角化细胞培养研究进展.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,提纲,KC,来源及分化过程,KC,的作用,KC,培养方法,滋养层细胞培养,无滋养层细胞培养,影响,KC,培养的的因素,霍乱毒素,(CT),、表皮生长因子,(EGF),和钙离子,(Ca,2+),一、,KC,来源及分化过程,KC,来源及分化过程,皮肤主要由,表皮,和,真皮,组成，中间由基底膜隔开；,表皮由上至下分别为,角质层,、,颗粒层,、,棘层,和,基底层,；,KC,主要来源于基底层,。,1.,皮肤结构和,KC,来源,KC,的抗菌作用,1.KC,通过,PRR,识别病原体,Kollisch,等,(2005),用,RT-PCR,方法发现,KC,可表达不同的,TLR,亚型。,PGN,、,poly(I:C),和,flagelli,可分别与,KC,的,TLR2,、,TLR3,和,TLR5,结合，从不同程度刺激,KC,分泌,IL-8,说明,KC,可,通过,TLR,识别细菌上的病原相关分子模式,(PAMP),，分泌,IL-8,等物质清除病原体。,KC,的抗菌作用,2.KC,分泌,AMP,杀灭病原体,Glaser,等,(2005),用抗菌测试试验发现抗菌肽,S100A7,可特异性的杀死大肠杆菌。,ONG,等,(2005),研究发现,LL-37,能有效杀灭葡萄球菌。,KC,在抵抗外来微生物入侵中的另一个重要作用是产生大量的,AMP,。阳离子抗菌肽主要有,LL-37,、,防御素,和,S100,蛋白家族,(,Harder and Schroder,2005),。,三、,KC,的培养方法,KC,培养最早始于,1967,年,(Briggaman,等，,1967),，随后人们陆续培养出,鼠,(Marvin,等，,1971),、,兔,(Liu,等，,1978),和,狗,(Wilkinson,等，,1987),等的,KC,。,使用的,培养,方法包括,滋养层培养法,和,无滋养层培养法,。,滋养层细胞培养,1.,以,3T3,细胞作为滋养层,1975,年，,Rheinwald,等首次成功地在体外连续培养人正常,KC,。,他们把射线灭活的,鼠,3T3,细胞作为滋养层，将胰蛋白酶消化后的,单个,KC,接种于其上，发现,KC,能明显抑制,3T3,细胞，且自身生长良好，并将,3T3,滋养层细胞不断推至培养皿边缘,。,图中红色为,KC,，蓝色为,3T3,细胞,滋养层细胞培养,1.,以,3T3,细胞作为滋养层,Alain,等,(1986),用,3T3,滋养层培养法成功培养了人头皮毛囊,KC,。,5d,18d,滋养层细胞培养,2.,以成纤维细胞作为滋养层,Alain,等,(1989),首先介绍了用自体成纤维细胞代替,3T3,细胞作为滋养层，,成功培养了人头皮毛囊,KC,。,真皮成纤维细胞,丝裂霉素,C,或射线,有丝分裂后细胞,成纤维细胞滋养层,KC,接种,6d,3weeks,滋养层细胞培养,优点,：,细胞接种密度低、增殖速度较快、细胞生长稳定,；而且,灭活的,3T3,细胞自身无生长能力，有利于接种的,KC,生长增殖,。,弊端,：,一反面可能会造成,KC,和,3T3,细胞的混合污染，另一方面存在着将,3T3,细胞,DNA,遗传信息整合入增殖的,KC,内的危险。,无滋养层细胞培养,Wilkinson,等,(1987),率先用无滋养层方法成功分离培养了狗,KC,。,皮肤组织,分离酶,4,孵育,18h,表皮,KC,培养、传代,20,孵育,45min,特定培养基,吸管吹吸,无滋养层细胞培养,Hager,等,(1999),用无滋养层方法成功分离培养了小鼠,KC,，并将其传至,第,19,代,，但只有前,10,代细胞具有分化能力。,真皮,胶原酶,纱布过滤、离心,混合细胞,成纤维细胞,成纤维细胞条件培养基,HCM,EMEM.06,EMEM.06(1:1),KC,培养基,无滋养层细胞培养,Caldelari,等,(2000),在,Wilkinson,方法基础上成功分离培养了,17.5d,小鼠胚胎,KC,，并在传至,第,61,代,依然保持分化活性。,17.5d,小鼠胚胎皮肤,分离酶,defined keratinocyte-SFM,表皮,KC,培养、传代,剪碎,胰酶消化,defined keratinocyte-SFM,提高,Ca,2+,浓度后，,Keratin,和,E-cadherin,表达呈阳性，且浆膜外形成排列紧密的角蛋白网络，细胞间形成稳定的连接结构，说明细胞仍保持,分化,活力。,无滋养层细胞培养,有学者认为无滋养层培养的细胞缺少,分化标记物,(,中间丝蛋白、张力原纤维和桥粒,),的表达,(Prignano,等，,1999),；,小鼠,KC,在培养,30,代后会出现,非整倍型,染色体,。,四、影响,KC,培养的因素,人为因素,接种密度、传代时间,培养基,无血清培养基、,霍乱毒素,(CT),、表皮生长因子,(EGF),和钙离子,(Ca,2+),影响,KC,培养的因素,1.,霍乱毒素,(CT),CT,是分子量为,8400D,的蛋白质，由,A,和,B,两个亚基组成。,B,亚基可将腺苷酸环化酶结合到细胞表面，,A,亚基可激活腺苷酸环化酶。,Green(1978),发现,浓度为,10,-11,-10,-9,M,的,CT,均可有效促进细胞生长,。,影响,KC,培养的因素,1.,霍乱毒素,(CT),说明当细胞密度较低时，,CT,可提高,cAMP,浓度并促进细胞增殖；当细胞密度增高时，,CT,可降低,cAMP,浓度，从而抑制高密度细胞生长。,Natsuko,等,(1982),细胞密度较低时，,CT,可促进,DNA,和蛋白质合成；细胞密度增加后，,CT,抑制,DNA,和蛋白质合成,向培养基中加入浓度范围为,10,-14,-10,-8,M,的,CT,后,6h,，可成百倍的提高胞内,cAMP,浓度,。,影响,KC,培养的因素,2.,表皮生长因子,(EGF),EGF,是分子量为,6045D,的多聚肽，最先由,Cohen(1962),从鼠颌下腺中分离,，并发现其具有促进新生小鼠表皮生长和成熟的作用,。,Rheinwald,等,(1977),将,EGF,加入,KC,培养基后发现，,EGF,不仅可以促进,KC,生长，还能增加其寿命,。,影响,KC,培养的因素,2.,表皮生长因子,(EGF),Wilkinson,等,(1987),也发现,EGF,可促进狗,KC,增殖，而且,EGF,和,CT,具有协同效应,。,影响,KC,培养的因素,2.,表皮生长因子,(EGF),Miguel,等,(2001),的发现说明,EGF,主要通过提高端粒酶的活性来延缓细胞衰老,。,细胞每次,分裂,，端粒会缩短一点，,当端粒消耗完之后，细胞便会凋亡；,而,端粒酶,可阻止端粒缩短，也就是说端粒酶可延缓细胞凋亡。,影响,KC,培养的因素,3.,钙离子,(Ca,2+,),Hennings,等,(1980),发现,在低,Ca,2+,浓度,(0.09mM),中，,KC,以单层形式聚合，并形成“铺路石”样；,在高,Ca,2+,浓度,(1.14mM),中时，,KC,会向垂直方向角化并形成,4-5,层细胞，随后从培养皿上脱落，接种后,5d,，增殖细胞比例不到,60%,。,0.09mM,KC,增殖,1.14mM,KC,已分化,最先被发现生长受到钙离子影响的细胞是鼠,3T3,细胞,(Boynton,等，,1974),和人,WI-38,成纤维细胞,(Boynton,等，,1977),。作者发现，,当钙离子浓度低于,0.5mM,时，这两种细胞生长均受到抑制。,影响,KC,培养的因素,3.,钙离子,(Ca,2+,),Ca,2+,浓度小于,0.3mM,时，细胞数量增多；大于,0.3mM,时，细胞数量减少,。,Ca,2+,浓度小于,0.3mM,时，含有角化包膜细胞比例较少；大于,0.3mM,时，含有角化包膜细胞比例增多,。,说明,Ca,2+,浓度大于,0.3mM,时，,Ca,2+,会,抑制细胞增殖并,促进细胞分化。,Steven,等,(1983),影响,KC,培养的因素,3.,钙离子,(Ca,2+,),1,，,25-D,3,可通过诱导,PLC-,1,表达来促进,involucrin,和,transglutaminase,表达,1,，,25-D,3,可通过诱导,PLC-,1,表达来提升胞内,Ca,2+,浓度,。,说明,1,，,25-D,3,可通过诱导,PLC-,1,表达来提升胞内,Ca,2+,浓度，最后促进,involucrin,和,transglutaminase,表达，引起细胞分化,。,Xie,等,(2001,）,影响,KC,培养的因素,霍乱毒素,(CT),当细胞密度较低时，,CT,可提高,cAMP,浓度并促进细胞增殖；当细胞密度增高时，,CT,可降低,cAMP,浓度，从而抑制高密度细胞生长。,表皮生长因子,(EGF),EGF,主要通过提高端粒酶的活性来延缓细胞衰老。,钙离子,(Ca,2+,),1,，,25-D,3,可通过诱导,PLC-,1,表达来提升胞内,Ca,2+,浓度，最后促进,involucrin,和,transglutaminase,表达，引起细胞分化,。,敬请各位批评指正,谢谢,