微生物的实验室培养终.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,微生物的类群,原生生物,原核生物,真菌,病毒,如酵母菌,单细胞的动植物,如草履虫、单细胞藻类等,微生物包含了除,植物界,和,动物界,以外的所有生物,无细胞结构,真核细胞,细菌、蓝藻,原核细胞,专题2 微生物的培养与应用,课题1 微生物的实验室培养,课题1 微生物的实验室培养,微生物的实验室培养,条件,：,（1）为培养的微生物,提供合适的营养和环境,条件,（2）,确保其他微生物无法混入,研究和应用微生物的,前提,防止杂菌入侵,，获得纯净的培养物,几种菌落及其形态,几种菌落及其形态,微生物需要的四大类营养要素物质是：,3.培养基的构成,1.碳源 2.氮源 3.无机盐 4.水,凡是能为微生物提供所需碳元素的营养物质。,无机碳源：,CO,2,；NaHCO,3,等,有机碳源：,糖类、脂肪酸、蛋白质、花生粉饼、石油等,概念,来源：,不同微生物所利用的碳源不同：,1.微生物的碳源,异养型微生物的碳源为：,含碳有机物（有机碳）,自养型微生物的碳源为：,含碳无机物（无机碳）,无机氮源：,N,2,、铵,盐,、,硝酸盐,、NH,3,等,有机氮源：,尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等,凡是能够为微生物提供N元素的营养物质。,2.微生物的氮源,概念：,来源：,固氮微生物所利用的氮源是：,3.特殊要求,培养基还需要满足微生物生长对,pH,、,特殊营养物质,例如:,生长因子,(微生物生长不可缺少的,微量,有机物）如维生素、某些氨基酸、碱基,)以及,氧气,、,二氧化碳,、,渗透压,等,的要求。,氮气,例1、下列物质可作为培养硝化细菌碳源、氮源和能源的依次是（）,A含碳无机物、氨、氨B含碳无机物、氮、硝酸盐,C含碳有机物、氨、光D含碳有机物、硝酸盐、氨,例2、要将土壤中的自生固氮菌（如原褐固氮菌）与其它细菌分离出来，应将它们接种到（）,A加入指示剂的鉴别培养基,B含有蛋白胨的固体培养基,C没有有机氮的选择培养基,D营养要素全面的液体培养基,练一练,牛肉膏当中含有,肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类。,的水溶性物质。,牛肉膏为微生物提供碳,源,、,氮源、,磷酸盐和维生素.,蛋白胨主要提供,氮源,和,维生素,。,1.无菌范围：,实验操作空间,操作者的手、衣着,消毒.,将用于微生物培养的,器皿、接种用具和培养基,等器具进行灭菌。,为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在,酒精灯火焰附近,进行.,实验操作时应避免已经,灭菌处理的材料用具,与周围的物品相接触.,超净工作台,二.无菌技术：,防止外来杂菌的污染,耐高温需保持干燥的 物品，160170 12小时,接种环、接种针等 金属用具,7075、30min,80、15min,100、56min,消毒,灭菌,定义,方法,较为,温和,理化方法，,杀死,部分微生物,（,不,包括芽孢、孢子）,强烈,的理化因素，,杀死,所有微生物,（包括,芽孢、孢子,）,煮沸消毒法,巴氏消毒法,化学药剂,紫外线,灼烧灭菌,干热灭菌,酒精、氯气、石炭酸或煤酚皂溶液等,高压蒸汽灭菌,培养基，,100KPa、,121、1530min,2.消毒与灭菌：,灼烧,灭菌,干热灭菌箱,高压蒸汽灭菌锅,煮沸,消毒,法,巴氏消毒法,化学药剂（70%酒精等）,紫外线,针对不耐高温的液体,接种室、超净工作台,能耐高温的，需要保持干燥的物品,灼烧法,干热灭菌,高压蒸汽灭菌,接种工具（接种环等）,吸管,实验操作者的双手,培养皿等玻璃器皿,培养基,1、消毒方法,2、灭菌方法,干热灭菌,1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。,（1）培养细菌用的培养基与培养皿,（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管,（3）实验操作者的双手,答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒,。,旁栏思考,1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方,H,2,O 定容至1000ml,Nacl 5g,蛋白胨 10g,牛肉膏 5g,琼脂20.0g,三.大肠杆菌的,纯化,培养：,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,1.计算：,培养基用量,依配方计算各成分的用量,2.称量：,3.溶化：,牛肉膏黏稠，用称量纸称取,牛肉膏、蛋白胨易吸潮，称取时？,牛肉膏、称量纸、少量水加热溶解,取纸,蛋白胨、NaCl,琼脂,补水定容,4.调pH、分装、封口：1mol,lNaoH调制微碱,5.灭菌：,6.倒平板：,培养基、培养皿,?,思考1,溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热?,加琼脂的目的是什么,?,可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能,溶于水中,减少误差,作为凝固剂,思考2,在灭菌前,用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的锥形瓶的目的是什么？,培养皿能否用高压蒸汽灭菌？,?,在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞；,在取出培养基锥形瓶时也能起到隔绝空气中杂菌污染的作用,不能,因为培养皿要保持干燥,应该用干热灭菌,倒平板,约50,防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染,灼烧灭菌，,防止瓶口的微生物污染培养基,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,问题讨论,答：,可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,（二）纯化大肠杆菌,微生物接种方法常见的有,平板划线法,和,稀释涂布平板法。,1.平板划线法,通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。,在数次划线后可以分离到由,一个细胞,繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体称,菌落,。,将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环_,在_旁冷却接种环，并打开棉塞,将试管口通过火焰,.,将已_的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液,左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，,划_条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。,.,将试管通过火焰，并塞上棉塞,火焰,冷却,三至五,灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的_开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。,注意不要将最后一区的划线与第一区相连。,末端,烧红,将平板_放入培养箱中培养。,倒置,划3个平板,1个不划线,（空白对照）,问题讨论,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,答：操作的,第一步,灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；,每次划线前,灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。,划线结束后灼烧接种环,，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，,能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,2.稀释涂布平板法,将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。,在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。,稀释涂布平板法操作过程分,两个步骤，即系列稀释操作和涂布平板操作。,系列稀释操作,10,1,10,2,10,3,10,4,10,5,10,6,(1)将分别盛有9mL水的试管灭菌并编号。,(2)用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。,(3)从10,1,倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入第三支试管中，重复步骤2，直至到第六支试管。,涂布平板操作,(1)将涂布器浸在盛有70的酒精的烧杯中。,(2)取少量菌液（不超0.1mL），滴加到培养基表面。,(3)将沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄后冷却810s。,(4)用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。,b.涂布平板：,不超过0.1ml,各梯度分别涂布3个平板,1个不涂布作空白对照,滴,灼,试,涂,稀释10,3,倍,稀释10,4,倍,稀释10,5,倍,2.菌种培养,：,3.实验结果观察,将,接种后,的培养基和一个,未接种,的培养基,放入37恒温箱中培养12h24h后，,观察并记录,涂布平板操作讨论,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？,应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。,将接种后和未接种（作为对照组）的培养基均放到37,0,C的恒温箱中，培养1224h后进行观察并记录结果。,1.未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？,未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。,2.在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的菌落？它们的大小、形状、颜色相似吗？,如果接种成功的话，在培养基的表面可观察到大小、形状、颜色相似的菌落。,四、结果分析与评价,3.培养12h和24h后，观察到的实验结果相同吗？如果不同，请分析产生差异的原因？,培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同。随着时间的延长、菌落的不断生长，使菌落不断增大。,4.如果在培养基上观察到不同形态的菌落，请分析其可能的原因。,无菌操作未达到要求：可能是培养基灭菌不彻底；可能是接种时发生了污染；也可能是在培养的过程中受到了污染。,四.,课题延伸-菌种的保藏,：,1.临时保藏：,试管固体斜面培养基上,4,2.长期保存：,菌种易被污染、变异,甘油管藏,1ml甘油1ml菌液,20,