分子生物学实验原理与常见问题解答.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,RNA提取原理与注意事项,PCR原理与常见问题,Real-time PCR介绍,内容,商品化提取试剂盒原理：,异硫氰酸胍（GIT）-酚法,GIT与 十二烷基肌氨酸钠（Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放RNA；GIT与巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；,一定条件下,（各家试剂条件不同），RNA不溶于乙醇，而DNA和蛋白质溶于乙醇溶液，通过滤柱时，RNA挂柱，DNA和蛋白质溶于滤液；在逐步洗脱的过程中，RNA不断被纯化；最后用水洗脱。,杜绝外源酶的污染：,严格戴好帽子，口罩，手套。,实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。,实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。,RNA提取的注意事项,（外界环境中多含Rnase，且RNA极不稳定）,RNase free,DNase free,PCR技术的基本原理,模板,DNA,的变性：,93,-,95,左右，,模板,DNA,与引物的退火,(,复性,),：,Ta=Tm-35,引物的延伸：,Taq,DNA,聚合酶之,5-3DNA,聚合酶活性,变性,-,退火,-,延伸三个步骤,引物的复性温度,通过以下公式帮助选择合适的温度：,Tm值（解链温度）=4（G+C）2（A+T）,复性温度=Tm值-（510）,在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性,复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（min）,温度,（）,PCR的基本原理,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复13步,2530轮,目的DNA片段,扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链,与引物复性,DNA变性,形成2条单链,子链延伸,DNA加倍,模板DNA,95,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,50,引物1,引物2,DNA引物,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,引物1,引物2,DNA引物,72,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,72,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,95,50,72,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,72,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,重复30轮后,2,30,=1,073,741,824,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,理想拷贝数=2,n,n 循环次数,实际拷贝数=(1+x),n,X 平均效率,约为0.85,n 循环次数,标准的PCR反应体系（100ul体系）,10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 10100pmol 模板 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg,2+,1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul,PCR反应五要素,模板（template）,引物（primer）,酶（Taq DNA polymerase）,dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）,Mg,2+,（magnesium）,（1）模板,单、双链DNA均可。,不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。,一般100ng DNA模板/100,L。,模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,（2）引物浓度,0.1-0.5 mol/L,浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。,（3）Taq,DNA聚合酶,0.5-2.5 U/50,l,酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,（4）dNTP,dNTP浓度取决于扩增片段的长度,四种dNTP浓度应相等,浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量,dNTP可与Mg,2+,结合，使游离的Mg,2+,浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。,（5）Mg,2+,Mg,2+,是DNA聚合酶的激活剂。,0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。,Mg,2+,浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg,2+,过高影响反应特异性。,Mg,2+,可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg,2+,浓度。,EB染色原理：,EB插入DNA碱基对之间的结合,PCR常见问题,无扩增产物,非特异性扩增,拖尾,假阳性,无,扩增产物,现象,：阳对照有条带，而样品则无,M,样品A,样品B,阳性对照,纯度：含有抑制物,浓度：含量低,质量：,RNA,被降解,操作：体系配制有误，模板加入有误,原因,纯化模板或者使用优质试剂盒提取模板,RNA,加大模板的用量,重新提取,RNA,，并做好无,Rnase,前处理,重新配置扩增体系，重新,PCR,对策,非特异性扩增,现象：,PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。,引物特异性差,模板或引物浓度过高,酶量过多,Mg,2+,浓度偏高,退火温度偏低,循环次数过多,原因,重新设计引物或者使用巢式,PCR,适当降低模板或引物浓度,适当减少酶量,降低镁离子浓度,适当提高退火温度或使用二阶段温度法,减少循环次数,对策,现象：,产物在凝胶上呈,Smear,状态,。,M 1 2,模板不纯,Buffer,不合适,退火温度偏低,酶量过多,dNTP,、,Mg,2+,浓度偏高,循环次数过多,原因,纯化模板,更换,Buffer,适当提高退火温度,适量用酶,适当降低,dNTP,和,镁离子,的浓度,减少循环次数,对策,靶序列或扩增产物,的交叉污染,原因,开管轻柔，防止形成气溶胶；防止靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外,更换试剂、耗材,试剂分装，贮存适当。,更换实验室和所有试剂耗材。,假阳性,现象：,空白对照出现目的扩增产物,对策,PCR中应注意的事项,（一）防止污染,试剂小量分装,吸头及EP管一次性使用,器皿及工作区域要分开，无菌操作,（二）设立对照,：,阳性对照：阳性模板,阴性对照：阴性模板,试剂对照：除模板外的所有组分,Real-time PCR技术介绍,实时荧光定量PCR定义,在PCR反应体系中加入,荧光基团,，利用荧光信号累积,实时监测,整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,实时荧光定量PCR 原理 实时原理,常 规 PCR技术：,对PCR扩增反应的,终点产物,进行定量和定性分析,无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测,实时定量PCR技术：,利用,荧光信号的变化实时检测,PCR扩增反应中,每一个循环扩增产物量的变化,，通过Ct值,和标准曲线的分析对,起始模板,进行,定量分析,实时荧光定量PCR原理 定量原理,介绍三个概念：,扩增曲线、荧光阈值、Ct值,如何对起始模板定量？,通过Ct值和标准曲线对,起始模板,进行定量分析,实时荧光定量PCR 原理-扩增曲线,扩增曲线图：,横坐标：扩增循环数（Cycle）；,纵坐标：荧光强度,每个循环进行一次荧光信号的收集,荧光基团,荧光检测元件,实时荧光定量PCR 原理 -荧光,阈,值,荧光信号,阈,值（threshold）,：,前,15,个循环信号作为荧光本底信号（,baseline,），,即,样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值,荧光域值的缺省设置是,3,15,个循环的荧光信号的标准偏差的,10,倍,手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入,指数,期的最初阶段，并且保证回归系数大于,0.99,真正的信号,:,荧光信号超过域值,实时荧光定量PCR 原理 -Ct值,Ct值的定义,：,PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增,循环次数,C(t)value,实时荧光定量PCR 原理 -Ct值的重现性,横轴：PCR反映循环数,纵轴：荧光信号量,相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图,终点处检测产物量不恒定，误差大；Ct值则极具重现性,起点量是样本中原来的DNA量，更有意义；终点量经过PCR 放大，,并非研究所期望的数据,非特异性荧光标记：,1、SYBR Green,特异性荧光标记：,2、TaqMan,3、Molecular Beacon,实时荧光定量PCR的几种方法介绍,SYBR Green 法,SYBR Green 法,SYBR Green,能,结合到双链,DNA,的小沟部位,SYBR Green,只有和双链,DNA,结合后才发荧光,变性时，,DNA,双链分开，无荧光,复性和延伸时，形成双链,DNA,，,SYBR Green,发荧光，在此阶段采集荧光信号（一般设置在复性阶段）。,SYBR Green,实时荧光定量PCR原理,SYBR Green I 工作原理,5,3,5,3,SG,No Emission,SG,SG,SG,Excitation,SG,SG,SG,SG,SG,SG,SG,5,3,5,3,Emission,Excitation,实时荧光定量PCR原理,SYBR Green I 熔解曲线分析,温度,荧光强度,Tm,Tm值：DNA解链一半时的温度,-TaqMan法,与目标序列互补,TaqMan-,水解型杂交探针,5,端标记有报告基团,(Reporter,R),，如,FAM,、,VIC,等,3,端标记有荧光淬灭基团,(Quencher,Q),探针完整，,R,所发射的荧光能量被,Q,基团吸收，无荧光，,R,与,Q,分开，发荧光,（荧光共振能量转移原理，,FRET,）,Taq,酶有,53,外切核酸酶活性，可水解探针,TaqMan法 工作原理,每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光,Texas Red,ROX,CY3.5,Redmond Red,常用的荧光基团,FAM,TET,VIC,CY5,CY5.5,LC705,LC640,HEX,JOE,CY3,TAMRA,实时荧光定量PCR 方法 3,-Molecular beacon 法(分子信标),标记荧光的发夹探针,环与目标序列互补,茎由互补配对序列组成,环,茎,荧光素 淬灭剂,发夹型杂交探针,Molecular beacon(分子信标)工作原理,荧光共振能量转移（,FRET,）,探针与,DNA,杂交时产生荧光,-,延伸过程：不产生荧光,-,退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号,由于荧光探针的引入，显著提高了实验的特异性。探针设计一般应符合以下条件：,探针长度应在2040个碱基左右，保证结合特异性。,GC碱基含量在40%60%，避免单核苷酸序列的重复。,避免与引物发生杂交或重叠。,探针与模板结合稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5。,另外，探针的浓度、探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。,特 点,FQ-PCR不仅具有普通PCR的,高灵敏性,，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA,杂交的高特异性和光谱技术的高精确性,，克服了常规PCR的许多缺点。FQ-PCR只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要PCR后处理，避免了常规PCR操作中的诸多弊端。,real-time PCR中应注意的事项,（一）保持反应管的清洁,管盖上严禁写字,不能徒手拿取,反应结束后严禁打开,（二）设立对照,：,阳性对照：阳性模板,阴性对照：阴性模板,试剂对照：除模板外的所有组分,