重组DNA技术课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,重组DNA技术,*,重组DNA技术,基因重组,(genetic recombination),是指在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接，组成一个新的DNA分子的过程，又称,DNA重组,。,基因克隆,(gene cloning),将重组DNA分子导入到合适的受体细胞中，使其扩增和繁殖，以获得大量的同一DNA分子，称此为,基因克隆、DNA克隆或分子克隆,。,基因工程,(genetic engineering),是将不同来源的DNA片段与载体分子连接形成重组DNA分子，再导入宿主细胞内进行表达，也称,重组DNA技术,。,2,重组DNA技术,本章主要内容,重要的工具酶,基因克隆常用的载体,重组DNA基本原理,重组技术在医学和制药,工业中的应用,3,重组DNA技术,第一节 重要的工具酶,工,具酶,基因工程中的工具酶主要包括,用于,DNA,和,RNA,分子,的,切割、,连接,、,聚合、逆,转录,等,相关的各种酶类。,4,重组DNA技术,一、限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease,RE),是一类由细菌产生的能专一识别,双链DNA结构,中的特异碱基序列，并在特定的位点进行切割的内切酶，简称,限制酶,。,根据限制酶作用特性，一般分为、和型，,其中常用的是,型限制酶,。,命名,：H in d III,属 种 株 同一株具不同特异性酶,5,重组DNA技术,限制酶（型）识别及切割位点,特异识别及切割4,7个bp长度且具有,回文序列,的DNA片断，主要产生3种末端结构：,5粘性末端,3粘性末端,平端或钝端,回文序列,(palindrome),是指该部位的核苷酸序列呈180,O,反向重复;,粘性末端,(sticky end),是指经内切酶特异切割后产生的5末端突出和3末端突出的碱基序列相互间具有互补性,。,6,重组DNA技术,产生5-粘性末端,产生3-粘性末端,7,重组DNA技术,产生平(头末)端/钝端,8,重组DNA技术,常用限制性核酸内切酶的特性,微生物名称,酶名称,识别顺序,同裂酶,同尾酶,Bacillus amyloliquefaciens,H,解淀粉芽孢杆菌,Bam,H,G,GATCC,Bst,Bgl,Mbo,Bacillius globigil,球芽孢杆菌,Bgl,A,CATCT,Escherichia coli,RY,13,大肠杆菌,Eco,R,G,AATTC,Haemophilus influenzae,流感嗜血菌,Hind,A,AGCTT,Hsu,Providencia stuartii,164,普罗威登细菌,Pst,CTGCA,G,Salp,Streptomyces albus,Subspecies pathocidicus,白色链球菌,Sal,G,TCGAC,Ava,Xho,9,重组DNA技术,限制性内切酶的应用,通过切割不同来源DNA双链的特异碱基序列，,产生,含有黏性末端或平端的、长度不同的DNA片段。,用于DNA重组、制备探针、分子杂交、DNA序列分析等。,10,重组DNA技术,二、DNA聚合酶,（,最常用的DNA聚合酶有以下4种,）,DNA聚合酶（全酶）,DNA聚合酶大片段Klenow片段,Taq DNA聚合酶,T,4,噬菌体DNA聚合酶,11,重组DNA技术,DNA聚合酶,E.Coli,DNA聚合酶（DNA pol）是一个具有,3 种酶活性的多功能性酶。,包括：,5,3,DNA,聚合酶活性,5,3,核酸外切酶活性,3,5,核酸外切酶活性,12,重组DNA技术,DNA pol 应用,常用来,催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA,探针,；,cDNA第二条链的合成；,填补3,突出末端；,DNA序列分析。,13,重组DNA技术,E.coli,DNA pol.催化缺口平移,*,T,*,T,*,T,*,T,Mg,2+,D,N,a,s,e,I,5,3,3,5,3 5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,dATP,dCTP,dGTP,-,32,P dTTP,E.coli,DNA POL I,14,重组DNA技术,Klenow片段（DNA pol.大片断）,15,重组DNA技术,Klenow片段用途,双链DNA的,3末端标记；,（2）,用于,cDNA克隆中第二股链的合成,；,16,重组DNA技术,Taq DNA pol（耐热DNA聚合酶）,作用特点,1）Taq DNA pol催化DNA合成的最适温度范围,70,75，,2）95以上高温，半小时不失活，,3）最适合用于,聚合酶链反应（PCR）扩增DNA片段,。,17,重组DNA技术,三、逆转录酶,(reverse transcriptase),特点,逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶,活性：,以单链RNA为模板，催化合成cDNA单链,具有RNase H 活性，能水解RNA:DNA杂交链中的,RNA,以DNA为模板，,催化合成cDNA双链。,18,重组DNA技术,逆转录酶的应用：,将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库,；,补平和标记5,-末端突出的DNA片段；,代替Klenow酶用于DNA序列分析；,制备杂交探针等。,19,重组DNA技术,四、DNA连接酶,(DNA ligase),催化双链DNA中一条链的3OH与另一条链的5PO,3,H,2,形成磷酸二酯键，从而构成完整的DNA长链。,DNA连接酶的用途,（1）两个双链DNA片段连接起来,5-ACG AATTCGT-3,T,4,DNA连接酶,5-ACGAATTCGT-3,3-TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-5,（2）修补带有缺口的双链DNA分子,T,4,DNA连接,酶,20,重组DNA技术,五、碱性磷酸酶,（alkaline phosphatase）,能够催化水解去除DNA或RNA5-端的磷酸基团。,用途,制备载体,时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子 5端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。,用,32,P标记5-端前，去除5-P，再通过激酶作用把放射性核苷酸加到,5-端进行标记,。,21,重组DNA技术,六、末端（脱氧核苷酸）转移酶(TdT),作用,将标记或未标记的dNTP加到DNA的3OH末端；也可催化载体分子或待克隆的DNA片段上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。,应用,探针标记,P,32,-,.,dGTP,G,32,G,32,G,32,G,32,G,32,G,32,G,32,G,32,在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接,3,3,22,重组DNA技术,重要的工具酶,工具酶,活性,限制性核酸内切酶,识别特异碱基序列，切割DNA,T4 DNA连接酶,催化DNA5,-磷酸与3,-羟基,形成磷酸二酯键,DNA聚合酶,以DNA为模板合成DNA,逆转录酶,以RNA为模板合成cDNA,碱性磷酸酶,切除5,末端磷酸,T4多聚核苷酸激酶,催化核酸5-羟基磷酸化,末端脱氧核苷酸转移酶,催化3-端合成同聚尾,23,重组DNA技术,第二节 基因克隆常用的载体,载体,(vector),是指能在连接酶作用下和外源DNA片段连接起来，并运送到宿主细胞的运载工具。其化学本质为DNA分子。,本节主要内容,载体必须具备的基本条件,载体的分类,常用的载体,24,重组DNA技术,一、载体必须具备的基本条件,具有独立复制能力,具备多个限制酶的识别位点(,多克隆位点,),具有,遗传表型或,筛选,标记,有,足够的容量,以容纳外源DNA片段,可导入受体细胞。,25,重组DNA技术,二、载体的分类,*,（一）,克隆载体,用来克隆和扩增DNA片段的载体。,有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA三类,。,（二）,表达型载体,为了使插入的外源DNA能够表达为多肽链而设计的载体称为,表达型载体,。,表达型载体,除需载体必备条件外，还需相应的,启动子、核糖体结合位点、增强子、终止子,等表达调控构件。,26,重组DNA技术,三、常用的载体,（一）质粒(plasmid)：,是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状DNA分子。,作为克隆载体的质粒应具备以下特点：,1.分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内，,有较高的拷贝数；,2.具有1个以上的遗传标志，便于筛选；,3.具有多克隆位点。,27,重组DNA技术,总而言之，质粒载体应该是一种分子量较小、高拷贝的“松弛型”质粒，且具有一个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。,广泛应用的质粒：,pBR32质粒、pUC系列等,28,重组DNA技术,pBR322质粒,4363 bp,含一个复制点,含一个抗氨卞青霉素基因,(,amp,R,),一个抗四环素基因,(,tet,R,),amp,R,和,tet,R,抗性,基因内各有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入,当外源基因插入抗药基因内后，抗药基因失活。,Amp,R,Amp,敏感,(,Amp,S,),、,Tet,R,Tet,敏感,(,Tet,S,).,29,重组DNA技术,pUC系列质粒,由pBR322和M13噬菌体构建而成的双链质粒载体；,（1）2674bp；,（2）有,amp,R,和与M13噬菌体,相同的多克隆位点（MCS）,（3）有1个来自E.coli的,LacZ基因,片断,编码半乳糖苷酶，,便于蓝白筛选,30,重组DNA技术,(二)噬菌体,组成特点,：,双链线状DNA分子，,全长50kb，,含66个基因，,在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为,COS位点,。,31,重组DNA技术,噬菌体两种生长途径（示意图）,32,重组DNA技术,噬菌体感染细菌后的,两种生长途径,溶菌性生长,噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补,成环,，在宿主菌体内,连续复制,，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，,裂解宿主菌,，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。,溶源性生长,噬菌体感染细菌后，可将自身DNA,整合,到细菌的染色体中去，与之,一起复制,，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。,33,重组DNA技术,第三节 重组DNA基本原理,（,DNA重组基本程序包括下列过程）,分,获取目的基因和载体,接,目的基因与载体的连接,转,重组DNA导入宿主细胞,筛,重组DNA的筛选与鉴定,34,重组DNA技术,一、目的基因的获取（,分,）,目的基因,是指所要研究或应用的基因，也是需要克隆或表达的基因。,目的基因来源,1）制备基因组DNA,2）制备cDNA,3）聚合酶链反应,4）人工合成基因,35,重组DNA技术,（一）制备基因组DNA,（基因,文库，,genomic library,）,分离、纯化基因组DNA,在EDTA等存在下，用蛋白,RE,酶,K,消化细胞、酚抽提；,大小不同酶切片段,常用蔗糖梯度离心或电泳,分离酶切片断；,分别与同样RE酶切的载体连接,常用噬菌体载体或质粒载体,DNA连接酶连接；,导入宿主细胞、扩增,导入宿主细胞内培养、扩增；,得到分子克隆混合体,用分子杂交等方法进行鉴定、,（基因文库）,筛选、再扩增，分离、回收。,36,重组DNA技术,（二）制备cDNA,（cDNA文库）,分离目的基因,的mRNA,逆转录生成cDNA单链,水解去除mRNA，,合成cDNA双链,水解回折处单链,得到平端双链cDNA,与载体连接，导入宿主细胞扩增,构建cDNA文库。,37,重组DNA技术,（三）聚合酶链反应(PCR),在体外，,以目的基因为模板，在DNA引物、dNTP、TaqDNA Pol等存在下，构成一个反应体系。经,94变性、54退火及72延伸,3个步骤的反复多次循环（25,30次,），扩增目的基因.,（四）人工合成基因,应用DNA测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。,（,一般先合成短片断DNA，然后再拼接成长片段,）,38,重组DNA技术,二、目的基因与载体的连接（,接,）,（主要有以下4种连接方式）,1),粘性末端连接,2）,平头末端连接,3）,人工接头法,4）,同源多聚尾连接法,39,重组DNA技术,（一）粘性末端连接,将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生,相同粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组DNA分子。,（二）平头末端连接,有些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成,平端，此时在,T,4,DNA连接酶,的作用下同样能连接起,来。,40,重组DNA技术,（三）人工接头法,合成,连接子,与DNA平头末端连接限制酶切割,产生粘性末端连接，构建重组DNA。,41,重组DNA技术,（四）同源多聚尾连接法,42,重组DNA技术,三、重组DNA导入宿主细胞（,转,）,无性繁殖,体外重组后的DNA,导入,受体细胞,，然后随受体细胞生长、增殖，使重组DNA发生复制、扩增，这一过程称为无性繁殖。,克隆,从上述无性繁殖细胞中进一步筛选出含目的DNA的重组体分子即为无性繁殖系或克隆。,宿主细胞,进行无性繁殖时所采用的受体细胞.,43,重组DNA技术,重组DNA,导入,宿主细胞的,类型,转化,以,质粒,作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；,转染,以病毒,作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；,转导,以,噬菌体,作载体构建的重组体导入受体细胞的过程,。,感受态细胞,用特殊方法处理（CaCL,2,）后，受体细胞才具备接受外源DNA的能力，这种细胞称,感受态细胞,。,感受态细胞有原核细胞和真核细胞两大类。,44,重组DNA技术,四、重组DNA的筛选与鉴定（,筛,）,（,筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法,）,1）平板筛选,2）限制酶切图谱筛选,3）PCR筛选重组体,4）原位杂交技术,插入失活,蓝白筛选,45,重组DNA技术,（一）平板筛选,是指利用载体的遗传性标记在平板上直接筛选的方法。,具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能,在含抗生素（Amp或Tet）的培养平板上生长；未转,化的则不能生长。,插入失活,当外源,DNA,序列插入质粒中某一抗药基因内，使,该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的,培养平板上。,46,重组DNA技术,抗生素平板筛选,（,插入失活,）,47,重组DNA技术,2.,蓝,-,白,筛选,利用蓝色化合物的形成作为,指示剂,，筛选带重组质粒的细菌。,载体：,编码-半乳糖,宿主：,编码-半乳糖,苷酶,N端,序列,苷酶,C端,序列,-互补,细菌表达：,-半乳糖苷酶活性,5-溴-4-氯-3-吲哚（,X-gal,）,形成,蓝色菌落,当在质粒中,插入外源DNA,-半乳糖苷酶的N端基因失活,不能与宿主,-半乳糖苷酶的C端,进行-互补,产生,白色菌落,。,（IPTG 存在下）,48,重组DNA技术,蓝,白,筛选,示意图,49,重组DNA技术,(二)限制性内切酶图谱鉴定,50,重组DNA技术,（三）PCR筛选重组体,抽提少量重组DNA,PCR扩增,电泳鉴定,序列分析。,（四）原位杂交技术,51,重组DNA技术,1、获取,DNA重组基本过程(小结),52,重组DNA技术,2、重组,53,重组DNA技术,3、转化,体,54,重组DNA技术,4、筛选,55,重组DNA技术,6、表达,表达产物分离纯化,57,重组DNA技术,五、重组体在宿主细胞中的表达和调控,基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。,克隆基因表达有三个条件,基因的编码区不能被插入序列中断;基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主 细胞的RNA聚合酶有效地识别;mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外 源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。,58,重组DNA技术,第四节 重组技术在医学和制药工业中的应用,一、疾病基因的发现,1990年,美国科学家率先启动,人类基因组计划（HGP），,计划历时15年，至2005年完成；,2001年2月12日,由Since和Nature杂志同时向世界宣布，人类基因组3X10,9,bp的最新图谱，约含3,4万个基因；,整个人类基因组的全部核苷酸序列不久即将完成。,但要揭示人类4万个基因功能的任务将更为艰巨。,59,重组DNA技术,人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因的定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人类疾病相关基因提供了参照模板。,如已知人类遗传性疾病约有3000种，推测可能是由于某些基因结构异常或基因位移等突变所致。如果,利用分子生物学技术，将患者疾病基因与正常基因图谱作对照分析,，必将有助于阐明遗传病的分子机制，这对遗传病的基因治疗将起到不可估量的推动作用。,60,重组DNA技术,产品名称,治疗功能与医药范围,1.,人胰岛素,治疗糖尿病,2.人生长激素,治疗侏儒症，加速创口愈合,3.干扰素,治疗癌症、病毒感染,4.干扰素,治疗带状疱疹，眼结、角膜炎,5.干扰素,治疗癌症、病毒感染,6.人组织纤溶酶原激活因子(tPA),溶解血栓，治疗急性心肌梗塞,7.红细胞生成素(Epo),治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素水平,8.超氧化物歧化酶,清除超氧化物，治疗关节炎，缓解心肌坏死,9.凝血因子,治疗A型血友病,10.乙型肝炎疫苗,防治肝炎,11.神经生长因子,维持神经元细胞存活、生长和分化,12.脑啡肤,镇痛,13.降钙素,治疗骨质疏松症,二、生产蛋白质和多肽类活性物质,61,重组DNA技术,基因工程生产胰岛素的原理（示意图）,62,重组DNA技术,三、制备基因工程疫苗,基因工程疫苗可以帮助解决传统技术难以解决的,一些特殊的病原体疫苗。,如,，,（1）乙型肝炎病毒疫苗（HBV）、丙型肝炎病毒疫,苗（HCV）等；,（2）有诱发致癌或产生免疫病理作用的疫苗，如人,T细胞免疫缺陷病毒（HITV-1）等；,（3）常规效果较差的疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等,（4）制备一些多价疫苗等。,63,重组DNA技术,四、改良物种特性,64,重组DNA技术,动物药厂,通过转基因动物生产感兴趣的基因,把YFG放在乳球蛋白的启动子下,注入羊卵细胞植入借腹怀孕的母羊体内,YFG在乳腺中表达,乳汁中提纯YFG蛋白。,65,重组DNA技术,1.分离体细胞,（先处于“饥饿”的“静止状态”）使“关闭”的基因全部“打开”。,2.植入去核的卵细胞中胚胎细胞,3.将胚胎细胞植入寄养母体内。,五、动物克隆,66,重组DNA技术,六、其他应用,（略）,67,重组DNA技术,基因重组和基因工程（课堂练习）,基因工程中常用的限制性内切酶是,A.,型限制酶,B.,型限制酶,型限制酶,D.,核酸内切酶,核酸外切酶,催化,DNA,缺口平移反应的酶是,末端转移酶,B.DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,D.DNA,聚合酶,Taq,DNA,聚合酶,68,重组DNA技术,Klenow,片断具有下列酶活性,A.,5,3,外切酶和,53,聚合酶活性,53,和,3,5,外切酶活性,C.,53,聚合酶 和,35,外切酶活性,53,和,35,聚合酶活性,E.53,外切酶和,35,聚合酶活性,碱性磷酸酶的作用是,A.,使核酸片段,3,端加上磷酸基,B.,去除核酸片段的,3,端磷酸基,去除核酸片段的,5,端磷酸基,D.,使核酸片段的,5,端加上磷酸基,E.,使核酸链水解断裂,69,重组DNA技术,下列是关于基因克隆常用载体的叙述，正确的是,在连接酶作用下，载体可与目的,DNA,连接构成重组体,载体是将目的,DNA,引入宿主细胞的运载蛋白,载体是将目的,DNA,引入宿主细胞的,DNA,分子,常用的载体有质粒、噬菌体和病毒等,载体可将目的,DNA,运载入宿主细胞内而本身不进入细胞,DNA,重组应包括下列过程,分离并获得目的基因和载体,B.,连接目的基因和载体构成重组体,将重组体导入宿主细胞内,从转化菌落中筛选并鉴定含阳性重组体的菌落,E.,以上都包括,70,重组DNA技术,目的,DNA,可来自,直接从组织中提取,B.,基因文库,cDNA,文库,D.PCR,扩增,E.DNA,合成仪合成,目的,DNA,与载体的连接方法可有,粘性末端连接,B.,平头末端连接,同源多聚尾连接,D.,人工接头法,E.,载体分子的自身环化连接,71,重组DNA技术,