生物碱分析.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物碱（alkaloid）是一类含氮的碱性天然有机物，大多具有复杂的环状结构，氮原子多在环内，具光学活性，有显著的生理作用，是中药中重要的有效成分。,50,多科，,120,属以上植物中有生物碱存在。,分布广泛，以双子叶植物最多，其次是单子叶植物、裸子植物。,以罂粟科、豆科、防己科、毛茛科、夹竹桃科、茄科、石蒜科等科的植物中分布较多。,含生物碱的中药很多，如三尖杉、麻黄、黄连、乌头、延胡索、粉防己、颠茄、洋金花、萝芙木、贝母、槟榔、百部、苦参、马钱子等。,生物碱的种类很多，按其结构大致可分为十二类，但具有重要生理活性的大多集中在异喹啉、吲哚、莨菪烷等衍生物类,生物碱类型,序号 类型 植物药举例,1 吡咯啶衍生物类 古豆、狗舌草,2 吡啶衍生物类 毒芹、一叶萩、烟草,3 喹啉衍生物类 金鸡纳,4,异喹啉衍生物类,黄连、罂粟、吐根、锡生藤、,延胡索、防已、石蒜,5,吲哚衍生物类,番木鳖、毒扁豆、麦角、萝芙木,6 咪唑衍生物类 毛果芸香,7 喹唑酮衍生物类 常山,8 嘌呤衍生物类 茶叶,9 甾体生物碱类 澳洲茄,10,莨菪烷衍生物类,古柯、颠茄、洋金花、,11 无环生物碱类 麻黄,12 其它 乌头、秋水仙,4溶解度,游离生物碱极性较小，不溶或难溶于水，能溶于乙醇、氯仿、丙酮、乙醚等有机溶剂中。,生物碱的盐类极性较大，大多易溶于水及醇，不溶或难溶于苯、氯仿、乙醚等。,生物碱和其盐类的性质在这一点是相反的。这种性质可以用于生物碱的提取、分离与精制。,但要注意的是，季胺碱、酰胺型碱和一些含极性基因较多的游离生物碱则能溶于水。,5沉淀反应,生物碱在酸性水溶液或酸性稀醇（,50%,）中能与生物碱沉淀试剂生成难溶性沉淀,沉淀反应的阳性结果，往往并不可靠，但阴性反应，却可以证实其不含生物碱。检查时常需用,3,种以上灵敏的沉淀试剂对照观察。,生物碱沉淀一般都是试剂分子的阴离子，与生物碱阳离子形成难溶络盐而产生沉淀。常用的生物碱试剂有：碘-碘化钾（Wagner试剂）、碘化铋钾（Dragendorff试剂）、碘化汞钾（Mayer试剂）、硅钨酸（Bertrand试剂）等,一影响薄层色谱分析的主要因素,薄层色谱的优势：,同板多样品同时检测；分析时间短；固定相（吸附剂）价廉；样品杂质污染小；色谱直观性强,薄层色谱的特点：,1.“敞开的色谱系统”,2.横向的离线多步骤,（一）样品的预处理及供试液的制备,中药成分复杂，供试液中杂质多。为了得到较清晰的色谱，样品提取物需经预处理，使供试液得以净化，往往是薄层定性分析一个重要的有时甚至是关键的步骤。,制备样品供试液所用的溶剂一般要求溶解度不宜太大，粘度不宜太高，沸点适中，而对中药材的相关成分尽可能多的提出。,常用乙醇、甲醇提取，杂质带出多，需净化。,样品供试液的精制方法：,1单一溶剂萃取法,2分段萃取法,3液液萃取法,4固液萃取法,（二）薄层色谱的上样技术,不良的上样是最主要的误差来源之一,1原点位置对样品容积的负荷量是极为有限的,2上样环行色谱效应,3供试液的溶剂在原点的残留,4上样装置对薄层表面的机械损伤对色谱质量的影响,（三）吸附剂的活性与相对湿度 对薄层色谱的影响,1吸附剂的活性：是由表面能和表面积决定的。,(1)硅胶 硅醇基 与化合物形成氢键,(2)薄层板活化目的：水合硅醇基 游离硅醇基,(3)在不同的相对湿度下，可达到不同程度的吸附平衡,(4)薄层色谱的重现性差，薄层板在不同的相对湿度下操作是主要原因之一,2相对湿度的控制方法：展开缸中放入适当浓度的硫酸,控制相对湿度表,_,相对湿度(%)所需硫酸浓度 硫酸（ml）+水（ml）,_,32 68 100,42 57 100,58 39.5 100,65 34 100,72 27.5 100,88 10.8 100,_,（四）溶剂蒸气在薄层色谱中的作用：“饱和问题”,薄层色谱与柱色谱的区别之一就是溶剂的蒸气相在展开缸中也参与色谱的展开而形成三维的层析过程。展开缸的空间气体在薄层层析过程中起着重要的作用。,在常规薄层色谱分析中，层析过程是很复杂的，特别是使用多元又能形成两相的展开剂时，即有吸附行为也有分配行为。这时，对薄层色谱的层析过程和结果有很大的影响。,（五）关于薄层色谱的优化及溶剂系统 的选择,1依靠薄层色谱分离混合物物质需要解决的主要问题有两个：,（1）相邻物质对的分离,解决相邻物质对的分离，主要按两个相邻物质的理化性质，考虑选用正相还是反相薄层板，再考虑选用单一组成的展开剂还是混合溶剂作展开剂，以及极性大小、酸碱性等，甚至要考虑选用什么展开技术。,（2）在一个宽极性范围内的多组分混合物的分离,可采用梯度展开技术，或用高效TLC或其它先进技术等。,但就目前药典收载品种而言，所采用的展开技术还是局限于常规的薄层展开技术，在其它方面没有太多选择的前提下，溶剂系统，即展开剂的优选就成了主要需要解决的问题。,2展开剂的选择和优化,主要考虑两个方面：,（1）溶剂的极性：要求使欲分离的主要物质能在Rf值0.3 0.7之间,（2）溶剂的选择性：要求达到最佳分离度,关于溶剂的优化，有单纯优选法、溶剂强度法、三角形法、均匀设计法等等；但由于中药成分复杂，展开时影响因素多，各种优选方法难以将这些复杂因素都考虑在内，所以，展开剂在选择项的优选方面几乎还是依靠实验经验。,（六）温度对薄层色谱的影响,温度也是影响层析行为的因素之一。,最直观的影响是被分离物质的,R,f,值和物质的相互分离度以及斑点的扩散等，在温差较大的不同地点或时间，其它条件相同展开同样的样品，所得色谱可能会有差异。,（七）影响薄层色谱的其它因素,二生物碱样品液制备,（一）与天然药物化学提取、分离、定性的不同点,（,1,）所用中药材的量不同，中药质量分析所用的样品量较少，一般小于,1g,。,（,2,）提取的原则不同，中药分析是保证待测组分的最大回收，因此不适用于样品的放大提取和工厂规模提取。,（,3,）分离的目的不同，中药分析分离的目的是净化待测组分，排除干扰测定的物质以保障含量测定结果的准确性。,（,4,）定性的目的也不同，中药分析是利用物理化学方法和被测物质（中药材、中药制剂有效成分等）的性质进行定性鉴别。,（二）生物碱提取,1提取溶剂,（1）非极性溶剂,（2）极性溶剂,（3）混合溶剂,2提取方法：,冷浸、渗漉、超声波、索氏提取、热回流提取,（三）生物碱样品的精制,1萃取法,2色谱法,3离子对法,三生物碱薄层色谱的定性分析,1展开剂 2吸附剂 3显色剂,4.对照品定性分析,（化学对照品、对照药材、阴性对照）,5以Rf值为基准定性分析,（边缘效应及其它影响因素）,6薄层扫描定性分析,（薄层指纹图谱）,四生物碱薄层色谱的定量分析,(一)薄层色谱-分光光度法,1.斑点定位：不加显色剂显色；使用显色剂（可挥去；有显色反应）,2.洗脱：溶剂的选择,3.测定：薄层取样量一般为几微克-几十微克，常用测定方法为UV或可见分光度法。,注意事项：空白对照；回收率的检测,分析实例,防己中粉防己碱含量测定,取防己粉末约,1g,，于,80,干燥,4h,，精密称定，置索氏提取器中，加浓氨试液,6,滴，放置,1h,，加氯仿适量，加热回流约,6h,，提取液回收氯仿后，放冷，残渣用无水乙醇分次溶解并全部移至,2ml,量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，静置，作为供试品溶液。另取粉防已碱对照品适量，加氯仿制成每,1ml,含,2mg,的溶液，作为对照品溶液。,吸取供试品溶液,100l,，点于硅胶薄层板上使成条状，另取对照品溶液,10l,，点于供试品条斑一侧，作为对照，以氯仿,-,丙酮,-,甲醇,-,浓氨试液（,20,：,3,：,2,：,0.1,）为展开剂，展开，取出，待溶剂挥尽，立即置紫外光灯（,365nm,）下照射约数十分钟后，刮取与对照品斑点相应位置上的供试品条斑，同时刮取同一薄层板上与对照品条斑等面积的硅胶作空白，照柱色谱法，置两个相同的色谱柱（,0.7cm10cm,）,中，用甲醇,30ml,分次洗脱，洗脱液收集于蒸发皿中，蒸干，冷却，精密加,0.1mol/L,盐酸溶液,10ml,使残渣完全溶解，照分光光度法，在,280nm,波长处测定吸收度。按粉防已碱（,C,38,H,42,N,2,O,6,）的吸收系数（,E1%1cm,）为,113,计算，即得。,本品于80干燥4 h，含粉防已碱（C,38,H,42,N,2,O,6,）不得少于0.70。,(二)薄层扫描法,1.相关方法学考察,（1）工作曲线,（2）精密度考察,（3）准确度考察,（4）统计检验,2.,定量分析,（1）外标法,A.外标一点法,B.外标二点法,（2）内标法,（3）回归曲线定量法,3.实验操作对定量分析结果的影响,（1）吸附剂性能和薄层板质量的影响,（2）点样方法的影响,（3）色谱条件的影响,A.展开剂,B.显色方法,（4）测量时所用光束大小的影响,