基因工程第6章-DNA重组的操作2-(2).ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2.1,重组质粒DNA转化大肠杆菌,转化（,transformation,）,定义,转化微生物的种类,感受态细胞,P139,转化过程,供体（,donor,）：提供DNA的生物,受体（,recipient or host,）：获得DNA的生物,1.定义,转化,：受体菌,直接吸收,供体菌的DNA片断而获得后者部分遗传性状的现象,。,转化子,（transformant）：,通过转化方式而形成的杂种后代。,2.转化微生物的种类,首次发现转化现象 肺炎链球菌（Griffith,1928）,嗜血杆菌属、芽孢杆菌属、奈瑟氏球菌属、根瘤菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属等。,3.,感受态,（competence）,感受态：指受体细胞最易接受外源DNA片断并能实现转化的一种生理状态。,感受态是细菌的一种遗传特性，而且也受生长阶段、培养条件的影响。,肺炎链球菌 对数生长后期,芽孢杆菌属 指数期末和稳定期,大肠杆菌 刚进入对数期,DH5菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在510,7,个/ml左右,感受态细胞的制备,1、挑取平板上的大肠杆菌单菌落接种于2 mL LB液体培养基中，37振荡培养过夜,2、按1的接种量接种于3 mL新鲜LB培养液，37剧烈振荡培养至,OD,600,为0.4-0.6(可见雾状),3、倒至1.5mL的eppendorf管中,4下12,000 rpm离心1 min，倒出培养液，用无菌滤纸尽量吸干,4、加入1mL 预冷的无菌0.1molL-1 CaCl,2,溶液涡旋，4下12,000 rpm离心30秒,尽量去除上清,5、沉淀以50-100L 预冷的0.1molL-1 CaCl,2,重悬，4保存备用，7d内可用。,对照处理,：,DNA,对照处理：,无菌水代替感受态细胞，检验,DNA,溶液,感受态细胞对照处理：,NTE,缓冲液代替,DNA,溶液，检验感受态细胞,感受态细胞有效性对照处理：,加入已知的容易转化的质粒,DNA,原因：转化处理过程中，可能感染杂菌，,导致假阳性,2、电穿孔转化法（P140）,基本原理,：利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的,瞬间通道,，促进外源DNA的有效吸收。,影响因素,：,电场强度，电脉冲时间，外源DNA浓度,菌体制备,冷却，离心，洗涤（降低离子强度）,10,甘油重悬细胞，,-70,贮存,低温下（,0,4,）,进行电穿孔转化,3、三亲本杂交接合转化大肠杆菌,根据非接合质粒的,迁移作用,而建立，目前常用的载体多是在非接合型质粒或缺少了接合转移基因的接合型质粒的基础上而构建的。,待,转化的受体菌,含有要转化的重组质粒的供体菌,含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌（如：,辅助菌株,E.coli,(pRK2013),）,4、转化率：,DNA分子转化受体菌获得转化子的效率,以,转化子数与用于转化处理的,DNA,分子数或质量的比率表示,以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示,P150,影响转化率的因素：,重组,DNA,分子质量较小，亲和性强，双螺旋闭合结构,受体细胞,受体细胞的选择非常重要,转化手段,电穿孔法,Ca,诱导法,三亲本杂交法,2.2,重组DNA分子转导大肠杆菌,转染：,将重组,DNA分子,直接,导入受体细胞的过程。,转导,：,通过噬菌体,颗粒,感染宿主,细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。,P142,转化:139,2.3 重组DNA分子导入植物细胞,(P144),（1）农杆菌介导的Ti质粒载体转化法,革兰氏阴性菌,作用机制：,将待转移的目的基因组入农杆菌中的,Ti,质粒载体,农杆菌识别敏感植物，将,Ti,质粒的,T-DNA,转移到植物细胞内部,创伤植株感染法,（,植株接种共转化法）,共培养感染法,叶盘转化法,植物愈伤组织共培养转化法,植物悬浮细胞共培养转化法,原生质体共培养转化法,常用方法：,基因枪法,P146,将,DNA,吸附在由钨制作的微型子弹,(,直径约为,1.2um),表面,通过特制的手枪，将子弹高速射入完整的细胞和组织内,转化效率与射击距离、真空度、子弹速度、子弹数目以及,CaCl,2,和亚精胺,(,使子弹吸附在,DNA,上,),的浓度等因素有关,避开原生质体再生植株的难关，单子叶植物基因转移的有效途径。,2.4 重组DNA分子导入哺乳动物细胞,P148,磷酸钙转染法,DEAE,葡聚糖转染法,聚阳离子,DMSO,转染法,脂质体介导法,病毒介导的转染,生化转染,物理转染,病毒颗粒转导法,显微注射法,电穿孔法,6.1 受体细胞,6.2 重组体导入受体细胞,6.3 重组子的筛选与鉴定,第六章 DNA重组的操作,6.3 重组子的筛选与鉴定,（P152）,重组子的筛选（选择）,：,经过各种方法将外源DNA分子导入受体，,获得所需目的重组子的过程,转化子：导入外源,DNA,分子后稳定存在的受体细胞。,重组子：含有重组,DNA,分子的转化子。,筛选与选择,筛选（,screening,）：进一步检测目的重组子,通过某种特定的方法，从受体细胞群体或基因文库中，,鉴定,出目的重组子的过程。,选择,(,selection,),：转化子的初步筛选,通过某种,外加压力,（如：抗生素）的辨别作用，呈现具有重组,DNA,分子的特定克隆子的一种方法。,选择与筛选并无必要严格区分,重组子常见的筛选方法,P152,1 遗传表型直接筛选,抗药性筛选,插入失活筛选法,插入表达筛选法,显色互补筛选法,2 PCR法鉴定,3 酶切法鉴定,4 杂交法鉴定,Southern blot,Northern blot,Western blot 等,5 测序,1、遗传表型直接筛选法,根据,载体选择标记,初步筛选转化子,抗药性筛选,插入失活筛选法,插入表达筛选法,显色互补筛选法,抗药性筛选法,利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行筛选,插入失活筛选法,将外源DNA片断插在,Bam,HI位点,非重组子呈,Ap,r,、,Tc,r,重组子呈,Ap,r,、,Tc,s,插入失活筛选法-过程,先将转化液涂布,Ap,平板,再将,Ap,平板上的转化子影印至含,Ap,和,Tc,平板,在Ap平板上生长，但在Ap和Tc平板上不能生长的转化子即为重组子,插入表达筛选法,pTR262载体,Tc,r,CI,Hind,III,外源基因未插入,Hind,III 位点,CI,基因阻遏蛋白抑制Tc,r,表达,质粒表型 Tc,s,外源基因插入,Hind,III,位点,CI,基因失活,目的重组子表型 Tc,r,显色互补筛选法,IPTGX-Gal,-肽,（LacZ）,插入片段,（LacZ失活）,LacZ酶,MCS,LacZ互补菌株,X-gal+IPTG,蓝白斑,营养缺陷型检测法,根据目的基因在受体细胞中,表达产物,的性质，筛选阳性克隆。,载体分子携带有某种营养组分的基因,，,而宿主细胞不能合成此营养组分,，因此将转化细胞涂布在此营养缺陷型培养基上，能够生长的就是转化子,2、PCR法鉴定,提取质粒,利用特异性引物，扩增目的序列,电泳，观察结果,质粒的提取,小量提取（,碱裂解法,，NaOH/SDS）,0.7%0.8%,琼脂糖凝胶电泳（检测所提取的质粒的纯度和完整性）,凝胶成像系统观察电泳结果,质粒的提取（,碱裂解法,，NaOH/SDS）,取1.5mL培养的克隆菌，12,000rpm离心1 min，加入预冷的100L GET悬浮沉淀，涡漩，室温静置5 min；,加入200L新鲜配制的NaOH/SDS碱裂解液，上下颠倒温和混匀，置冰上5 min；,加入150L乙酸钾溶液中和，上下充分混匀，迅速置冰上5 min；,12,000 rpm离心5 min，吸取400L上清液移入干净的离心管中；,加800L 95（100）乙醇，室温放置3 min；,12,000 rpm离心5 min，用1mL 70乙醇洗涤沉淀2次，真空干燥约5 min；,沉淀用10-15mL TE（含10mgL-1 RNase）溶解。-20保存备用。,分子克隆实验指南（第三版），科学出版社，2002。,PCR鉴定,提取质粒，以之作为模板进行PCR，扩增目的序列,0.61%,琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统观察电泳结果,3、酶切鉴定,提取的质粒为模板，双酶切，37水浴0.51h,1%,琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统观察电泳结果,双酶切鉴定,M:DNA/,Hin,d+,Eco,R,1:,Hind,III和,Sac,I双酶切后的重组克隆载体pMD18-T-RIP,1 M,3530bp,2027bp,831bp,564bp,609bp,凝胶电泳检测,加样孔,DNA Marker,空质粒,重组质粒,重组质粒酶切,重组质粒的PCR扩增片段,4、杂交法鉴定,Southern blot：DNA水平,Northern blot：RNA水平,Western blot：蛋白质水平,5、测序,专业的公司进行测序,拼接（将测序结果拼接出完整的序列）,比对(alignment)，确定目的基因正确与否,一些序列分析软件，eg.DNA star，DNAMAN，DNAClub等,序列比对,www.ncbi.nlm.nih.gov/,BLAST(Basic Local Alignments Search Tool),最为常用的序列相似性比较的工具。,用于确定未知序列与数据库序列的最佳,局部比对,根据序列和数据库中的序列不同类型分为5种,相似性比对结果分析,Bit分值：,分值越高，比对越好,E值：序列比对的统计学显著性指标。,E值越低，则比对就更有可能具有显著性,。统计学上显著性并不一定表示生物学上的相关性。,从比对的结果，可以推测目的序列是否正确。,若序列已知，则只要利用软件将所测的序列拼接，并与已知序列比较，看是否完全相同,作业 4,1、什么是感受态细胞？大肠杆菌感受态细胞如何制备？,2、简述常见的筛选重组子方法？,