基因工程原理-第5章重组基因导入受体细胞.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,DNA重组（限制性内切酶）,运输工具基因克隆载体,目的基因的制备,目的基因导入受体细胞,外源基因的表达,基因工程的应用,第五章 重组基因导入受体细胞,第一节 受体细胞,受体细胞,（receptor cell），又称宿主细胞或寄主细胞，是能够摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。受体细胞的选择应符合以下原则：,便于重组DNA分子的导入,能使重组DNA分子稳定存在于细胞中,便于重组体的筛选,遗传稳定性高,安全性高,内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低,遗传密码无明显偏倚性,具有较好的转移后加工机制,1.原核受体细胞,较为理想的受体细胞：,大部分没有细胞壁，便于外源,DNA,进入,没有核膜，染色体,DNA,没有固定结合的蛋白质,基因组简单，不含线粒体、质体,多为单细胞，容易获得一致性材料，易于扩大培养或发酵生长,常用细菌：大肠杆菌。,大肠杆菌。,特点：G,-,单个细胞，0.5,m*(13)m，周身鞭毛、能运动、无芽孢。,例：胰岛素、生长素、干扰素、RE,优点：完善成熟的受体系统。,缺点：毒素等，折叠加工问题,酵母菌表达系统的优势：,结构最为简单的真核生物之一，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简单,培养简单,遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长,安全性高，无致病性，不会对外界环境造成污染,具有较好的转译后加工机制，便于真核生物表达,2.酵母受体细胞,第二节 重组基因导入受体细胞,一、重组基因导入原核受体细胞,接受DNA片段,转化（,transformation）重组质粒DNA分子进入受体细胞，并在受体细胞稳定维持和表达的过程，转化后的受体菌，称转化子。,（一）转化,1928年英国学者F,Griffth在肺炎双球菌中发现的，证明了遗传的物质基础是DNA。,转化率,转化子,DNA分子数,转化子,细胞数,Ca,2+,诱导大肠杆菌转化法,对数生长后期的菌体,5x10,7,个/毫升,冰浴10分钟,含CaCl,2,缓冲液,15分钟,含CaCl,2,缓冲液,（1）感受态的制备,（2）DNA分子转化感受态细胞,（3）筛选转化子。,Ca,2+,：,低温下使磷质层形成液晶结构，使膜间核酸酶分离,与,DNA,结合，抗,DNase,（二）转导,是指通过,噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞将外源,DNA,分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程。,D突变,E突变,溶源菌培养,诱导溶菌生长,45,15min,39,2-3h,收集包装物,噬菌体,DNA,噬菌体颗粒转导,包装,（三）转染,是采用与质粒DNA转化受体细胞相似的方法，将重组,噬菌体,DNA,分子直接导入受体细胞中的过程。,（四）电激穿孔,是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。,1988年，Dower WJ等,参数：,电场强度,电脉冲时间,外源DNA浓度,当50%70%菌体细胞死亡时，转化率最高,（五）三亲本杂交（triparental mating）,三亲本杂交结合转化法是基于非接合型质粒的迁移作用而建立的一种DNA转化方法。,二、重组基因导入植物受体细胞,（一）土壤农杆菌介导的Ti质粒转化,外植体：,植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织的片段。在继代培养时，将培养的组织切段移入新的培养基时，这种切段也称外植体。,将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。,（Vir 区）,（Con区）,长度25kb，占Ti质粒1/10,主要功能是转移DNA，随机插入植物染色体中。,天然的质粒克隆载体。,含有2类基因：,（1）编码冠瘿碱合成酶（,ocs、nos,）及分解代谢的基因。,（2）诱发肿瘤基因（,Onc,）,Vir区：激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性。占Ti质粒1/3。,Con区调控Ti质粒在农杆菌之间的转移，含有与细菌间接合转移的有关基因tra。,Ori区,复制起始区。,限制性酶,切开,外源基因,Ti质粒载体,（1）叶盘法转化植物细胞,（2）整体植株接种转化法,人为地在整体植株上造成创伤部位，然后把农杆菌接种在创伤表面，使农杆菌按照天然的感染过程在植株体内进行侵染。获得转化的植物愈伤组织或转基因植株。,（3）原生质体共培养转化法,原生质体共培养转化法是以原生质体作为受体细胞，通过将根癌农杆菌与原生质体作短暂的共培养，然后洗涤除去残留的根癌农杆菌后，置于含抗生素的选择培养基上筛选出转化细胞，进而再生成植株。,（4）悬浮细胞共培养转化法,与,原生质体共培养转化法相似,（二）植物病毒介导基因转移,植物病毒,DNA病毒20%,RNA病毒80%,花椰菜花叶病毒：双链,DNA,病毒,（三）化学诱导DNA直接转化,（1）多聚物介导法,聚乙二醇,多聚赖氨酸,多聚鸟苷酸,（2）脂质体介导基因转化,脂质体,（四）物理方法介导DNA直接转化,（1）基因枪转化,（2）超声波介导转化,（3）激光微束穿孔转化,（4）显微注射,三、重组基因导入动物受体细胞,（一）转染法,（二）脂质体介导转化,（三）动物病毒介导转导法,第三节 重组子筛选,只有少数受体细胞能被导入重组DNA分子,例：大肠杆菌,10,8,个大肠杆菌，转化效率10,-6,只有100个细胞被转化,克隆子的筛选,：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选（Screening）或选择(Selection)。,转化子,：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞。,重组子,：含有重组DNA分子的转化子。如果重组子含有外源目的基因，又称为阳性克隆子或期望重组子。,一、遗传表型直接筛选,（一）利用载体选择性标记筛选转化子,抗药性标,插入失活筛选,插入表达筛选,互补法（蓝白斑筛选法）,（二）利用报告基因筛选植物转化细胞,（三）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞,（四）营养缺陷型检测法,（五）形成噬菌斑筛选法,二、依赖于重组子结构特征分析筛选,三、核酸杂交分析,（一）分子探针：放射性探针、非放射性探针、标记探针的方法,（二）核酸探针杂交分析,四、免疫化学分析检测,（一）抗体检测法,（二）免疫沉淀测定法（,Immunoprecipitation,IP）,（三）转译筛选法,五、PCR筛选法,一、遗传表型直接筛选,（一）利用载体选择性标记筛选转化子,1.抗药性标记,氨苄青霉素,氯霉素,卡那霉素,四环素,链霉素,2.插入失活筛选,3.插入表达筛选,载体的选择性标记基因前链接一段附调控序列，插入式祸福调控序列后，其下游的筛选标记基因才能表达,。,IPTG,：,异丙基,-D-,硫代半乳糖苷,4.,互补法（蓝白斑筛选法）,乳糖操纵子,：,IPTG,-互补：,是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。,IPTG：,异丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷,显色剂,：X-gal，5-溴-4-氯-3-吲哚-,-D-半乳糖苷，,在,-,半乳糖苷酶的催化下会产生,蓝色产物,。,（二）利用报告基因筛选植物转化细胞,（1）新霉素磷酸转移酶（NPT）基因,（2）潮霉素磷酸转移酶（HPT）基因,（3）氯霉素乙酰基转移酶（CAT）基因,（4）葡萄糖苷酶（GUS）基因,（5）荧光素酶（LUC）基因,（6）抗除草剂bar基因：抗草丁膦,（7）冠瘿碱合成酶基因,报告基因,(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。,荧光素酶（LUC）基因,转入了萤火虫的荧光素酶基因能发光的烟草,(1)萤光素+ATP 萤光素化腺苷酸（luciferyl adenylate）+PPi,(2)萤光素化腺苷酸+O,2,氧萤光素,+AMP+光,机理：,GFP：绿色荧光蛋白,日本科学家下村修（伍兹霍尔海洋生物学研究所）,美国科学家马丁,查尔菲（哥伦比亚大学）,钱永健（加利福尼亚大学圣迭戈分校）,2008年诺贝尔化学奖：,GFP标记的微管,将绿黄红荧光蛋白质植入鱼的DNA分子结构中,稳定表达表达GFP的CHO细胞,GFP转基因小鼠,（三）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞,（1）胸苷激酶（TK）基因：,（2）二氢叶酸还原酶（DHFR）基因,（3）黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（XGPRT）基因：,胸苷（T）转换成TMP的基因,催化二氢叶酸还原成四氢叶酸,催化GMP生成,（四）营养缺陷型检测法,（五）形成噬菌斑筛选法,二、依赖于重组子结构特征分析筛选,（一）快速裂解菌落鉴定分子大小：琼脂糖电泳，分析DNA分子大小,（二）限制性核酸内切酶酶解分析：DNA酶切图谱,（三）核酸杂交分析,三、核酸杂交分析,基本原理,：具有一定互补的两条核酸(DNA或RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下，可按碱基互补配对原则高度特异地复性形成双链。,核酸杂交,：两种不同来源单链DNA或RNA相互配对的过程。,分子杂交,：生物大分子之间通过相互作用结合在一起：,核酸之间,通过碱基互补配对；,蛋白质之间,通过抗原、抗体反应；,核酸、蛋白质之间,通过疏水作用，氢键进行相互作用。,1968年华盛顿卡内基学院 Roy Britten等,常见的分子杂交：,Southern blotting：DNA，DNA/RNA Northern blotting：RNA，DNA/RNADot/slot blotting（斑点/狭缝杂交）,in situ hybridization：组织原位杂交,Western blotting：蛋白质/抗原、抗体,待测分子,探针,（一）分子探针(M,olecular probe),：是指具有同特异性目标分子产生很强的相互作用并可对其相互作用的产物进行有效检测的,DNA分子,、,RNA分子,和,蛋白质,。,1.放射性探针：,32,P、,3,H、,35,S、,14,C、,125,I,2.非放射性探针,（1）,生物素（biotin）标记探针,：,生物素与,dUTP,中尿嘧啶的,5,位,C,相连，在聚合酶作用参入,DNA,dUTP,Biotin,(,维生素H，VH,),连接臂,（,藻红素,）,（链霉亲和素）,（,生物素,）,（2）,地高辛标记探针,：,地高辛与,UTP,中尿嘧啶的,C5,相连,dUTP,连接臂,地高辛,地高辛：异羟基洋地黄毒苷，强心素，拉诺辛，Cardiox，Cardoxin，Cedoxin,（3）,荧光素标记探针,：,用荧光素标记核酸、抗生物素蛋白或抗地高辛抗体。,荧光物质异硫氰酸荧光素（黄绿色）,罗丹明（红色）,羟基香豆素（兰色）,3.标记探针的方法,（1）切口平移标记法,（2）随机引物标记法,（3）末端标记法,（4）PCR标记法,（5）光敏标记法：,光敏基团,（6）化学衍生结合标记法：,（7）交叉相连标记法：,对重组体克隆进行筛选和鉴定的方法之一是利用核酸杂交法进行筛选，它包括,Southern,印记杂交法、,Northern,印记杂交、斑点印记杂交和（,菌落原位杂交,）杂交。,各种杂交中需要对探针进行标记，其中对探针进行非放射性标记的常见标记物有（,荧光素,）、（,生物素,）、（,地高辛,）。,标记探针的方法（,切口平移标记法,）、（,随机引物标记法,）、（,末端标记法,）、（,PCR,标记法,）、（,光敏标记法,）、化学衍生结合标记法以及交叉相连标记法。,在利用,lacZ,失活的显色反应筛选法中，,IPTG,的作用是,(,a,),(a),诱导宿主的,肽的合成,(b),诱导宿主的,肽的合成,(c),作为酶的作用底物,(d),作为显色反应的指示剂,-,互补筛选属于下列哪种筛选方法：,(,B,),A.,抗药性标志选择,B.,标志补救,C.,原位杂交法,D.,酶联免疫吸附,E.,分子杂交,应用,-,互补筛选重组体时，含有外源基因的重组体菌落颜色应为：,(,C,),A.,紫色,B.,蓝色,C.,白色（阻遏蛋白不能表达）,D.,无色,E.,以上都不是,水母发光蛋白由,236,个氨基酸构成，其中,Asp,、,Gly,、,Ser,构成发光环，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记，在转基因技术中，这种蛋白质的作用是（筛选标记）,(,C,),A.,促使目的基因导入宿主细胞中,B.,促使目的基因在宿主细胞中复制,C.,使目的基因容易被检测出来,D.,使目的基因容易成功表达,建立了一个基因文库后，如何鉴定一个携带目的基因的克隆,?,（二）核酸探针杂交分析,基本原理,：具有一定同源性的两条核酸（DNA或RNA）单链在适宜的温度及离子强度等条件下，可按碱基互补配对原则高度特异地退火形成双链。,探针,：用于检测的核苷酸片段。,Southern blotting：DNA/DNA,RNA Northern blotting：RNA/DNA,RNADot blotting：DNA芯片,in situ hybridization：组织原位杂交,Western blotting：蛋白质/抗原、抗体,（1）Southern印迹杂交,1975年由英国人southern创建,待测的核酸序列：DNA,探针：DNA或RNA,电转移方法：,湿式电转移,半干式电转移,（2）Nouthern印迹杂交,（,1979年，J.C.Alwine等,）,待测的核酸序列：RNA,探针：DNA或RNA,（3）斑点印迹杂交和狭线印迹杂交,待测的核酸序列：DNA和RNA,探针：DNA或RNA,（4）菌落（噬菌斑）原位杂交,Grunstein和Hosness，1975年,（5）荧光原位杂交,(,fluorescence in situ hybridization,FISH）,用特定荧光素如生物素、地高辛等标记探针，与靶DNA进行杂交，通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物，在荧光显微镜下观察探针标记或位点的技术。,实验流程：,FISH样本的制备探针的制备探针标记杂交（染色体显带）荧光显微镜检测结果分析。,组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交。是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交，因此原位杂交可以确定探针互补序列在胞内的空间位置。,（6）组织细胞的原位杂交,（7）影响探针杂交的因素,探针分子与目标分子之间序列的同一性,探针的长度：,500b,探针浓度,杂交加速剂,：硫酸葡聚糖,杂交漂洗液的组成、反应温度、盐浓度,四、免疫化学分析检测,待测物：蛋白质,探针：抗原、抗体,抗体测定法,免疫沉淀法,分类,（一）抗体检测法,放射性抗体测定法,非放射性抗体测定法,分类,1.放射性抗体测定,Broome和Gilbert,1978年,2.非放射性抗体测定,（二）免疫沉淀测定法（,Immunoprecipitation,IP,）,是一种研究蛋白质间交互作用的生物技术，这种技术是将蛋白质视为抗原，并利用抗体与之进行特异性结合的特性，来进行研究。这项技术可用来将含有上千种不同蛋白质的样品中，分离和浓缩出特定蛋白质。,（三）转译筛选法,杂交抑制转译检测法,杂交选择转译检测法,无细胞翻译系统,：没有完整细胞的体外蛋白质翻译合成系统。通常利用无细胞提取物提供所需要的核糖体、tRNA、酶类、氨基酸、能量供应系统及无机离子等，在试管中以外加的 mRNA指导蛋白质的合成。常用的无细胞提取物有兔网织红细胞裂解物和麦胚抽提物等。,无细胞翻译系统的作用：,含重组子mRNA,目的基因cDNA,目的蛋白,杂交抑制转译检测法：,杂交选择转译检测法,把含目的基因DNA固定在硝酸纤维素膜上,五、PCR筛选法,根据载体选择标记初步筛选转化子的方法有,6,种，包括（,抗药性筛选,）筛选；插入表达筛选；（,插入失活筛选法,）筛选；（,显色互补筛选法,）筛选；利用报告基因筛选植物转化细胞；利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞。,关于报告基因，下列哪些叙述是正确的？,(,acd,),(a),以其易于分析的编码序列代替感兴趣基因的编码序列,(b),以其易于分析的启动子区代替感兴趣基因的启动子区,(c),能用于检测启动子的活性,(d),能用于确定启动子何时何处有活性,下列哪一个不是,Southern,印迹法的步骤,?(,b,),(a),用限制酶消化,DNA (,b)DNA,与载体的连接,(c),用凝胶电泳分离,DNA,片段,(,d)DNA,片段转移至硝酸纤维素膜上,(e),用一个标记的探针与膜杂交,切口移位是指在,(),作用下，使,(),带上放射性标记。,(,b,),(,a)DNA,聚合酶,I,，,RNA (,b)DNA,聚合酶,I,，,DNA,(,c)DNA,聚合酶,，,RNA (,d)DNA,聚合酶,，,DNA,与重组体的筛选无关的是,(,c,),A.,抗药性标志选择,B.,分子杂交法,C.,酶免检测分析,D.,免疫化学法,E.,克隆载体的改建,直接针对目的,DNA,进行筛选的方法是：,(,C,),A.,氨苄青霉素抗药性,B.,青霉素抗药性,C.,分子杂交,D.,分子筛,E.,电泳,下列技术中用来鉴定,DNA,的技术是：,(,B,),A.Northern,印记（这个是,RNA,印记）,B.Southern,印记,C.Western,印记（免疫常用，检测蛋白质）,D.,亲和层析,E.,免疫化学方法,