目的基因的转化.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。,只有获得大量的转基因植株，才能挑选出理想的育种材料。目前植物转基因的成功率还很低，存在转化技术复杂、难以规模化操作、及与常规育种结合不紧密等问题，也是植物基因工程产业化的一个瓶颈。,目的基因转化首先要建立理想的受体植物感受态系统，其次是建立高效的基因转化系统。,植物基因转化受体系统的建立,根癌农杆菌Ti质粒基因转化,发根农杆菌Ri质粒基因转化,植物病毒载体介导基因转化,DNA直接导入法基因转化,植物种质系统介导基因转化,植物质体基因转化系统,第一节 植物基因转化受体系统的建立,植物基因转化受体系统，是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能,高效、稳定地再生,无性系，并能,接受外源DNA整合,，对转化选择性,抗生素敏感,的再生系统。,一、植物基因转化受体系统的条件,高效稳定的再生能力,较高的遗传稳定性,具有稳定的外植体来源,对选择性抗生素敏感,对农杆菌侵染有敏感性,1.高效稳定的再生能力,用于植物基因转化的外植体必须易于再生，有很高的再生频率，并且具有良好的实验稳定性和重复性。,不同植物的种类、细胞类型、细胞状态、特定的植物培养技术的成熟程度等在建立受体系统时均需考虑。,理论上讲，植物的体细胞都具有再生完整植株的潜能，即具有全能型。但是在组织培养的实践中并不是所有的体细胞都能再生出完整的植株。,植物细胞的全能性,把具有较强全能性的细胞从植物组织抑制性影响下解脱出来，使其处于独立发育的离体条件下；,赋予细胞一定刺激，即营养物质、激素等调控物质。,培养技术不成熟、深度的分化难以逆转等原因，可造成不能再离体条件下表现全能性。,只有具备成熟的组织培养条件，保证经外源基因转化的细胞能继续分化成完整植株，才能作为基因转化的受体系统。,植物基因转化率低，再生频率有不同程度的降低，有的甚至不能再生。因此再生系统必须高效，并且具有良好的稳定性和重复性。,2.较高的遗传稳定性,植物受体系统接受外源DNA后不影响其自身的遗传体系，同时又能稳定地将外源基因遗传给后代，保持遗传的稳定性。,组织培养发现体细胞无性系变异非常普遍，而这些变异与组织培养的方法、再生途径及外植体的基因型等都有密切关系。,因此，在建立基因转化系统时应充分考虑到这些因素，确保转基因植物的遗传稳定性。,3.具有稳定的外植体来源,转化的外植体一般采用种子，无菌实生苗的胚轴、子叶或幼叶，可进行离体快速繁殖的材料如一些植物的试管苗，以及可较高频率诱导的营养变态器官等。,4.对选择性抗生素敏感,抑菌抗生素的条件：,对植物细胞无毒害作用或毒性较小；,有效地抑制细菌生长，特别是农杆菌，,例如头孢霉素。,选择性抗生素：淘汰非转化细胞或植株,植物受体材料对所选用的抗生素有一定的敏感性；,抗生素对受体植物没有严重的毒性，不会很快杀死植物细胞，否则转化细胞也难以生活，,例如潮霉素，卡那霉素。,5.对农杆菌侵染有敏感性,对于利用农杆菌Ti或Ri质粒为载体所介导的植物基因转化而言，需要植物受体材料对农杆菌敏感。,不同的植物，甚至是同一植物的不同组织细胞对农杆菌侵染的敏感性也有很大差异。,因此，在选择农杆菌转化系统前必须测试受体系统对农杆菌侵染的敏感性，只有对农杆菌侵染敏感的植物材料才能作为其受体系统。,植物组织培养转化受体系统,20世纪70年代以来，对植物基因转化受体系统的研究已进行了大量的工作，先后建立了多种有效的受体系统，适应于不同转化方法的要求和不同的转化目的。这些受体系统类型各有所长。,植物非组织培养转化受体系统,二、,植物组织培养转化受体系统,愈伤组织再生系统,直接分化再生系统,原生质体再生系统,胚状体再生系统,愈伤组织再生系统,外植体经脱分化培养诱导愈伤组织，并通过分化培养或得再生植株的受体系统。,2.1 植物组织培养转化受体系统类型,特点：,易于接受外源基因，转化率较高；,扩繁量大，可获得较多的转化植株；,外植体试材广泛，多种组织器官均可诱导愈伤组织；,再生植株无性系变异较大，遗传稳定性较差；,嵌合体多；,适用的植物范围广。,直接分化再生系统,外植体细胞越过脱分化产生愈伤组织阶段而直接分化出不定芽获得再生植株。,特点：,获得再生植株的周期短，操作简单；,可较好维持受体植物的遗传特征；,转化的外源基因能稳定遗传；,再生植株无性系变异较大，遗传稳定性较差；,嵌合体多；,转化频率较低。,原生质体再生系统,原生质体是“裸露”的植物细胞，能直接高效地摄取外源基因，因而转化效率高且适合于现在建立的所有的转化方法；,原生质体再生系统通常处于相对均匀和稳定的控制环境中，从理论上说，有利于准确的转化和鉴定；,通过原生质体培养，细胞分裂形成基因型一致的细胞克隆，因此再生植株的嵌合体少；,原生质体培养经历许多复杂的生长、发育过程，因此细胞无性系的变异更为强烈，遗传稳定性更差；,原生质体培养周期长、难度大、再生频率低，局限性也较大。,胚状体再生系统,胚状体是指经体细胞胚发生而形成的形态结构和功能上类似于有性胚的结构，又称为体细胞胚。与有性胚一样，在一定条件下可发育成完整的植物体。,有些植物本身在自然条件下其珠心组织或助细胞就可自发地形成胚状体。,组培过程中，一些体细胞及其单倍体细胞也诱导形成胚状体。,特点：,胚状体胚性细胞接受外源DNA能力强，是理想的基因转化感受态细胞；,多数为单细胞起源，嵌合体少；,具有两极性，可分化出芽和根，减少生根培养环节；,利用转基因胚状体可以生产人工种子；,个体遗传背景一致、无性系变异小、胚结构完整、成苗快、数量大等，有利于转基因植株的生产和推广；,现今普遍认为胚状体是较理想的基因转化受体系统。,2.2,植物组织培养转化受体系统建立的程序,外植体的选择,选择幼年型的外植体,近根部、茎尖区、生长点区的组织器官一般为幼年型。,选择繁殖能力强的外植体,减数分裂前的幼嫩花序和减数分裂后的珠心组织作为外植体是建立高频再生系统及其理想的材料。,选择萌动期的外植体,离体培养芽休眠和萌动时间与田间自然条件十分相似，离体培养同样要经过休眠期。,选择具有强再生能力基因型的外植体,外植体的再生能力与其基因型有直接关系。应对同一植物的不同基因型的外植体进行再生能力筛选。,选择遗传稳定性好的外植体,遗传稳定性好的才能将转入的基因以及本身的优良性状保留。,总体来看，采用胚、幼穗、顶端分生组织、幼叶、幼茎等作为外植体。,培养基的确立,培养基,的类型,富集元素平衡培养基：如MS培养基,KNO,3,含量较高的培养基：如B5、N6、SH,中等无机盐含量培养基：如H、Nitsch、Miller、Blaydes,低无机盐含量培养基：如White、WS、HE、Blaydes,培养基选择原则：,同一物种的培养基有雷同性，不同亚种、品种间基本培养基类型基本相同；,同一植物的不同组织器官的基本培养基类型基本相同；,组培所需营养成分与田间栽培有相似性；,MS培养基是大多数植物的通用培养基；,无机盐浓度是基本培养基类型的重要因素，应作为培养基选择的重要参数；,有机成分主要是种类的变化，含量变化不大；,蔗糖浓度不可忽视，应该在确定基本培养基类型后研究最适的蔗糖浓度；,提高磷酸根的水平可以抵消IAA对芽的已知作用，促进芽的分化；,水解酪蛋白能加强激动素诱导分化作用，特别当有高水平的IAA时更为显著。,激素选择原则：,生长素。影响茎和节间伸长、向性、顶端优势、叶片脱落和生根等。组培中促进细胞分裂、诱导愈伤组织和生根。如IBA、NAA、2,4-D、2,4,5-T；,细胞分裂素。促进细胞分裂，改变顶端优势，促进芽的分化等。如ZT、BAP、6-BA、2-ip和KT；,细胞分裂素与生长素的比例是激素使用的关键，根据培养的目的进行调节，原则是生长素明显高于细胞分裂素促进细胞脱分化诱导愈伤组织，反之促进细胞分化；,细胞分裂素与生长素种类对不同植物敏感性不同。同一植物不同组织在愈伤组织诱导和芽分化过程对激素的要求也不同；,有些植物不能活难以得到芽的分化，可使用一些不常用的激素或激素抑制物，可能启动芽的分化。如脱落酸、2,3,5-三碘苯甲酸（0.02 mg/L）、7氮吲哚硝基苯酰溴（0.01-0.1 mg/L）。,抗生素敏感性试验,受体植物的敏感性试验：,加入对植物细胞无毒害作用的抑菌性抗生素的生长，又不影响植物的正常生长；对植物转化体筛选的抗生素浓度试验，既能有效地抑制非转化细胞的生长，使之缓慢地死亡，又不影响转化细胞的正常生长。,设计出愈伤组织诱导或分化再生培养基，加入不同种类不同浓度梯度的抗生素，将未经转化的受体材料置于选择培养基上培养并观察该抗生素对其分化再生的影响。,农杆菌的敏感性试验及菌种的选择,农杆菌载体转化是目前最成功的转化系统，但宿主有一定局限性，即使是同一植物，不同菌株的敏感性也不同。因此选择受体植物敏感的菌株是成功转化的重要因素。,培养野生型农杆菌；,用牙签挑取菌体，穿刺受体植物组织中；,几周后观察肿瘤或发根的诱发情况；,可用带标记（报告）基因农杆菌介导转化。,2.3,植物组织培养转化受体系统建立的常见问题,植物组织培养的污染问题,污染是组培过程中最主要的问题，对转基因植株的快繁增加了生产成本，造成人力、物力和财力的很大损失。,灭菌剂：灭菌效果好、对外植体损伤小易洗脱、对环境和实验人员影响小。常用乙醇、汞和抗生素；此外紫外和臭氧发生器也应用于组培生产。,外植体内生菌,：内生细菌可以由导管进入到外植体的内部。,植物组培苗污染的防治措施：,获得优良外植体：采取地点、季节和外植体本身的特性；,物理方法：挖除污染培养基、转移未污染外植体和切除污染外植体；,培养基加入防腐剂山梨酸和苯甲酸或者抗生素等；,滤纸桥瓶外生根法。,灭菌要彻底,。,各种培养基以及接种过程中使用的各种器具都要严格灭菌。首先是培养基的灭菌，耐高温的培养基需要在121-123条件下灭菌20-30min。一些不耐高温的物质，可采取细菌过滤器除去其中的微生物。其次，在接种的过程中，每使用1次后，都要蘸酒精在酒精灯火焰上灼烧灭菌，特别是在不慎接触到污染物时，极易由于器具引起污染。第三，对于被污染的培养瓶和器皿要单独浸泡，单独清洗，有条件的灭菌后再清洗。,环境消毒,。,尤其是在夏季，高温高湿条件下污染率更高。接种和培养环境要保持清洁，定期进行熏蒸或喷雾消毒。高锰酸钾和甲醛熏蒸效果好，但对人体有一定的伤害，一般每年熏蒸2-3次。平时接种室和培养室可采用紫外线照射消毒或喷2%来苏尔消毒。臭氧消毒机对环境消毒效果较好，而且使用灵活方便，对人体的伤害也相对较小。,严格无菌操作,。,在接种时要严格无菌操作，避免人为因素造成污染。为了使超净工作台有效工作，要定期,对,过滤器进行清洗和更换。每隔一定时间要检测操作区的带菌量，如果发现过滤器失败，则要整块更换。,试管苗的玻璃化现象,指组织培养过程中的特有的一种生理失调或生理病变，试管苗呈半透明状外观形态异常的现象。玻璃化苗绝大多数为来自茎尖或茎段培养物的不定芽。通常玻璃化苗恢复正常的比例很低，在继代培养中仍然形成玻璃花苗，因此，玻璃化苗是试管苗生产中亟待解决的问题。,产生机制：,叶片无功能性气孔，由于保卫细胞的功能失调不能关闭气孔，玻璃化的叶片不具有栅栏组织，只有海绵组织。在茎内有输导组织，但导管和管胞木质化不完全。由于玻璃化植株组织畸形，吸收与光合作用功能不全，因而一般不易再回复成正常的试管苗，分化能力降低，难以继代扩繁，更难以移栽成活。,培养物的褐化,褐变是指在组培过程中，培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变褐，培养材料也随之变褐而死亡的现象。,褐化机理：,三、,植物非组织培养转化受体系统,组织培养条件要求较高，仪器设备昂贵，转化率低，操作复杂及有些植物组织培养困难等许多问题制约基因工程发展。,植物有些组织、器官和细胞同样具有基因转化的条件，再生能力强，分裂旺盛，分化程度低，取材方便，无需组织培养过程，可与常规育种更紧密结合，为非组织培养受体系统。,3.1 植物生殖细胞受体系统,利用植物自身的生殖过程，以生殖细胞如花粉粒、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统。,利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养，诱导出胚性愈伤组织细胞，发育成单倍体，建立单倍体的基因转化受体系统。,直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化。如花粉管导入法、花粉粒浸泡法、子房微针注射法等。,生殖细胞作为受体细胞，具有更强的接受外源DNA的潜能；,受体细胞是单倍体细胞，转化基因无显隐性的影响，使基因充分表达。通过人工加倍可称为纯合二倍体，缩短简单的选育纯化过程；,利用植物自身的授粉过程操作方便、简单，将现代的分子育种与常规育种紧密结合；,受季节限制，只能在短暂的开花期内进行，无性繁殖的植物不宜采用。,特点：,3.2 植物种子受体系统,种子是新一代植物的原始体。胚芽的细胞与卵细胞类似，具有旺盛的分裂能力和强大的再生能力。,只要将外源基因导入种子的胚细胞中，即可发育为一个完整的植株，所以植物种子是天然的受体系统。,3.3 植物茎尖分生细胞受体系统,茎尖是茎的顶端分生组织及其周缘部分，有形成茎和侧生叶的营养茎尖和形成花序或花的生殖茎尖。,分生区位于茎尖的最前端，是典型的顶端分生组织，包括最顶端、没有分化的原分生组织和其下方稍有分化的初分生组织；,分生区细胞可以不断地进行细胞分裂，增加细胞数目，还可促进细胞的分化，从而发育成完整的植株；,所以把外源基因导入茎尖生长点细胞，可获得转基因植株。,3.4 植物质体受体系统,核基因转化是植物基因工程的主要研究方向。但有一些难以克服的弊端，如,细胞核基因组大,、,背景复杂,、,导入的外源基因难以控制,、,外源基因表达效率低,、,后代不稳定,、,对于来自原核的基因必须加以修饰改造,等。,植物中细胞核、质体、线粒体都包含有DNA，相对独立又相互联系的三个遗传系统。,叶绿体转化的优点：,不会出现转基因沉默的现象，外源蛋白质的表达量更高；,可同时进行多种外源基因的表达，类似于原核体系中的多顺反子；,母性遗传，后代不出现形状分离，并可避免外源DNA在田间扩散污染。,第二节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化,迄今所获得的近200多种转基因植株中80%以上是利用根癌农杆菌转化系统产生的。,约93属643种双子叶植物对根癌农杆菌敏感。裸子子午对该菌同样具有敏感性，能诱发肿瘤。一般认为单子叶植物对农杆菌不具敏感性，但近年来有报道，农杆菌对单子叶植物也有侵染能力。,1.常用的根癌农杆菌菌株,2.根癌农杆菌转化程序,2.1 工程载体的构建,一元载体系统,二元载体系统,2.2 目标菌株的制备,根癌农杆菌感受态的制备及转化,2.3 工程菌液制备,制备,纯度高,、,生长旺盛,、,侵染能力,强的农杆菌侵染液,单克隆、对数生长期、去除抗生素,的培养基,2.4 外植体的预培养,促进细胞分裂，分裂状态的细胞更容易整合外源DNA，因而提高外源基因的瞬时表达和转化率；,田间取材的外植体通过预培养起到驯化作用，使外植体适应于试管离体培养的条件，并保持活跃的生长代谢状态；,减少外植体转化过程中杂菌污染率，如果外植体上带污染源时，在预培养中被筛选掉；,有利于侵染接种的外植体能与培养基平整接触。引物外植体在开始培养过程中，由于其迅速生长而出现上翘或卷曲，使农杆菌的接种切面离开培养基使农杆菌不能生长实现转化。,2.5 外植体的农杆菌接菌,一般采用浸泡法。,控制外植体在菌液中浸泡的时间。太短农杆菌尚未接种到伤口面，不能转化，太长导致外植体因农杆菌毒害缺氧而软腐，一般不要超过30分钟；,菌液浓度对不同植物的外植体有一定差异，浓度范围是OD600=0.05-0.7，一般采用较低的OD值和较短的浸泡时间；,浸泡后外植体要在灭菌后适度吸干，时间太长外植体失水萎蔫，不吸干易造成菌体过多，影响共培养。,2.6 外植体的共培养,接种菌体后的外植体培养在诱导愈伤组织或不定芽分化的固体培养基上，在外植体细胞分裂、生长的同时，农杆菌在外植体切口面也增殖生长，该两者共同培养过程称之为共培养。,共培养是整个转化过程中非常重要的环节，引物农杆菌附着，T-DNA的转移及整合都在这共培养时期内完成，因此共培养技术条件的掌握是转化的关键。,共培养：,农杆菌只有在创伤部位生存16小时后才能诱发肿瘤，所以共培养时间必须长于16小时。但不宜太长，否则农杆菌过度生长，植物细胞受到毒害而死亡；,农杆菌增殖适度和生长状态与其侵染能力直接相关。增殖生长不良，转化概率很小，过度增殖，引起毒害导致褐化死亡；,共培养培养基目前采用加入激素的方法，与愈伤诱导或不定芽诱导培养基相同。,2.7 外植体脱菌,共培养后外植体表面及浅层组织中必须进行脱菌培养，使外植体更好地生长发育。,用无菌水清洗外植体，将表面残留的农杆菌清洗；,用抗生素（羧苄青霉素、头孢霉素、替卡西林等）清洗外植体，抑制农杆菌生长；,在选择培养基、分化培养基、生根培养基里加入抗生素持续对外植体脱菌。,不同抗生素对不同植物细胞影响不同。目前使用最多的是头孢霉素，浓度一般为500 mg/L左右。,2.7 外植体选择培养,不同的植物、外植体组织对不同的筛选敏感。目前常用的抗生素有潮霉素、卡那霉素、除草剂等。,根据选择和再生的关系：,先再生后选择。在愈伤组织诱导或不定芽的分化过程中不加入选择压，获得了愈伤组织、不定芽或再生植株后，再在选择培养基中进行筛选。缺点：嵌合体严重，假转化体多，后期工作量大。,先选择后再生。在愈伤组织诱导或不定芽分化培养一开始就加入选择压，只有转化细胞能进行正常生长发育及转化体的再生。,出现假阳性转化植株的原因：,外植体的再生部位与选择培养基未充分接触，选择压不起作用；,转化细胞对非转化细胞的滋养作用；,T-DNA未整合到染色体上，只是瞬时表达；,生理性抗性植株。,愈伤组织的诱导,将水稻种子用75%酒精浸泡30 S，进行表面消毒。倒掉酒精。,0.1%HgCl2晃动消毒20 min，回收升汞。,用灭菌水清洗残留的升汞，重复5次。,用灭菌的吸水纸吸干水分，接种于愈伤诱导培养基NMB培养基。,28暗培养15 d，将水稻胚性愈伤挑出转移到新的NMB培养基。,水稻转基因系统（农杆菌侵染法）,共培养,将诱导的愈伤转接到新的NMB培养基上，28暗培养3-5 d，进行活化。,将活化好的愈伤组织转移到无菌烧杯中，倒入适量农杆菌悬浮液，覆盖愈伤组织。,晃动烧杯，使菌液与愈伤组织充分接触，室温10 min。,取出愈伤组织，用已经灭菌的吸水纸吸干菌液。,将愈伤组织转移到共培养基，26暗培养2-3天。,抗性愈伤组织筛选,将共培养的愈伤组织集中到无菌烧杯中。,加入含有少量吐温-20的灭菌水，晃动5 min充分清洗愈伤组织。,重复5次。,加入含500 mg/L的头孢霉素的无菌水，晃动清洗10 min。,取出愈伤组织，置于灭菌吸水纸，超净工作台2-3 h晾干愈伤。,将愈伤组织转入含相应抗生素的筛选培养基上，28暗培养30d。,抗性愈伤的再生,将筛选出的具有抗性的愈伤组织转接至有相应抗生素的预分化培养基上，26暗培养10 d。,将预分化的愈伤组织转接到含有相应抗生素的分化培养基上，26，12 h光照、12 h黑暗培养30 d。,待再生小苗长至2 cm时，将其转接到生根培养基上，26，12 h光照、12 h黑暗培养10 d。,将生根小苗转移大田栽培。,水稻转化系统,番茄转化系统,拟南芥转化系统,第三节 发根农杆菌Ri质粒基因转化,发根农杆菌的纯化培养,被转化植物材料的预培养和切割,菌株在植物外植体上的接种和共培养,诱导毛根的分离和培养,转化体的确认和选择,转化体毛状根的植株再生培养,转化体的生物测定和分析,发根农杆菌基因转化的影响因素：,发根农杆菌的种类及浓度,植物种类及外植体类型,外植体预培养及共培养时间,培养基类型、激素、酚类等化学因子,光照、温度、pH值、伤害处理等物理因子,发根农杆菌转化的应用,促进生根,增强抗逆性,次生代谢产物生产,第四节 植物病毒载体介导基因转化,植物病毒的侵染机制：,病毒先黏附于细胞膜上，两者的膜相并合，病毒的遗传物质由并合处进入细胞质，或者由于膜的卷曲病毒进入细胞质，然后脱去套膜和壳膜，放出遗传物质。接着在分子水平上进行如下的过程：,DNA进入细胞核，在宿主细胞系统下进行DNA复制；,mRNA将病毒信息传到细胞质；,mRNA利用宿主细胞蛋白质合成系统合成病毒蛋白质；,蛋白质一部分残留在细胞质内，结合到质膜上，另一部分进入到细胞核内，组成病毒衣壳；,病毒颗粒进入到细胞质，在质膜上发育；,发育成熟的病毒颗粒排到细胞外。,病毒载体转化系统的基本条件,病毒的核酸中应该包含目的基因；,作为载体的病毒本身必须能够在植物细胞中正常复制增殖，又不至于过分扰乱寄主的正常生理功能；,病毒接种的方法必须简单可行，以适合较大规模的实际应用；,病毒基因能耐受修饰改造以改变某些生物学特性，主要就是减弱或消除病毒的致病性；,病毒基因组能耐受插入报告基因、目的基因等，同时又不改变病毒的特性。,病毒载体转化的优点,简便易行、廉价、能与常规育种紧密结合；,现有的许多转基因技术都可以应用于病毒的基因转化，如电击法、基因枪法、原生质体法、共培养法、脂质体法等；,脂质体在介导植物病毒RNA的转化方面应用很多，脂质体包裹植物裸露RNA后，与原生质体在特定的融合条件下保温，可获得较高的感染率。,病毒载体与质粒载体转化系统的比较：,植物病毒载体能把外源基因直接导入到宿主细胞，而Ti质粒载体是通过侵染转化等复杂的转移过程而完成；,Ti质粒载体将外源基因整合到植物核DNA上，而植物病毒载体不影响宿主细胞核基因组的结构，从而防止无限传代扩散，比较安全可靠；,病毒载体具有高效的自我复制能力，转化植物可得到高拷贝的外源基因，有利于外源基因的表达和功能实现。Ti质粒载体一般拷贝数低，外源基因蛋白产物低于细胞可溶性蛋白质的1%；,病毒能系统侵染整株植物，避免再生培养，可较快地获得转基因植物；,植物病毒的寄主范围较广，一种病毒基因组构建的载体可用于多种不同的植物的遗传操作。,病毒载体缺点：,外源基因没有整合到基因组，遗传不稳定；,病毒载体仍然存在致病的可能性；,病毒载体中的外源基因很容易丢失。,第五节 DNA直接导入法基因转化,化学诱导DNA直接转化,PEG介导基因转化,脂质体介导基因转化,2.物理法诱导DNA直接转化,电激法介导基因转化,超声波介导基因转化,显微注射介导基因转化,激光微束介导基因转化,基因枪法介导基因转化,低能离子束介导植物基因转化,PEG介导基因转化,PEG、多聚L-鸟氨酸、磷酸钙及高pH条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子。PEG使细胞膜之间或DNA与膜形成分子桥，促使相互间的接触和粘连。,转化步骤：,Ti质粒DNA提取，或直接提取植物的DNA作为目的基因；,原生质体分离；,转化培养。质粒与原生质体一起保温培养，加入PEG，pH8-9；,离心收集原生质体，或用钙离子溶液使PEG逐步稀释；,筛选转化子。,PEG法优点：,对细胞伤害少，转化顺利；,再生植株来源一个原生质体，避免嵌合体产生；,PEG法转化的原生质体易于选择转化体；,受体植物不受种类的限制，只要能建立原生质体再生体系的植物都可以采用PEG法转化。,PEG法缺点：,原生质体再生系统建立比较困难；,转化率低；,原生质体再生的无性系植株变异较大；,脂质体介导基因转化,脂质体是根据生物膜的结构功能性合成人工膜，然后把DNA包裹在人工膜内。将脂质体与原生质体在适当的培养基中混合，加入PEG或PVA，再用高pH、高钙离子溶液漂洗，通过原生质体的吞噬或融合可将外源DNA导入受体细胞。,转化步骤：,用反相蒸发法制备脂质体；,RNA或DNA核酸制备；,脂质体纯化；,脂质体原生质体保温培养转化；,转化原生质体选择培养。,电激法介导基因转化,电激法是利用高压电脉冲作用在原生质体膜上“电激穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。,转化步骤：,分离原生质体，加入电激缓冲液悬浮；,加入质粒DNA和鲑鱼精DNA；,冰浴5分钟；,选择不同参数电激；,筛选培养。,特点：,同样具有PEG原生质体转化的优点；,操作简便；,DNA转化效率高；,适于瞬时表达的研究；,超声波介导基因转化,基本原理是利用低声强脉冲超声波的物理原理，击穿细胞膜造成通道，使外源DNA进入细胞。,操作步骤：,无菌试材的准备；,质粒DNA提取；,超声波缓冲液配制；,超声处理，同时加入5%DMSO以及鲑鱼精DNA；,外植体培养及选择。,特点：,操作简单、设备便宜、不受宿主范围限制、转化率高等。,显微注射介导基因转化,原理简单，利用细微注射仪将外源DNA直接注入受体的细胞质或细胞核中。,操作步骤：,制备原生质体或细胞悬浮液；,提取质粒DNA；,固定原生质体或细胞；,显微注射；,注射后细胞悬浮培养；,细胞再生；,优点：,方法简单，转化率高；适用于各种植物和材料，无局限性；对细胞无毒害，有利于转化体生长发育；不再需要选择系统。,缺点：,需要精细操作的技术及低密度培养的基础，注射速度慢、效率低等。,激光束介导基因转化,基本原理是将激光引入光学显微镜聚焦成微米级的微束照射培养细胞后，在细胞膜上可形成能自我愈合的小孔，使加入细胞培养基里的外源DNA流入细胞，实现基因的转移。,操作步骤：,导入DNA的提取；,受体植物样品处理，高渗溶液浸泡；,转导细胞悬浮液准备。洗掉高渗溶液，加入DNA；,激光微束照射；,细胞、组织培养。,优点：,操作简单；基因转移效率高；无宿主限制，适用于各种动植物；对受体细胞正常生命活动影响小；受体类型广泛；可进行细胞器的基因转化。,缺点：,仪器设备昂贵；转化效率高于化学转化，但低于电激、基因枪；稳定性、安全性相对也较差。,低能离子束介导基因转化,利用离子束对植物细胞的蚀刻作用，造成受体细胞表面的损伤和穿孔，从而引起细胞膜通透性和跨膜电场的改变，有利于将外源基因引入植物细胞，包括通道作用、吸引作用和整合作用三个方面。,操作步骤：,受体材料的选择；,受体材料预处理，甘油或玻璃化处理，减少损伤，保持再生能力；,目的基因、DNA制备；,强流离子注入机处理；,转化后受体细胞活力测定，了解细胞的再生能力；,转基因植株的筛选检测。,基因枪法介导基因转化,基本原理是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上，得到表达，从而实现基因的转化。,操作步骤：,转化率及其影响因素：,金属微粒的影响：钨粉和金粉；,DNA沉淀辅助剂的影响，CaCl2、亚精胺和PEG等，一般降低亚精胺浓度，加入适当的PEG；,DNA的纯度及浓度对转化率的影响。高纯度DNA转化率高，浓度适宜；,微弹速度的影响；,植物材料的内在因素的影响。,第六节 植物种质系统介导基因转化,花粉管导入法介导基因转化,授粉后使外源DNA能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。,外源DNA导入方法：,柱头涂抹法：未受粉前，用DNA导入液涂抹柱头，然后人工授粉，迅速套袋；,柱头切除法：自化授粉一段时间后，切去花柱，将DNA导入液滴于切口，迅速套袋1h后复滴1次；,花粉粒吸入法：提前去雄套袋隔离，花粉粒授粉首先用DNA导入液处理，使外源DNA吸入花粉粒，然后对受体植物进行人工授粉套袋。,缺点,花粉粒介导基因转化,花粉粒的发育过程，将外源DNA导入到单核花粉粒中，通过授粉可将外源DNA导入到受体植物中。,优点：,简化植物转基因操作过程，不经组培；转化率高，最高可达40%；与常规育种技术紧密结合。,缺点：,授粉时受多因素限制；外源基因导入花粉粒技术不够成熟；理论基础不足等。,生殖细胞浸泡法介导基因转化,将供试外植体如种子、胚、胚珠、子房、花粉粒、幼穗等细胞培养物直接浸泡在外源DNA溶液中，利用渗透作用把外源基因导入受体细胞并稳定地整合表达与遗传。,成熟种子浸泡法是高等植物遗传转化技术中最简单、快速、便宜的一种转化方法，不涉及昂贵的仪器及组织培养技术。,但分子生物学方面的证据不足时其致命弱点，所以此转化方法目前只处于研究阶段。,胚囊、子房注射法介导基因转化,使用显微注射仪把外源DNA溶液注入子房或胚囊中，由于子房或胚囊中产生高的压力及卵细胞的吸收使外源DNA进入受精的卵细胞中，从而获得转基因植株。,注射法可以实现基因转化，优点很多，最大缺点是转化效率太低。,第七节 植物质体基因转化系统,质体是存在于植物和藻类细胞中的一种细胞器，有前质体分化而来，包括了负责光合作用的叶绿体、储存淀粉的造粉体、决定植物果实颜色的有色体等类型。作为基因转化系统主要是叶绿体。,植物质体基因转化系统的优越性,外源基因的高通量表达特性；,基因的原核表达形式；,目标蛋白在叶绿体中定位表达；,外源基因定位整合；,外源基因表达无位置效应和沉默现象；,环境安全性好；,易保持纯系、后代不分离。,叶绿体的转化方法及原理：,根癌农杆菌基因转化系统导入植物细胞的外源基因，不能穿越质体双层膜，因此在质体转基因中不能采用农杆菌介导法。现在绝大多数的植物质体转基因都采用基因枪法，也有少数采用PEG介导的原生质体法。,将外源DNA通过适当的转化方法导入叶绿体中；,将外源DNA整合到质体基因组中；,筛选成功转化的叶绿体的细胞；,稳定叶绿体转化株的繁殖；,同质化细胞的筛选；,获得稳定的转基因植株。,叶绿体的转化的难题：,叶绿体的跨膜运输机制与核膜运输机制不同，它属于转录翻译同步运转机制。核孔的开放使核膜运输相对比较容易，而叶绿体需要信号肽的牵引以及多种跨膜蛋白的协同调控才能完成外源基因的定向运输；,叶绿体基因组以高拷贝数形式存在，这样很难达到同质化。通常情况下，每个植物细胞有100个左右的质体，每个质体又有100个左右拷贝的环状基因组DNA。,叶绿体基因转化载体的特性,一般在外源DNA两侧各连接一段质体的序列，称为定位片段。当转化载体被导入质体后，通过定位片段与质体基因组的同源片段之间发生两次同源重组，就可将外源基因定位到基因组的特定位点，从而实现定点整合。,定位片段的条件：,足够的长度，保证外源DNA的有效整合；,合适的插入整合位点，不引起质体基因组序列丢失，不干扰邻近基因的正常功能；,具有合适的限制性酶切位点。,一般选用质体来源的强启动子和终止子保证外源基因的高效表达。,转化外源基因在叶绿体基因组的同质化途径,实现质体基因组同质化的方法是将具有少数质体基因组转化子的植物细胞在高浓度筛选条件下进行一轮一轮的筛选，质体基因组在一代代的复制过程中逐渐降低其异质化程度，直至再生出完全同质化的转化植株。,16S rRNA突变型细胞途径；,利用筛选标记基因途径；,利用花粉管导入途径。,植物转化体系选择原则,