分离分析新技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,超临界流体萃取技术,一,.,基本原理,1,.,超临界流体的特性,相态,性质 气体 超临界流体 液体,密度,(kg/m,3,)1.0 7.0,10,2,1.0,10,3,黏度,(Pas)10,-6,10,-5,10,-5,10,-4,扩散系数,(,m,2,/s,)10,-5,10,-7,10,-9,(1),被提取物的性质,(2),压力的影响,(3),温度的影响,(4),夹带剂的影响,2,.,超临界,CO,2,流体的溶解性能,蜂胶的,SFE,纯化流程,(1),萃取压力,(2),萃取温度,(3),CO,2,流量,(4),萃取时间,(5),粒度,(6),夹带剂,二,.,超临界,CO,2,流体萃取工艺的影响因素,1.,超临界,CO,2,流体萃取穿心莲有效成分,功效：清热解毒、消肿止痛。,有效成分：二萜内酯类化合物,(,穿心莲内酯,、,脱水穿心莲内酯,、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯,),传统方法：,水提法：,ChP1990,淘汰,醇提法：热浸：得率较高、,有效成分容易分解或聚合,、杂质较多,冷浸：质量较好、杂质少、有效成分不分解、,生产周期较长,超临界,CO,2,流体萃取法：所得有效成分含量较高、具有该药的天然香味,三,.,超临界流体萃取在天然药物提取中的应用,穿心莲不同提取方法所得浸膏的质量比较,质量指标,超临界,CO,2,流体,95%,乙醇提取,穿心莲内酯,脱水穿心莲内酯,总内酯含量,总内酯提取率,色泽,气味,杂质,有效成分制药干燥损失,成药中药粉流动性,药粉外观,药粉气味,药效,19%,12%,42%,98%,墨绿色,(,原药色,),原药香味,少,1/10,好,墨绿色、干爽、油脂多,含原料药香气,好、稳定,10%,4%,24%,60%,深棕色,焦味,多,1/3,差,棕色、结块、油脂少,无,差、不稳定,2.,挥发油的提取,传统提取方法的缺点：易造成挥发油的分解或氧化等；,收率普遍较低,实例：月见草油,SFE,提取,25 MPa,50,萃取率,20%,-,亚麻酸,10.6%,色泽与透明度,-,亚麻酸,杏仁油：,SFE,与石油醚提取工艺比较 收油率是后者的,2.5,倍,薄荷挥发油：,23 MPa,55,加,7%,乙醇夹带剂 薄荷醇收率,0.16%,比水蒸汽蒸馏法 高,3,倍,比有机溶剂法 高,0.6,倍,优于溶剂法,四,.,超临界流体萃取技术展望,(1),成本上难以与传统提取工艺竞争,(2),对许多强极性和分子量较大的成分很难进行有效地提取,(3),基础研究比较薄弱,(4),需要结合传统中药所要求的药效来考察有效成分是否被萃取出及性能是否稳定,(5),考虑中药成分的协同和互溶作用,大孔树脂吸附分离技术,一,.,大孔吸附树脂的结构、原理和特点,1.,大孔吸附树脂的结构、原理及种类,(1),结构 新型非离子型高分子聚合物吸附剂 白色球形颗粒,20-60,目 具多孔性,聚合单体 苯乙烯,交联剂 二乙烯苯,致孔剂 甲苯、二甲苯,(2),分离原理 吸附性和筛选性相结合,(3),大孔树脂的种类 按化学结构分为以下四类：,非极性 如苯乙烯、二乙烯苯聚合物,中极性 存在极性基团,COOR,具有一定的极性,极性 含硫氧、酰胺、腈等基团 如丙烯酰胺 极性大于酯基,强极性 如吡啶基、氨基等,牌号 生产厂 结构 比表面积 孔径（,nm,）,非极性,Amberlite XAD-2,罗姆哈斯（美）,PS 330 4.0,Amberlite XAD-3,罗姆哈斯（美）,PS 526 4.4,Amberlite XAD-4,罗姆哈斯（美）,PS 750 5.0,ADS-5,南开大学,PS 550 20-25,ADS-3,南开大学,PS 1000 5-6,Amberlite XAD-6,罗姆哈斯（美）,-COOR 498 6.3,Amberlite XAD-7,罗姆哈斯（美）,-COOR 450 8.0,ADS-8,南开大学,-COOR 140 25.0,Amberlite XAD-9,罗姆哈斯（美）,Amberlite XAD-10,罗姆哈斯（美）,250 8.0,ADS-16,南开大学 酰胺,69 35.2,Amberlite XAD-11,罗姆哈斯（美）氧化氮类,170,Amberlite XAD-12,罗姆哈斯（美）氧化氮类,25 21.0,ADS-7,南开大学,-NR 200 130,一些代表性的大孔吸附树脂,2.,大孔吸附树脂的特点,(1),分离性能优良 选择性良好 分离效能高 脱色能力强,(2),理化性质稳定 稳定性高 机械强度好 经久耐用,避免环境污染和对设备的腐蚀,(3),应用范围广 与离子交换树脂相比,pH,不变,发酵液分离抗生素,(4),使用方便 流体阻力小,(5),溶剂用量少 避免乳化现象 提高提取效率,(6),可重复使用 再生容易,(7),其他方面 价格较贵,吸附效率易受流速和溶质浓度的影响,品种有限,操作较复杂 对树脂的技术要求较高,二,.,大孔吸附树脂吸附分离技术要求,大致操作步骤：,树脂预处理树脂上柱药液上柱树脂的解吸,树脂的清洗、再生,树脂预处理：加甲醇或丙酮浸泡,24,小时，加热回流洗脱,装柱：蒸馏水湿法装柱，乙醇流动清洗，大量蒸馏水清洗,药液的上柱吸附：,（,1,）泄漏曲线与吸附容量的考察,（,2,）药液上柱前的预处理,（,3,）上柱工艺条件的选择,树脂自身特性、样品浓度、,pH,值、吸附柱径高比、上样流速,（,4,）树脂的解吸,树脂的清洗、再生：,无水乙醇或,95,乙醇洗至无色，大量水洗去醇,三,.,大孔吸附树脂技术,在天然药物提取纯化中的应用,在天然药物有效成分的提取、纯化领域大有用途：,1.,许多提取成功的单味中草药，奠定良好的基础,2.,不断有新型的吸附树脂问世,到目前为止,已成功用于,黄酮类,、,皂苷类,、,生物碱类,、,酯类,、,萜类,等成分的分离,1.,黄酮类药物的提取,实例：,银杏叶提取物 （,GBE,）,主要有效成分,黄酮苷,萜内酯,溶剂萃取法,24,6,树脂吸附法,Amberlite XAD-7 30,未达标,Duolite-761,达标 达标,ADS-F8 60,65,2530,其他中草药：毛冬青根、山楂、葛根、黄芩根、苦荞麦、沙棘等,2.,皂苷类药物的提取,实例：,绞股蓝皂苷,研制出强极性吸附树脂,ADS-7,、,S-038,S-038,，吸附量达,65.5 mg/ml,，,70,乙醇洗脱,人参皂苷,吸附和脱色双重作用,ADS-7,，,70,乙醇洗脱，粗品（棕色）白色或微黄色,实例：,绞股蓝皂苷,绞股蓝：葫芦科植物绞股蓝的根状茎或全草，多年生草质藤本植物,功效：镇咳、清热解毒,有效成分：,皂苷,、,黄酮类,、,多糖类,“绿色的金子”“第二人参”“人参宝草”,提取工艺：,绞股蓝干茎叶 热水浸提 浸提除杂 树脂吸附,乙醇解吸 脱色 浓缩干燥 粉碎 绞股蓝皂苷粉末,7-8,倍热水,浸提三次,调节酸碱性,静置除杂,DA,大孔树脂,水洗除杂,50%,乙醇,70%,乙醇,DB,树脂,真空干燥,80-100,目,3.,生物碱的提取,实例：,喜树碱,弱碱,AB-8,pH 8,，盐浓度,(1-2.5)mol/L,吸附量达,160 mg/g,小檗碱,碱性大 水溶性大,10%H,2,SO,4,10%NaOH,非极性吸附树脂,小檗碱含量为原生药含量的,97%,4.,影响大孔树脂分离纯化天然药物效果的因素,(1),树脂性质,吸附容量大 吸附速度快 机械强度好,(2),药液,pH,酸性物质易在酸性溶液中被吸附,碱性物质在碱性溶液中被吸附,(3),药液浓度,符合,Frendich,和,Augmur,经典吸附式,(4),上柱液温度,室温,(5),盐浓度,无机盐的加入降低了吸附质在介质内的溶解度,(6),树脂柱径高比,合适的径高比为分离提供较高的柱效,(7),树脂柱的清洗,非吸附性成分 水,吸附性杂质 一定浓度的酸或碱液,(0.1-1.0 M NaOH,或,HCl),(8),洗脱液的选择及解吸,制备色谱技术,色谱技术：,有效成分的定性与定量工作,开发出疗效好、质量指标明确的中药新药,一,.,色谱技术的基本原理,按照分离过程的原理不同分为：,吸附色谱,分配色谱,离子交换色谱,凝胶色谱,亲和色谱,二,.,制备色谱工艺流程,单色谱柱：最简单、最为常用，能分离复杂组分的混合物,溶剂消耗量大，回收溶剂的能耗高,模拟移动床色谱：分离效率高、溶剂消耗低、便于连续操作,设备复杂、工艺要求高,柱切换、移动进料和移动接口色谱等：,实现复杂组分分离、大大提高吸附剂生产率、,减少溶剂消耗、减少设备投资和操作费用,三,.,常用的制备色谱工艺,1.,薄层色谱,操作简单、费用低廉、应用广泛,新型薄层色谱法,离心制备薄层色谱,（,PCLC,）,旋转离心、连续洗脱的圆形色谱技术，分离效果优于常规的制备薄层色谱和柱色谱,独特的优点：,对固定相不会造成损坏,装填容量、分离速度和分离效能得到极大提高,实例：,龙胆属植物,Sstrictiffora,甲醇提取物,bellidifolin,和,desmethylbellidifolin,离心薄层色谱法 聚酰胺开口柱色谱,30 min.12hr.,2.,柱色谱,特殊的柱色谱：,（,1,）干柱色谱,干法装填上样洗脱推出、切割谱带溶剂萃取,特点：溶剂消耗很少，操作迅速（,15,30min,）,（,2,）真空液相色谱,(VLC),抽真空装柱低极性溶剂冲柱上样洗脱收集馏分、抽干,特点：操作简便、处理量大（一次可达,30g,）,3.,压力液相色谱,(PLC),闪蒸色谱,(,约,0.2 MPa),价格低廉、操作方便,低压液相色谱,(,2.0 MPa),分离效率高、应用范围广,实例：银杏内酯,A,、,银杏内酯,B,、白果内酯的分离纯化,硅胶,H,柱,(10-40,m,),流动相：乙酸乙酯石油醚（,8,：,2,）,(5),超临界流体色谱,介于液相色谱和气相色谱之间的色谱方法,特点：分离速度快、产品易回收、应用范围广、有可能替代正相,HPLC,4.,离子交换色谱,固定相：离子交换树脂,可再生性和重复使用性,交换功能基团,：,阳离子和阴离子,形态,：,凝胶型（水溶胀）和大孔型（永久性微孔）,特点：使用方便、成本低廉、重复使用性好、分离速度快,应用范围：生物碱、糖类、氨基酸、蛋白质以及核酸,实例：总生物碱制备,生药粗粉,0.1%HCl,渗漉强酸性阳离子交换树脂蒸馏水洗,树脂倒出晾干,10,%,NaOH,碱化树脂氯仿回流干燥重结晶,5.,逆流色谱,(CCC),以液相物质为固定相的液液色谱,离心逆流色谱,(CCCC),：,（,1,）分离物质的极性范围很宽,（,2,）没有拖尾现象,（,3,）样品定量回收,实例：银杏叶中的黄酮糖苷,固定相：水，流动相：乙酸乙酯乙酸乙酯（异丁醇）,乙酸乙酯,/,异丁醇,(6:4),高速逆流色谱,(,HSCCC),6.,其他形式色谱,体积排阻色谱,分子筛机理,凝胶过滤色谱,凝胶渗透色谱,优点：操作简单、快捷、流动相选择宽泛,(2),亲和色谱,大多被利用来分离纯化生物大分子,载体：,琼脂糖凝胶,、交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶,(3),疏水作用色谱,主要分离对象为蛋白质,特点：分离条件温和，易于保持生物蛋白质的活性,7.,多种色谱方法的联用,最初分离步骤：如闪蒸色谱、逆流色谱或凝胶过滤色谱等,最后的纯化过程：如,HPLC,实例：生物碱,液相色谱法排阻色谱法,实例：,水飞蓟黄酮的提取,水飞蓟：也叫乳蓟，菊科植物，一年或两年生草本,功效：抗肝脏中毒和保护肝细胞,有效成分：,水飞蓟素,提取工艺：,水飞蓟种子 去油种子饼 去油种子渣 过滤,提取液 浓缩 总黄酮油液 总黄酮 溶解,上柱 洗脱 浓缩干燥 水飞蓟素,机械榨油,粉碎,提取,4,次,每次,4h,分离植物油,丙酮,硅胶柱,四,.,制备色谱技术的发展,关键：色谱过程放大和操作最优化,柱色谱：分辩率高、结合容量大、成本低、放大快速简便,现有色谱分离工艺,70,连续性色谱技术：移动床色谱、环形色谱、错流梯度色谱,模拟流动床,SMB,：,特点：设备结构小、放大快速简便、产率高和生产能力大,指纹图谱技术,一,.,概述,1.,中药指纹图谱：,运用光谱、色谱、,X-,射线衍射或各种技术的联用等现代分析技术，对中药化学信息通过色谱图（液相色谱图、气相色谱图或薄层色谱图等）方式进行表征，并通过计算、分析、比较、评价等过程，以技术参数、指纹特征等加以说明。,制备分析比较评价校验,分析图谱：准确的辨认,精密的测量,比较图谱：相似,相同,评价结果：模糊属性,求索细枝末节,分析比较的结果：对差异性或一致性作出评价,2.,中药指纹图谱的分类：,狭义：,中药化学（成分）指纹图谱,广义：,中药材（原料药材）指纹图谱,应用对象 中药原料药（包括饮片、配伍颗粒）指纹图谱,中药制剂指纹图谱,中药化学（成分）指纹图谱 最主要、常用 中药,HPLC,指纹,测定手段,中药生物指纹图谱,3.,中药指纹图谱研究的目的及意义：,目的：,（,1,）,对中药质量控制的补充和提高,（,2,）控制中间体、成品的一致性，减少批间差异,意义：,中药现代化 表征中药有效物质的整体性和复杂性,推动中药新药研究开发和传统产品的二次开发,4.,中药指纹图谱建立的原则：,系统化学成分研究和相同的药理学研究为依托,系统性：,应包括中药有效部位所含大部分成分的种类，或指标成分的全部,如：中药人参 皂苷类成分,银杏叶 黄酮类和银杏内酯类,特征性：,化学成分信息具有高度选择性，区分中药的真伪和优劣，成为“化学条码”,如：五味子 已知木脂素 未知木脂素 成分之间的顺序、比值,重现性：,在规定的方法和条件下，不同操作者和不同实验室应能做出指纹图谱,二,.,中药指纹图谱的建立,1.,指纹图谱测定方法的选定,色谱法：,TLC,、,HPLC,、,GC,、,CE,光谱法：,UV,、,IR,、,NIR,其他方法：,X,射线衍射法、,NMR,及联用技术等,HPLC,法最常用，具有如下特点：,分离效能高,选择性高,检测灵敏度高,分析速度快,应用范围广,HPLC,指纹图谱测定方法的选定,研究对象的确定及预处理,文献调研，确定分析检测目标,例如：,黄芪,含黄酮、皂苷及多糖三类有效成分,黄芪多糖注射液,多糖,原药材,黄酮、皂苷及多糖,复方：,君臣,佐使,供试品的制备,例如：,黄芪,黄酮 碱水萃取,皂苷 大孔树脂吸附,除杂，避免干扰或对色谱柱的损耗,色谱条件选择,最重要、关键性,流动相：对样品有一定溶解度、适用于使用的监测器、化学惰性好、低黏度、低沸点,纯度高、安全、毒性低、环境友好,改性剂、助溶剂（异丙醇、四氢呋喃、氯仿）、梯度洗脱,检测波长、柱温、色谱柱、进样量、检测器,黄酮类、酚酸类,乙腈水酸系统,皂苷类,乙腈水系统,生物碱类,乙腈三乙胺系统,2.,色谱条件的优化及规范化,(1),样品中所有组分能被检出或检出组分数目尽可能多,(2),各组分达到满意的分离度,(3),分析时间短,优化：流动相组成、浓度、值、添加剂,规范化：色谱柱、试剂、仪器操作参数固定，可重现,3.,指纹图谱的信息化和知识化,指纹图谱信息化,指纹图谱知识化,4.,指纹图谱的建立与辨认,三,.,中药指纹图谱的应用,1.,丹参药材指纹图谱研究,有效成分：,水溶性,丹参素,、,原儿茶醛,、原儿茶酸、丹参素丙、丹参酸乙、丹酚酸,A,、丹酚酸,B,、迷迭香酸、丹参酸,A,、,3,4-,二羟基桂皮酸、,-,谷甾醇,-,葡萄糖苷、异阿魏酸、原紫草素、紫草酸,脂溶性成分,丹参酮类（,丹参酮,A,）,(1),供试品的制备 水提取酸化乙酸乙酯萃取检测,方法简便、重现性好,(2),参照物的制备 主成分：原儿茶醛作参照物,检测方法,流动相的选择 甲醇,-0.1%,冰乙酸（,5:95,）,检测波长,254 nm,稳定性及精密度试验 相对标准偏差,3.0%,重现性试验 相对标准偏差,3.0%,(4),丹参原药材,HPLC,指纹图谱检测标准,色谱条件与系统适用性试验：,填充剂,ODS,流动相 甲醇,-0.1%(5:95),检测波长,254 nm,柱温 室温,流速,1.0 mL/min,参照物溶液的制备,精密称取对照品,2.0 mg,，,5mL,定容,供试品溶液的制备,药材粉碎过筛加热回流滤液酸化乙酸乙酯萃取残渣甲醇溶解,测定法,进样量,10L,记录,1h,danshensu,protocatechuic acid,protocatechuic aldehydrate,caffeic acid,rosmarinic acid,lithospermic acid,salvianolic acid B,salvianolic acid A,salvianolic acid C.,相对保留时间,/min,0.15,0.368,0.437,0.495,0.591,1.000(S),特征指纹峰积分相对比值,0.152,30%,0.72,0.191,30%,0.297,25%,0.046,1.000(S),相对保留时间,/min,1.143,1.393,1.627,2.585,2.911,3.968,特征指纹峰积分相对比值,0.059,0.038,0.139,0.354,25%,0.411,25%,0.054,丹参原药材,HPLC,指纹图谱数据,三,.,中药指纹图谱的应用,2.,冬虫夏草原药材指纹图谱研究,有效成分：,核苷类,、甾醇类及多糖,