微生物发酵产酶.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,第一节 常用的产酶微生物,一、应用微生物来开发酶的优点：,(1),微生物生长繁殖快，生活周期短。因此，用微生物来生产酶产品，生产能力（发酵）几乎可以不受限制地扩大，能够满足迅速扩张的市场需求。,(2),微生物种类繁多，它们散布于整个地球的各个角落，而且在不同的环境下生存的微生物都有其完全不同的代谢方式，能分解利用不同的底物。,(3),这一特征就为微生物酶品种的多样性提供了物质基础。,(4),特别是当基因工程介入时，动植物细胞中存在地酶，几乎都能够利用微生物细胞获得。,因此，有计划和仔细地筛选微生物菌种，通常可以获得能够生产几乎任何一种酶的适当细胞。,二、用于酶生产微生物的要求：,1,、酶的产量高；,2,、容易培养和管理；,3,、产酶稳定性好；,4,、利于分离纯化；,5,、安全可靠、无毒性。,(1),大肠埃希氏杆菌，简称为大肠杆菌，是最为著名的原核生物。,形态：短杆或长杆状，,0.5,1.01.0,3.0 um,，革兰氏阴性，运动,(,周毛,),或不运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展，光滑，闪光。,Escherich,属菌株和大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。,大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。,应用：,大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖,大肠杆菌也是最早用作,基因工程的宿主菌,工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和,制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等,三、常见产酶微生物,(2),醋酸杆菌（,Acetobacter,）,菌体从椭圆至杆状，单个、成对或成链，革兰氏阴性，运动（周毛）或不运动，不生芽孢。好气。含糖、乙醇和酵母膏的培养基上生长良好。,应用：有机酸,(,食醋等）葡萄糖异构酶,(,高果糖浆,),山梨糖,(,维,C,中间体）,(3),枯草芽孢杆菌（,Bacillus subtilis,）,直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，,革兰氏阳性，无荚膜，芽孢,0.51.51.8m,，中生或近中生。,枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、,5-,核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。,(4),根霉,(,Rhizopus,),分类学上属于藻状菌纲，毛霉目，根霉属。,根霉因有假根（,Rhizoid,）而得名（假根的功能是在培养基上固着，并吸收营养）。,分布于土壤、空气中，常见于淀粉食品上，可引起霉腐变质和水果、蔬菜的腐烂。,代表种：米根霉（,R.oryzae),黑根霉,(R.nigrican),等。,应用：根霉能产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等，是生产这些酶类的菌种。在酿酒工业上常用做糖化菌。有些根霉还能产生乳酸、延胡索酸等有机酸,。,(5),曲霉,(,Aspergillus,),分类：多数属于子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门。,分布：广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质，有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。,代表种：黑曲霉,Asp.Niger,、黄曲霉,Asp.flavus,应用：是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。,回本节,第二节、微生物酶开发的一般程序,(,一,),样品的采集,采样的目的、采样地点、采样方法及采样的数量。,微生物酶开发的一般程序,(,二,),菌种的分离,培养基的确定、培养条件的确定。,微生物酶开发的一般程序,(,三,),菌种的初筛,(1),用简单的定性反应进行初筛；,(2),在最初分离阶段就给予特殊的培养基或培养条件，进而让目的菌株得以繁殖，尽可能地把只成为目的菌的菌株或只将其最适菌株的一株纯化分离。,微生物酶开发的一般程序,(,四,),菌种的复筛,初筛之后，还要进行复筛。复筛的目的是在初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。复筛。,酶活的测定方法的建立尤其重要。,微生物酶开发的一般程序,(,五,),对复筛获得菌株的要求,(1),不是致病菌；,(2),菌株不易变易和退化；,(3),不易感染噬菌体；,(4),微生物产酶量高；,(5),酶的性质符合应用的需要，而且最好是胞外酶；,(6),产生的酶便于分离和提取，得率高；,(7),微生物培养营养要求低。,微生物酶开发的一般程序,(,六,),最佳产酶条件的初步确定,(1),培养方式的确定；,(2),最佳培养条件组合；,(3),微生物产酶的特性,(,胞内酶、胞外酶,),；,(4),微生物酶收集的时间顺序；,微生物酶开发的一般程序,(,七,),微生物产酶性能的进一步提高,(1),获得高产菌种的突变体；,微生物酶开发的一般程序,(,七,),微生物产酶性能的进一步提高,(2),利用代谢工程和代谢调节机理来提高微生物的酶产量；,微生物酶开发的一般程序,(,七,),微生物产酶性能的进一步提高,(3),运用遗传工程、基因工程的手段将原有菌株中的目的基因转移到另外一些对生产环境更适应性的微生物细胞之内，使其高效表达；,微生物酶开发的一般程序,(,八,),微生物酶的提取方法,(1),酶的粗提；,(2),酶的精制。,微生物酶开发的一般程序,(,九,),微生物产酶菌种的保藏,(1),斜面；,(2),沙土管；,(3),冷冻。,-,淀粉酶的筛选,蛋白酶产生菌的获得方法,应用含酪蛋白的培养基,第三节、发酵工艺条件及其控制,1,、培养基,2,、发酵条件及控制,3,、提高产酶的措施,Go,Go,Go,下一节,本章,目录,1,、培养基,培养基：是指人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。,分类,水分和形态,形状,用途,各种生物对营养的需求,1,、选择适宜的营养物质,2,、营养物的浓度及配比合适,3,、物理、化学条件适宜,4,、经济节约,5,、精心设计、试验比较,培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；,培养目的不同，原料的选择和配比不同；,不同阶段，培养条件也有所差异。,培养基的设计原则,五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水,培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础,任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素,构成细胞物质或代谢产物中碳架,碳源可作能源，为生命活动提供能量,常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白质及其降解物,异养微生物：糖类是最好碳源（葡萄糖最为通用）,水是微生物最基本的组成分（,）,水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）,水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动,调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）,水,碳源,选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制,构成细胞物质和代谢产物中氮元素,氮源,有机氮源,蛋白胨、酵母膏、牛肉膏,无机氮源,铵盐、硝酸盐,参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性,维持细胞结构的稳定性,调节细胞渗透压,控制细胞的氧化还原电位,常用：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钾、钠、钙、镁、铁等元素的化合物。,氮源,无机盐,需要注意合适的碳氮比,生长因子,生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。,分类：,化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和类脂成分 等四类,功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应,实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因子的的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子,实验室的常用培养基：,细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；,放线菌：高氏,1,号合成培养基培养；,酵母菌：麦芽汁培养基；,霉菌：查氏合成培养基；,例如枯草芽孢杆菌：,一般培养：肉汤培养基或,LB,培养基；,自然转化：基础培养基；,观察芽孢：生孢子培养基；,产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；,枯草杆菌,BF7658-,淀粉酶发酵培养基,：玉米粉,8%,，豆饼粉,4%,，磷酸氢二钠,0.8%,，硫酸铵,0.4%,，氯化钙,0.2%,，氯化按,0.15%,（自然,pH,）。,枯草杆菌,AS1.398,中性蛋白酶发酵培养基,：玉米粉,4%,，豆饼粉,3%,，麸皮,3.2%,糠,1%,磷酸氢二钠,0.4%,磷酸二氢钾,0.03%,（自然,pH,）。,黑曲霉糖化酶发酵培养基,：玉米粉,10%,，豆饼粉,4%,，麸皮,1%,（,pH4.4,5.0,）。,地衣芽孢杆菌,2709,碱性蛋白酶发酵培养基,：玉米粉,5.5%,豆饼,4%,磷酸氢二钠,0.4%,磷酸二氢钾,0.03%(pH 8.5),。,黑曲霉,AS 3.350,酸性蛋白酶发酵培养基,:,玉米粉,6%,豆饼粉,4%,玉米浆,0.6%,氯化钙,0.5%,氯化铵,1%,磷酸氢二钠,0.2%(pH 5.5),。,游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基,：糖蜜,2%,，豆饼粉,2%,，磷酸氢二钠,0,。,1%,，硫酸镁,0,。,05%(pH 7.2),。,桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基,：淀粉水解糖,5%,，蛋白胨,0.5%,硫酸镁,0.05%,氯化钙,0.04%,磷酸氢二钠,0.05%,磷酸二氢钾,0.05%(,自然,pH),。,黑曲霉,AS3.396,果胶酶发酵培养基,:,麸皮,5%,果胶,0.3%,硫酸铵,2%,磷酸二氢钾,0.25%,硫酸镁,0.05%,硝酸钠,0.02%,硫酸亚铁,0.001%(,自然,pH),。,枯草杆菌,AS1.398,碱性磷酸酶发酵培养基,:,葡萄糖,0.4%,乳蛋白水解物,0.1%,硫酸铵,1%,氯化钾,0.1%,氯化钙,0.1mmol/L,氯化镁,1.0mmol/L,磷酸氢二钠,20mol/L(,用,pH7.4,的,Tris-HCl,缓冲液配制,),回本节,2,、发酵条件及控制,培养基的,pH,必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。为了维持培养基,pH,的相对恒定，通常在培养基中加入,pH,缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。,通常培养条件：,细菌与放线菌：,pH6.58.0,酵母菌和霉菌：,pH46,范围内生长,pH,值的控制,细胞发酵产酶的最适,pH,值与生长最适,pH,值往往有所不同。细胞生产某种酶的最适,pH,值通常接近于该酶催化反应的最适,pH,值。,有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的,pH,值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。,一般工艺流程,P46,pH,对微生物生长繁殖和代谢产物形成影响的主要原因：,1,、影响原生质膜的性质,2,、影响酶的活性,3,、影响营养物质和中间代谢产物的解离,二、影响,pH,值变化的因素,1,、基质代谢,（,1,）糖代谢 特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使,pH,下降。糖缺乏，,pH,上升，是补料的标志之一,（,2,）氮代谢 当氨基酸中的,-NH2,被利用后,pH,会下降；尿素被分解成,NH3,，,pH,上升，,NH3,利用后,pH,下降，当碳源不足时氮源当碳源利用,pH,上升。,（,3,）生理酸碱性物质利用后,pH,会上升或下降,2,、产物形成,某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液,pH,变化。如有机酸类产生使,pH,下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使,pH,上升。,3,、菌体自溶，,pH,上升，发酵后期，,pH,上升。,三、发酵过程,pH,值的调节及控制,1,、调整培养基的组分,2,、在发酵过程中进行控制,添加,CaCO,3,：,氨水流加法,尿素流加法,3,、通过补料调,pH,4,、当补料与调,pH,发生矛盾时，加酸碱调,pH,例：配制不同初始,pH,的培养基，摇瓶考察发酵情况,pH,对产海藻酸裂解酶的影响,例子：不同调,pH,方法的影响,分别在,4,种缓冲介质中，于,pH 6,50,一,9,50,测定天冬酰胺酶酶活力,1,甘氨酸介质,pH 8.00,时酶活力最高；,2,硼酸在,pH 8.50,，酶反应最快,3,磷酸在,pH 8.50,，酶反应最快,4 Tris,在,pH 8.50,，酶反应最快,酶活,1,2,4,3,不同,pH,控制方式对目的突变株,ISw330,异亮氨酸摇瓶发酵的影响，结果如图所示。,“,1,”,表示只加,CaC0,3,控制,pH,值，,“,2,”,表示只加尿素控制，,“,3,”,表示,CaC0,3,和尿素联合控制,pH,值。,异亮氨酸发酵,不同,pH,值对菌体的形态影响很大，当,pH,值高于,7,5,时，菌体易于老化，呈现球状；当,pH,值低于,6,5,时菌体同样受抑制，易于老化。而在,7,2,左右时，菌体是处于产酸期，呈现长的椭圆形；在,6,9,左右时，菌体处于生长期，呈,“,八,”,字形状并占有绝对的优势。,pH6,9,时，菌体生长旺盛，,pH7.15,时，对菌体的产酸有利。因此，在发酵的产酸期产酸较高。采用阶段,pH,控制模式进行发酵，在发酵中前期控制,pH6.9,，到,48h,后,pH,值为,7.15,，到,80h,后,pH,值为,7.25,。产率,22.27g,/L,，产酸率提高,12.23,。,通常在生物学范围内每升高,10,，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。,温度的控制,有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的,mRNA,的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。,枯草杆菌的最适生长温度为,34,37,黑曲霉的最适生长温度为,28,32,溶解氧的控制,溶解氧是指溶解在培养基中的氧气。,在酶的发酵生产过程中，处于不同生长阶段的细胞，其细胞浓度和细胞呼吸强度各不相同，致使耗氧速率有很大的差别。因此必须根据耗氧量的不同，不断供给适量的溶解氧。,培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解速度。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。一般说来，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养液的性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影响。,调节通气量,调节氧的分压,调节气液接触时间,调节气液接触面积,改变培养液的性质,控制溶解氧方法,回本节,3,、提高酶产量的措施,1,、添加诱导物,对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖诱导,-,半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。,诱导物一般可以分为,3,类（诱导物定义）,酶的作用底物,酶的催化反应产物,作用底物的类似物,2,、控制阻遏物的浓度,阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。,1.,产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。,2.,分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用,。,控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。,为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当,控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度,。,采用其他较难利用的碳源，如淀粉等,采用补料、分次流加碳源,添加一定量的环腺苷酸（,cAMP,）,对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过,控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除,。,3,、添加表面活性剂,表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。,将适量的,非离子型表面活性剂,，如,吐温（,Tween,）,、,特里顿,(Triton),等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。,由于,离子型表面活性剂对细胞有毒害作用,，尤其是季胺型表面活性剂（如,新洁而灭,等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。,回本节,4,、添加产酶促进剂,产酶促进剂是指,可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质,。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高,1,20,倍；添加聚乙烯醇（,Polyvinyl alcohol,）可以提高糖化酶的产量。产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，,要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度,。,怎样优化培养基？,培养基优化是工业发酵永恒不变的主题。！,补充知识：,试验设计,在工业化发酵生产中，发酵培养基的设计是十分重要的，因为培养基的成分对产物浓度、菌体生长都有重要的影响。实验设计方法发展至今可供人们根据实验需要来选择的余地也很大。,单因素法（,One at a time,）,正交实验设计（,Orthogonal design,）,均匀设计,(Uniform design),全因子实验设计,(Full factorial design),部分因子设计,(fractional factorial design),Plackett-Burman,设计（,Plackett-Burman design,）,中心组合设计（,Central composite design,）,BoxBehnken,设计,(,BoxBehnken,design),最优化技术（实验统计）,响应曲面分析法,改进单纯形优化法,(Modified simplex method),遗传算法,(Genetic algorithm,，,GA),第三节、酶发酵动力学,1,、酶生物合成的模式,2,、酶生产过程中细胞生长动力学,3,、酶生产过程中产酶动力学,Go,Go,Go,本章,目录,一、研究内容及意义,内容：发酵过程中细胞生长速度、产物生成速度、基质消耗速度以及环境因素对这些速度的影响等。,意义：在酶的发酵生产过程中，研究细胞生长动力学和发酵产酶动力学，对于了解酶的生物合成模式，发酵工艺条件的优化控制，提高酶的产率等方面均具有重要意义。,前题：如何测定细胞量？,1,、计数法,浊度计比浊法,测定稀的细胞悬液的透光量，间接测出细胞,数量的生长。,计数器计数法,在显微镜下用血球计数器直接数出酵母菌或,霉菌孢子数目，以及用细菌计数片直接测出,细菌数的生长。,2,、,测定细胞重量,细胞干重称量法,直接测定单位体积培养物的细胞干重，由此代表菌体细胞物质总量。,细胞堆积容积测量法,（离心压缩细胞体积法）,用刻度锥形管测量经离心的细胞沉淀物的容积，由此间接表示细胞重量。,细胞组成分析法,测定一种大分子的细胞组成,(,如蛋白质、,RNA,、,DNA,等,),，间接算出细胞的重量。,营养物消耗分析法,测定培养基中不用于合成代谢产物的营,养物（磷酸盐、硫酸盐等）的消耗，由此间接表示生长的细胞重量。,产物重量分析法,测定培养中间形成的二氧化碳，氢，,ATP,等产物，由此间接换算出生长的细胞重量。,二、酶生物合成的模式,细胞在一定条件下培养生长，其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等,4,个阶段,通过分析比较细胞生长与酶产生的关系,可以把酶生物合成的模式分为,4,种类型。即,同步合成型,，,延续合成型,，,中期合成型,和,滞后合成型。,同步合成型,酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的生物合成速度与细胞生长速度紧密联系，又称为,生长偶联型,。,属于该合成型的酶，其生物合成伴随着细胞的生长而开始；在细胞进入旺盛生长期时，酶大量生成；当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随着停止。,大部分组成酶的生物合成属于同步合成型，有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成。,例如米曲霉在含有单宁或者没食子酸的培养基中生长，在单宁或没食子酸的诱导作用下，合成单宁酶（,tanase EC3.1.1.20,）。,细胞,浓度,mg/ml,酶,浓度,U/ml,总细胞浓度 活细胞浓度,胞外酶浓度 胞内酶浓度,延续合成型,酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。,属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。例如，在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源的培养基中培养，可以诱导聚半乳糖醛酸酶（,Polygalacturonase,，,EC3.2.1.15,）的生物合成。,细胞,浓度,mg/ml,酶,浓度,U/ml,细胞,浓度,mg/ml,酶,浓度,U/ml,以半乳糖醛酸为诱导物,以含有葡萄糖的果胶为诱导物,中期合成型,该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止,。,细胞,浓度,mg/ml,酶,浓度,U/ml,例如，枯草杆菌碱性磷酸酶（,Alkaline phophatase,，,EC 3.1.3.1),的生物合成模式属于中期合成型。这是由于该酶的合成受到其反应产物无机磷酸的反馈阻遏，而磷又是细胞生长所必不可缺的营养物质，培养基中必须有磷的存在。这样，在细胞生长的开始阶段,培养基中的磷阻遏碱性磷酸酶的合成，只有当细胞生长一段时间，培养基中的磷几乎被细胞用完（低于,0.01mmol/L,）以后，该酶才开始大量生成。又由于碱性磷酸酶所对应的,mRNA,不稳定，其寿命只有,30 min,左右，所以当细胞进入平衡期后，酶的生物合成随着停止。,滞后合成型,此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累。又称为,非生长偶联型,。,许多水解酶的生物合成都属于这一类型。,属于滞后合成型的酶，之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成，主要原因是,由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。,若培养基中不存在阻遏物，该酶的合成可以转为延续合成型。该类型酶所对应的,mRNA,稳定性很好，可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。,黑曲霉羧基蛋白酶生物合成,放线菌素,D,对产酶的影响,细胞,浓度,mg/ml,酶,浓度,U/ml,酶,浓度,U/ml,酶,浓度,U/ml,30,22,不加,加入,不加,加入,理想的酶合成模式,酶所对应的,mRNA,的稳定性以及培养基中阻遏物的存在是影响酶生物合成模式的主要因素。,其中，,mRNA,稳定性好的，可以在细胞生长进入平衡期以后，继续合成其所对应的酶；,mRNA,稳定性差的，就随着细胞生长进入平衡期而停止酶的生物合成；不受培养基中存在的某些物质阻遏的，可以伴随着细胞生长而开始酶的合成；受到培养基中某些物质阻遏的，则要在细胞生长一段时间甚至在平衡期后，酶才开始合成并大量积累。,回本节,在酶的发酵生产中，为了提高产酶率和缩短发酵周期，,最理想的合成模式应是延续合成型,。因为属于延续合成型的酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期以后，酶还可以继续合成一段较长的时间。,对于,其他合成模式的酶，可以通过基因工程,细胞工程等先进技术,选育得到优良的菌株,并通过工艺条件的优化控制,使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型,。,其中对于同步合成型的酶，要尽量提高其对应的,mRNA,的稳定性，为此适当降低发酵温度是可取的措施；,对于滞后合成型的酶，要设法降低培养基中阻遏物的浓度，尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶的生物合成提早开始；,而对于中期合成型的酶，则要在提高,mRNA,的稳定性以及解除阻遏两方面下功夫，使其生物合成的开始时间提前，并尽量延迟其生物合成停止的时间。,三、酶生产过程中细胞生长动力学,细胞在控制一定条件的培养基中生长的过程中,其生长速度受到细胞内外各种因素的影响,变化比较复杂，情况各不相同。,细胞生长动力学主要研究细胞生长速度以及外界环境因素对细胞生长速度影响的规律。,1950,年，,法国的莫诺德,(Monod),首先提出了表述微生物细胞生长的动力学方程,。,在培养过程中，细胞生长速率与细胞浓度成正比,假设培养基中只有一种限制性基质，而不存在其他生长限制因素时，,为这种限制性基质浓度的函数。,K,S,为莫诺德常数，是指比生长速率达到最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。,无抑制的细胞生长动力学,Monod,方程,现代细胞生长动力学的奠基人,Monod,在,1942,年便指出，在培养基中无抑制剂存在的情况下，细胞的比生长速率与限制性基质浓度的关系可用下式表示：,该方程中 为比生长速率,(s,-1,),；为最大比生长速率,(s,-1,，,min,-1,，,h,-1,),，,S,为限制性基质浓度,(g/L),；,Ks,为饱和常数,(g/L),，其值等于比生长速率为最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。,Monod,方程是典型的均衡生长模型，其基本假设如下：,细胞的生长为均衡式生长，因此描述细胞生长的唯一变量是细胞的浓度；,培养基中只有一种基质是生长限制性基质，而其它组分为过量不影响细胞的生长；,细胞的生长视为简单的单一反应，细胞得率为一常数。,细胞的比生长速率与限制性基质浓度的关系,S,当限制性基质浓度很低时，,S,Ks,时，,=m,，若继续提高基质浓度，细胞生长速率基本不变。此时细胞的比生长速率与基质浓度无关，为零级动力学特点。,将,Monod,方程式变为,为直线方程。,不同的菌种，不同的培养基，,Ks,和 是,不同的。,Monod,方程虽然表述简单，但它不足以完整地说明复杂的生化反应过程，并且已发现它在某些情况下与实验结果不符，因此人们又提出了另外一些方程。,单基质限制的细胞生长动力学模型,四、产酶动力学,产酶动力学主要研究,细胞产酶速率以及各种环境因素对产酶速率的影响规律,。,产酶动力学的研究可以从整个发酵系统着眼，研究群体细胞的产酶速率及其影响因素，这称为宏观产酶动力学或这称为,非结构动力学,。,也可以从细胞内部着眼，研究细胞中酶合成速率及其影响因素，这谓之,微观产酶动力学,或称为,结构动力学,。,在酶的发酵生产中，酶的产量高低，是发酵系统中群体细胞产酶的集中体现，宏观产酶动力学的研究表明，产酶速率与细胞比生长速率、细胞浓度以及细胞产酶模式有关,一般产酶动力学方程可表达为：,式中,X,细胞浓度,(g/L),细胞比生长速率,(h,-1,),生长偶联的比产酶系数,(IU/g),非生长偶联的比产酶速率,(IU/(g,h),E,酶浓度,(IU/L),t,时间,(h),生长偶联型,部分生长偶联型,非生长偶联型,第四节、固定化微生物细胞发酵产酶,固定化细胞发酵产酶的特点；,固定化细胞发酵产酶的工艺条件及其控制；,固定化细胞产酶的应用；,一、固定化细胞发酵产酶的特点,1.,提高产酶率,细胞经过固定化以后，在一定的空间范围内生长繁殖，细胞密度增大，因而使生化反应加速，从而提高酶产率。,2.,可以反复使用或连续使用较长时间,固定化细胞固定在载体上，不容易脱落流失，所以固定化细胞可以进行半连续发酵，反复使用多次。,3.,基因工程菌的质粒稳定，不易丢失,由于有载体的保护作用，固定化基因工程菌质粒的结构稳定性和分裂稳定性都显著提高。,4.,发酵稳定性好,细胞经过固定化以后，由于受到载体的保护作用，使细胞对温度、,pH,值的适应范围增宽；对蛋白酶和酶抑制剂等的耐受能力增强，所以能够比较稳定的进行发酵生产。,5.,缩短发酵周期，提高设备利用率,固定化细胞经过预培养、生长好以后，才转入发酵培养基进行发酵产酶，而且能够维持一段较长时间，因此可以缩短发酵周期，提高设备利用率。,6.,产品容易分离,固定化细胞不溶于水，发酵完成以后，容易与发酵液分离，而且发酵液中所含的游离细胞很少，有利于产品的分离提纯。,7.,适用于胞外酶等细胞外产物的生产,二,.,固定化细胞发酵产酶的工艺条件及控制,固定化细胞的预培养,固定化细胞制备好以后，一般要进行预培养，以利于固定在载体上的细胞生长繁殖。,溶解氧的供给,加大通气量；改变固定化的载体；改变培养基组分；,温度的控制,培养基组分的控制,壳聚糖酶产生菌的筛选及固定化细胞产酶,第五节,固定化微生物原生质体发酵产酶,1.,定义,固定在载体上，在一定空间范围内进行生命活动的原生质体。,问题：如何制备原生质体？,一、固定化原生质体的特点,1,、变胞内产物为胞外产物,由于解除了细胞壁的扩散障碍，可以使原本存在于细胞中的胞内酶不断分泌到细胞外。变革了胞内酶的生产工艺。,2,、提高酶产率,由于除去了细胞壁，增加了细胞的通透性，有利于氧气和其它营养物质的传递和吸收，也有利于胞内物质的分泌，可以显著提高产酶率。,3,、稳定性较好,固定化原生质体由于载体的保护作用，具有较好的操作稳定性和保存稳定性，可以反复使用或者连续使用较长时间，利于连续化生产。,4,、易于分离纯化,固定化原生质体易于和发酵液分开，有利于产物的分离纯化，提高产品的质量。,二、固定化原生质体发酵产酶的工艺条件及其控制,渗透压的控制；,防治细胞壁再生；,保证原生质体的浓度,第二章 动植物细胞培养产酶,与微生物细胞相比，动物细胞和植物细胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培养工艺。,植物、动物、微生物细胞的特性比较,细胞种类,植物细胞,微生物细胞,动物细胞,细胞大小,/um,200,300,1,10,10,100,倍增时间,/h,12,0.3-6,15,营养要求,简单,简单,复杂,光照要求,大多数要求,不要求,不要求,对剪切力,敏感,大多数不敏感,非常敏感,主要产物,色素、药物、香精、酶等,醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等,疫苗、激素、单克隆抗体、酶等,三者之间的差异主要有：,植物细胞,动物细胞,微生物细胞。,动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。,植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。,植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。,植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。,植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。,一、植物细胞培养产酶,过程,1,、植物外植体中诱导获得植物细胞；,2,、筛选、诱变、原生质体融合或基因重组等手段选育得到优良的产酶细胞；,3,、人工控制条件的反应器中进行细胞培养产酶；,特点,1,、产率高；,2,、周期短；,3,、产品质量高；,紫杉醇：二萜类化合物,最早由太平洋红豆杉,Taxus,brevifolia,的树皮中分离,广泛用于治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等十几种癌症,目前主要来源于红豆杉属植物,实例：利用植物细胞培养技术生产紫杉醇,市场需求,抗癌一线用药,销售额年增长率,5,亿美元,理论需求量,2g/,人,500,万人,/,年,1000kg/,年,实际销量,350 kg/,年,紫杉醇供需相差十分悬殊,图,1,：国际紫杉醇原料药需求走势图（单位：公斤）,图,2,：国际紫杉醇销售额（亿美元）,理化性质,英文名：,Paclitaxel,Taxol,or TM,分子式：,C,47,H,51,NO,4,水溶性：,0.7mg,ml,稳定性：,pH4,8,稳定；,pH 8,易分解；,在特定条件下紫杉醇可被氧化，但极难还原；,药源问题,红豆杉,主要原料植物,国家一级保护野生植物，全球十大濒危物种 之一,生长缓慢 分布有限,Taxol,含量低,树皮中,Taxol,含量,:0.00001-0.069%,3000,棵树,=10,吨树皮,=1kg,Taxol,=500,病人,人工栽培,采用种子繁殖、扦插等无性繁殖方法快速、大面积人工繁育红豆杉幼苗,寻找红豆衫的替代物,从红豆杉非树皮部位提取,产紫杉醇的非红豆杉植物,优点：生长周期缩短,简便、直接,缺点：,1,、紫杉醇含量低,生长缓慢,2,、提取工艺复杂,药源问题解决办法（一）,药源问题解决办法（二）,化学合成,全合成,1994,年获得成功,现有六种途径,半合成,以,10-DAB,和,Baccatin,作为半合成原料获得紫杉醇,新方法用,10-DAT,缺点：,1,、合成过程烦琐复杂，几十步,2,、费用高，化学试剂昂贵,3,、总收率太低（,2%,）,优点：,1,、原料枝叶含量丰富、提取相,对容易，充分利用再生资源,2,、产率高,3,、最具实用价值可以工业化生产,4,、获取紫杉醇构效关系信息，进行结构改造,缺点：合成过程相对复杂,（,11,步化学转化和,7,步分离）,药源问题解决办法（三）,生物方法,组织和细胞培养,微生物发酵,生物合成,研究阶段,红豆杉生物合成途径基本明确,10,种相关酶基因被克隆表达,利用基因工程手段改造红豆杉提高紫杉醇产量,优点：,1,、摆脱自然因素，可长期稳定,生长,2,、适应市场、方便调节,3,、成分简单，有利于分离纯化,4,、成本低、生长周期短,5,、为半合成提供原料,6,、有望工业化生产,缺点：,1,、产量低、不稳定,2,、工业化放大研究,植物来源药物的特点,全世界有,40%,的药物来源于植物。我国是中草药资源最丰富的国家，有详细记载的近,5000,种。中草药治疗疾病的历史上千年，中医药已形成完整的科学体系。对于植物药效成分的研究已形成“天然药物化学”研究的新领域。,药用植物中具有药物功能的物质种类繁多，结构复杂。除小分子的天然有机化合物以外，还有多种生物大分子活性物质。,对不同组方的药用成分和功能的研究是一项巨大的工程，相当于基因组和蛋白质组工程。中药复方复杂系统研究（北京大学韩启德院士）,3,、存在问题,植物细胞培养时，其生长速度较慢，通常完成一次生产周期需,45,周才能完成；而微生物的工业发酵只需几天就可完成发酵全过程。,植物细胞培养生产次生代谢物的总量一般比植物本身低，这主要是由于大多数离体培养细胞不能合成和积累所期望的化合物，当然也有些细胞株系产量高，这与微生物大不相同。,生产技术上还存在一些问题。培养过程需要复杂的培养基及附加物，且易受细菌、真菌的污染；次生物的产量不甚稳定，成本较高等。,4,、植物细胞培养的工艺条件及其控制,1,、温度的控制；,2,、,pH,值的控制；,3,、溶解氧的调节和控制；,4,、光照的控制；,5,、前体的添加；,6,、刺激剂的应用；,