多聚酶链式反应扩增DNA片段优质课市公开课一等奖省赛课微课金奖课件.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,多聚酶链式反应,(,PCR技术),，,是一个在体外快速扩增特定基因或DNA序列方法，故又称为,DNA体外扩增技术,。,课题,2,多聚酶链式反应扩增,DNA,片段,1/25,1,、,DNA,分子组成成份和结构,DNA,分子基本组成单位是,.,共有,种,每个基本单位是由一分子,、一分子,、和一分子,组成。,脱氧核甘酸,4,磷酸,碱基,脱氧核糖,？,那么,DNA,分子平面结构怎样呢？,二、基础知识,2/25,脱氧,核糖,含氮碱基,磷酸,A,G,C,T,1、,DNA,基本单位,脱氧核苷酸,1,2,3,4,5,O,3/25,O,O,P,O,HO,碱基,O,OH,O,O,P,O,HO,OH,碱基,5,3,3,5,碱基,脱氧核糖,磷酸基团,碱基,脱氧核糖,碱基,脱氧核糖,5,3,多脱氧核苷酸链结构简图,4/25,一个核苷酸上,磷酸基团上“,OH”,和,另一个核苷酸分子第三位碳原子上羟基,之间失去一分子水，形成,磷酸二脂键，,即在,相邻,两个脱氧核苷酸,3,和,5,碳原子,之间形成磷酸二脂键。数量庞大四种脱氧核苷酸经过,3,、,5,、磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。,通常将,DNA,羟基“,OH”,末端称为,3,端，而磷酸基团末端称为,5,端,4,、多脱氧核苷酸链得形成,5/25,2,、,DNA,分子平面结构,A,T,G,C,A,G,C,T,氢键,5端,3端,5端,3端,识别,：,DNA,分子,3,端与,5,端,-OH,端为,3,;,磷酸基团末端为,5,。,6/25,2,、,DNA,分子复制过程,参加组分,在DNA复制中作用,解旋酶,打开,DNA,双链,DNA,母链,提供DNA复制模板,4,种脱氧核苷酸,合成子链原料,DNA,聚合酶,催化合成,DNA,子链,引物,使DNA聚合酶能够从引物,3 端开始连接脱氧核苷酸,7/25,解旋酶,DNA,母链,4,种脱氧核苷酸,DNA,聚合酶,引物,（,RNA,）,打开,DNA,双链,模板,合成子链原料,催化子链合成,使,DNA,聚合酶能从引物,3,端开始连接脱氧核苷酸,思索：,体内,DNA,复制条件,是什么？体外扩增,DNA,怎样提供相同环境？,变性,（,80-100,）,Taq,聚合酶（耐高温）,20,30,个核苷酸组成,DNA,或,RNA,8/25,DNA,双链,单链,变性（加热,80-100,）,复性（迟缓冷却）,4,、,DNA,分子热变性原理：,变性目标：,复性目标：,解开双链,有利于引物,和引物,与两条单链结合,9/25,一、,PCR,原理,（,PCR,技术原理）,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（）,适温延伸,高温变性,低温复性,重复,13,步,30,轮,3、DNA复制方向,DNA合成方向总是从子链,5端向3端,延伸,2、步骤：,变性 复性延伸,10/25,PCR,技术原理总结,利用DNA分子,热变性原理,，经过控制,温度,来控制双链,解旋与结合,，从而完成体外DAN分子,扩增,。,体外DNA复制条件：,四种脱氧,核苷酸,、耐高温DNA,聚合酶,、,引物,、,模板,；,缓冲溶液,、严格控制温度,温控设备,。,复制方向：,子链5端向 3端延伸。,11/25,二、,PCR,反应过程,5,/,3,/,3,/,5,/,5,/,3,/,引物,5,/,3,/,引物,变性95,o,C,复性,55,o,C,延伸,72,o,C,5,/,3,/,3,/,5,/,12/25,5,引物,1,5,引物,2,第二次复制,第一次复制,5,5,5,5,5,5,模板,DNA,5,5,5,5,5,5,5,5,25,30,次循环（复制）后，模板,DNA,含量能够扩大,100,万（,2,20,）倍以上。,13/25,每个循环包含：,变性,复性,延伸,从第二轮循环开始，上一次循环产物也能够作为模板参加反应，而且由引物,延伸而成,DNA,单链会与引物,结合，进行,DNA,延伸，这么，,DNA,聚合酶只能特异性地复制,处于两个引物之间,DNA,序列,，,使这段固定长度序列,呈指数扩增。,PCR,反应过程总结,14/25,三、,PCR,反应试验操作,1,、,PCR,仪,设备及用具,2,、微量离心管,一个,薄壁塑料管,，总容积为,0.5ml,3,、微量移液器,用于,定量转移,PCR,配方中,液体,，,其上一次性吸液枪头用一次更换一次,实质上一台能够,自动调控温度,仪器,15/25,三、,PCR,反应试验操作,（,1,）按配方将所需试剂摆放在试验桌上（,准备,）,（,2,）用,微量移液器,按配方在微量,离心管,中依次加入各组分（,移液,）,（,3,）盖严,离心管,口盖子，用手指轻轻弹击管壁（,混合,）,（,4,）将微量离心管放在,离心机,上（,离心,）,（,5,）将离心管放入,PCR,仪,上，设置好,PCR,仪循环程序（,反应,）,循环数,变性,复性,延伸,第一次,94C,10min,30,次,4,，,30s,55,，,30s,72,，,1min,最终一次,4,，,1min,55,，,30s,72,，,1min,16/25,四、结果分析与评价,DNA,含量测定：,稀释,对照调零,测定计算（公式见,P63,）,波长,260nm,处读数,蒸馏水做对照,50,倍,17/25,（一）理论上,DNA,扩增数目标计算,四、,课题结果评价,1,、,一条,DNA,，复制,n,次，,DNA,为,2,n,2,、,a,条,DNA,，复制,n,次，,DNA,为,a x2,n,（二）试验中,DNA,含量测定,1,、,原理,能够经过测量,DNA,含量来评价扩增效果，,DNA,在,260nm,紫外线波段有一强烈吸收峰，峰值大小与,DNA,含量相关,18/25,2,、,过程,稀释,2,L,PCR,反应液，加入,98,L,蒸馏水，即将样品进行,50,倍稀释,对照调零,以蒸馏水作为空白对照，在波长,260nm,处，将紫外分光光度计读数调整至零,取,DNA,稀释液,100,L,至比色杯中，测定,260nm,处光吸收值,测定,并,计算,DNA,含量（,g,/mL,）,50,(260nm,读数,),稀释倍数,19/25,50,：,在厚度为,1cm,比色杯中吸光值为,1,DNA,含量为,50,g,/ml,20/25,体内,DNA,复制与,PCR,技术区分：,体内复制,PCR,技术,解旋,在解旋酶作用下，细胞提供,ATP,，部分解开,加热到,94,o,C,双链全部解开，不需解旋酶,引物,一小段,RNA,普通用DNA片段,DNA,聚合酶,细胞本身DNA聚合酶（不耐高温）,TaqDNA,聚合酶,复制特点,半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。,半保留复制，完全解旋后复制，从模板链一端开始复制。,复制方向,子链5端向 3端延伸,子链5端向 3端延伸,21/25,课堂小结,多聚酶链式反应扩增,DNA,片段,PCR,原理,DNA,复制需要酶、原料、能量、引物,DNA,变性和复性受温度影响,PCR,过程,变性,复性,延伸,操作步骤,配制,PCR,反应体系,移入离心管,放入,PCR,仪,设置工作参数,DNA,扩增,测定含量,稀释,调零,测定并读数,计算,22/25,练习巩固,1,、关于,PCR,技术应用，错误一项是,A,古生物学、刑侦破案、,DNA,序列测定,B,诊疗遗传疾病、基因克隆、古生物学,C DNA,序列测定、基因克隆、刑侦破案,D,诊疗遗传疾病、合成核苷酸、,DNA,序列测定,23/25,2,、,DNA,合成方向总是从子链哪一端向哪一端延伸？,3,、,PCR,技术最突出优点是,A,原理简单,B,原料易找,C TaqDNA,聚合酶有耐热性,D,快速、高效、灵活、易于操作,从子链5端向3端延伸,24/25,4,、做,PCR,使用微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行关键步骤是,A,重复洗涤,B,不怕外源,DNA,污染,C,高压灭菌,D,在,20,储存,25/25,