12基因工程的基本操作程序(修改).pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1.2,基因工程的基本操作程序,补充：,基因的结构,（,1,）原核生物基因结构,编码区,非编码区,非编码区,编码区上游,编码区下游,编码蛋白质,调控遗传信息的表达,（调控程序）,启动子,终止子,A,ATGTGCACGTAGTTA,.,G,T,.,TACACGTGCATCAAT,.,C,编码区,非编码区,非编码区,启动子,终止子,ATGTGCACGTAGTTA,TACACGTGCATCAAT,RNA,聚合酶,AUGUGCACGUAGUUA,启动子：,位于基因,首端,一段能与,RNA,聚合酶,结合并能起始,mRNA,合成的序列。,没有启动子，基因就不能转录,。,RNA,聚合酶,:,能够识别,启动子上的结合位点,并与其结合的一种蛋白质,.,终止子：,位于基因的,尾端,的一段特殊的,DNA,片断，它能,阻碍,RNA,聚合酶的移动,，并使其从,DNA,模板链上脱离下来，,使转录终止,。,不能转录,为信使,RNA,，,不能,编码,蛋白质的序列。,：,能转录,相应的信使,RNA,，,能,编码,蛋白质的序列。,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,是,调控,遗传信息表达的核,苷酸序列，在该序列中，,最重要的是,位于编码区上,游的,RNA,聚合酶结合位点,。,（也就是启动子）,（2）,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,与,RNA,聚酶,结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子,能转录,为信使,RNA,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,真核细胞的一个基因的编码区转录出,前体,mRNA,，,需把其中的,内含子,切除，,外显子,拼接成,成熟,mRNA,。,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：,能编码蛋白质的序列,内含子：,不能编码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序列，,包括位于编码区上游的,RNA,聚合酶结合位点。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,_,的,编码区是间隔的、,_,的,相同点,都由能够编码蛋白质的,_,和具有调控作用的,_,区组成的,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,真核基因长,1.2,基因工程的基本操作程序,二,.,基因表达载体的构建,三、将目的基因导入受体细胞,四、目的基因的检测与鉴定,一,.,目的基因的获取,基本操作的四个步骤,一、目的基因的获取,1,、目的基因主要是指,_,编码蛋白质的结构基因,2,、获取目的基因的方法,（,1,）从基因文库中获取,（,2,）利用,PCR,技术扩增,（,3,）人工合成,生物抗逆性相关基因、与优良品质相关的基因、与生物,药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与,工业用酶相关的基因等,将含有某种生物不同基因的许多,DNA,片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,基因文库,基因组文库,部分基因文库,（如,:cDNA,文库）,1、,基因文库,（一）从基因文库中直接获取,一、目的基因的获取,限制酶,基因组,DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,1),基因组文库,(Genomic library),是指将某种生物体的,全部基因组DNA,，,用,限制性内切酶,或机械力量,切割,成一定长度范围的DNA片段，再与合适的,载体,在体外重组后，导入,受体菌的群体中储存,，这个群体就称为该生物,基因组文库,。,其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。,cDNA(,互补,DNA),：,是用某种生物发育的某个时期的,mRNA,反转录,产生的多种,互补,DNA,（也叫,cDNA,）,片段,，与,载体连接,后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的,cDNA,文库,2)cDNA,文库,(cDNA library,),基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,提取某种生物的全部,DNA,一定大小的,DNA,片段,导入受体菌中储存,用适当的限制酶切割,将,DNA,片段与载体连接,基因组文库,直接分离法,(,鸟枪法,),多用于原核生物,2、,基因组文库的建立方法,某种生物的单链,mRNA,单链互补,DNA,双链,cDNA,片段,导入受体菌中储存,与载体连接,cDNA,文库,反（逆）转录酶,DNA,聚合酶,3、,cDNA文库的构建-反转录法,多用于,真核生物,文库类型,cDNA,文库,基因组文库,文库大小,基因中启动子（具有启动作用的,DNA,片段）,基因中内含子,(,位于编码蛋白质序列的非编码,DNA,片段）,基因多少,物种间的基因交流,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,基因组文库和部分基因组文库,(cDNA,文库,),比较,基因组文库与部分基因文库的关系,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢,?,依据：目的基因的有关信息。,如：根据基因的核苷酸序列,基因的功能,基因在染色体上的位置,基因的转录产物,mRNA,基因翻译产物蛋白质等特性,4、,从基因文库中得到目的基因的方法,寻根问底,为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？,提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是,惟一的方式,。如果所需要的目的基因,序列已知,，就可以通过,PCR,方式,从含有该基因的生物的,DNA,中，直接获得，也可以通过,反转录,，用,PCR,方式从,mRNA,中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的,序列完全不知,，或只知道目的基因,序列的一段,，或想从一种生物体内,获得许多基因,，或者想知道这种生物与另一种生物之间,有多少基因不同,，或者想知道一种生物在个体发育的,不同阶段表达的基因有什么不同,，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。,18,（二）利用,PCR,扩增目的基因,(,二,)利用PCR技术扩增,(,二,)利用PCR技术扩增,概念：,PCR,全称为,_,，是一项,在生物,_,复制,_,的核酸合成技术,条件：,_、,_、_(做启动子)、,_,。,原理：,_,方式：,以,_,方式扩增，即,_,（,n,为扩增循,环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定,DNA,片段,DNA,复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,热稳定,DNA,聚合酶（,Taq,酶）,指数,2,n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,前提条件,过程：,a,、,DNA,变性,（,90-96,）：双链,DNA,模板,在热作用下，,_,断裂，形成,_,b、退火,（复性,5,5-65）：系统温度降低，,引 物,与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸,（70-75）：在,DNA聚合,酶的作用下，从引物的,5端3端,延伸，合成与模板互补的_。,氢键,单链,DNA,双链,DNA,链,DNA,合成方向总是从子链的,5端3端,延伸,PCR,技术扩增与,DNA,复制的比较,PCR,技术,DNA,复制,相同点,原理,原料,条件,不同点,解旋方式,场所,酶,结果,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA,在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定,DNA,聚合酶,细胞内的,DNA,聚合酶,大量的,DNA,片段,形成整个,DNA,分子,（三）,、人工合成法：,基因,较小,，核苷酸,序列已知,，可以利用,DNA,合成仪,人工合成,反,转录法,目的基因的信使,RNA,目的基因,化学合成法,肽链氨基酸序列,信使,RNA,序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,逆转录,人工合成法,推测,推测,单链,DNA,合成,1,、下列属于获取目的基因的方法的是(),利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取,从受体细胞中提取 利用PCR技术,利用DNA转录 人工合成,A.B.C.D.,2,、有关基因工程的叙述正确的是 （）,A、限制酶只在获得目的基因时才用,B、重组质粒的形成在细胞内完成,C、质粒都可作为运载体,D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,1,.,作用,：,二,.,基因表达载体的构建核心,IMN,2,.,组成,：,使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代,。,同时使目的基因能表达和发挥作用。,(3),终止子：,(4),标记基因：,(2),启动子：,(1),目的基因。,（,5,）复制原点：,不同受体细胞，目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建有所差异。,是,RNA,聚合酶识别和结合部位。,是使转录在需要的地方停止。,是鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。,是复制的起点。,载体,与,表达载体,的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分,DNA,片段。,表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构,用到的工具酶：,既用到限制酶切割载体，又用到,DNA,连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键,启动子、终止子,对于目的基因表达必不可少,目的基因不能单独进入受体细胞，,必需以表达载体的方式携带进去。,注意,寻根问底：将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？,提示：有人采用总,DNA,注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总,DNA,提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，,严格来讲不算基因工程,。,思考与探究：,1.,作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：,（,1,）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；,（,2,）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；,（,3,）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；,（,4,）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；,（,5,）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,3,、将目的基因导入受体细胞,转化,方法,将目的基因导入,植物细胞,将目的基因导入,动物细胞,将目的基因导入,微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞法,目的基因进入,_,内，并且在受体细胞内维持,_,和,_,的过程,受体细胞,稳定,表达,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,1,、将目的基因导入植物细胞的方法：,（,1,）农杆菌转化法,农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：,Ti,质粒上,的,T-DNA,可以转移到受体细胞，并,整合到受体细胞染色体的,DNA,上,。,双子叶植物,、,祼子植物,适用生物,?,目的基因,Ti,质粒上的,T,DNA,插入,植物细胞,农杆菌,染色体,DNA,上,维持稳定和表达,并整合到,导入,感染,同时,T-DNA,导入,过程：,优点,：,比较经济和有效,思考与探究,：,2.,根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗,?,若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做,?,要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；,要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。,37,（2）,基因枪法：,利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属粒表面的表达载体,DNA,打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法,操作方法：,金属粒：,将目的基因导入单子叶植物细胞,钨粉粒子和金粉粒子，,粒子的直径一般在,0.6,4um,。,适用：单子叶植物,缺点：,成本较高,（3）,花粉管通道法：,将目的基因导入植物细胞,操作方法：,特点：,在植物受粉后，花粉形成花粉,管还末愈合前期，剪去柱头，然后,，滴入,DNA,（含目的基因）使目的基因,借助花粉管通道进入受体细胞,十分简便经济,例：,转基因抗虫棉,2.,将目的基因导入动物细胞,显微注射技术,提纯含目的基,因的表达载体,取出受精卵,显微注射,受精卵移植入,输卵管或子宫,发育成具新性状的动物,方法：,程序：,培养成早期胚胎,原核生物特点：,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，故早期常作为受体细胞。,大肠杆菌细胞,感受态细胞,用,Ca,2+,处理,重组表达载体,DNA,溶于缓冲液,混合,转入,方法：,常用菌：,大肠杆菌,3.,将目的基因导入微生物细胞,通过标记基因，进行筛选和检测,导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组,DNA,分子吗？,真正能摄入重组,DNA,分子的受体细胞很少。,所以要对受体细胞作怎样的处理？,对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测,怎样进行检测？,4,、目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,检测,鉴定,检测转基因生物,染色体的,DNA,上是否插入了目的基因,检测目的基因,是否转录出了,mRNA,检测目的基因,是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA,分子杂交,分子杂交,抗原抗体杂交,DNA,分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的,DNA,分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,碱基互补配对,原理：,1,.,检测,转基因生,物的DNA,探针,15,N,15,N,1,4,N,1,4,N,（,1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,基因探针：,放射性同位素等标记含有目的基因的DNA片段,方法,DNA,分子杂交技术,方法,分子杂交技术,（,2,）检测目的基因,是否转录出了,mRNA,探针,15,N,15,N,转基因生物,的,mRNA,1,4,N,提取,（,3,）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法,苏云金杆菌,Bt,毒素蛋白,将,Bt,毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗,Bt,毒素的抗体,抗体,Bt,毒素蛋白（抗原）,出现杂交带,脱分化,组织培养,证明：,提取蛋白质与,Bt,毒素蛋白质一样,抗原,-,抗体杂交,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,2,.,鉴定,个体生物学水平的鉴定,（,1,）多细胞个体,抗虫、抗病结种实验，活性比较实验,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了,表达。,受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因,完成了表达吗？,若不能表达，要对抗虫基因再进行,修饰,。,无表达产物,无表达产物,有表达产物,无表达产物,细菌的检测，将,每个,受体细胞单独培养,形成菌落,，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,（,2,）单细胞生物,3.,利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,思考与探究：,53,（,1,）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）,（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子,和,终止子,，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。,（,3,）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。,（,4,）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取-珠蛋白。,4,.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？,54,1,）以下说法正确的是 （）,A,、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,B,、质粒是基因工程中唯一的运载体,C,、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接,D,、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,练习,2,）不属于质粒被选为基因运载体的理由是,A,、能复制,（）,B,、有多个限制酶切点,C,、具有标记基因,D,、它是环状,DNA,D,练习,3,）有关基因工程的叙述中，错误的是（）,A,、,DNA,连接酶将黏性末端的碱基对连接起来,B,、限制性内切酶用于目的基因的获得,C,、目的基因须由运载体导入受体细胞,D,、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,练习,4,）有关基因工程的叙述中，错误的是（）,A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来,B、限制性内切酶用于目的基因的获得,C、目的基因须由运载体导入受体细胞,D、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,练习,5,）基因工程是在,DNA,分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （）,A,、人工合成目的基因,B,、目的基因与运载体结合,C,、将目的基因导入受体细胞,D,、目的基因的检测和表达,C,练习,演讲完毕，谢谢观看！,