(Vi+Vg)Vg,估算为1,3,/,g,干胶,2.,过柱法,Ve=Vo+KdVi,210,6,蓝色葡聚糖,Kd=0,重铬酸钾,Kd=1,Kd、Kav,Kd=(Ve-Vo)/Vi,Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo),对于特定凝胶，,Kd、Kav,是物质特征常数,对于特定凝胶柱，,Ve,是特征常数,可判断各组分分离，预测放大柱床后,Ve,分辨率,R=,Ve/0.5(W,A,+W,B,),R1,完全分开,Ve,A,=Vo+Kd,A,Vi,Ve,B,=Vo+Kd,B,Vi,Ve=Vi(Kd,B,-Kd,A,),提高分辨率,使,Vi,增加即增加柱床体积,使,(,W,A,+W,B,),减小，可浓缩样品，使用细粒凝胶，低流速操作,