分子生物学——基因工程操作技术-2课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,LOGO,*,LOGO,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,LOGO,*,第,6,章：基因工程操作技术,2,大规模生产生物活性物质,工程细胞,基因工程,蛋白质工程,途径工程,发酵工程,细胞工程,分离工程,酶,酶工程,分,离,工,程,天然细胞,天然细胞,生物活性物质,基本概念,基因工程（,genetic engineering,）,2025/9/19 周五,3,特定基因（被称为目的基因或外源,DNA,片段）的制备、分离、鉴定、改造及其在不同生物间的转移等多项技术,指所有涉及到,DNA,或者,RNA,操作的技术，或者指所有基因工程和基因工程相关技术,基因操作（,gene manipulating,）,4,指把一个生物体中的基因通过无性繁殖转入另一个生物体内的过程。通过基因克隆可以得到一群完全相同的基因片段，由于基因就是,DNA,分子，所以也称其为,DNA,克隆,克隆（,clone,）,基因克隆（,gene cloning,）,是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体,5,2025/9/19 周五,基因重组（,gene recombination,）,是将不同基因片段连接起来构成一个新的,DNA,分子的过程,自然界不同生物之间的基因重组是经常发生的,6,1,、目的基因的获取,2,、基因表达载体的构建,3,、将目的基因导入受体细胞,4,、目的基因的检测与鉴定,基因工程基本操作的四个步骤,有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用,表达载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。,才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。,8,R.oryzae,genome DNA,PCR,RoAmy,gene fragment,Eco,RI,例：米根霉,a,-,淀粉酶基因的获取,例：,RoAmy,在大肠杆菌中的表达,BL21,（,DE3,）,1,X,2,RoAmy1(0.7 U/mL),RoAmy2(0.2 U/mL),RoAmyX(0 U/mL),破碎液,IPTG,诱导,BL21,（,DE3 condonplus,）,破碎液,IPTG,诱导,RoAmy1(1.3 U/mL),RoAmy2(0.5 U/mL),RoAmyX(0 U/mL),10,6.1,目的基因的获取,供体生物细胞,取出,DNA,用限制酶剪去多余部分,目的基因,11,6.1.1,目的基因的获取方法,1,、目的基因主要是指,_,编码蛋白质的结构基因,2,、获取目的基因的常用方法,（,1,）从基因文库中获取,（,2,）利用,PCR,技术扩增,（,3,）人工合成,什么是基因文库？,什么是基因组文库？,什么是部分基因文库？,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？,目的基因的有关信息与什么相联系？,6.1.2,基因文库,概念：,基因文库,（,gene library,）,基因组文库,部分基因文库,（如,cDNA,文库）,将含有某种生物不同基因的许多,DNA,片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库,(gene library),基因组文库,:,基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库,.,部分基因文库,:,基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库,.,思考：,基因文库如何构建？,如果用某种生物发育的某个时期的,mRNA,反转录产生的,多种互补,DNA,（也叫,cDNA,）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就构成了这种生物的,cDNA,文库,。这种方法称,反转录法,cDNA,文库的构建,mRNA,反转录,cDNA,(,互补,DNA,）,DNA,聚合酶,双链,DNA,反转录法：,基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,基因组,DNA,文库,cDNA,文库,基因组,DNA,文库与,cDNA,文库的比较,如何从基因文库中得到所需要的基因？,依据：目的基因的有关信息。,如：根据,基因的核苷酸序列,基因的功能基因在染色体上的位置,基因的转录产物,mRNA,基因翻译产物蛋白质,等特性。,6.2,基因表达载体的构建过程,PgpdA,/,Eco,R I,Hygro,/,Not,I,TtrpC,/,Bam,H I,RoAmy,/,Nhe,I,Eco,R I,基因表达载体的组成,它们有什么作用？,a,、目的基因,b,、启动子,c,、终止子,d,、标记基因,位于基因的首端,是,RNA,聚合酶结合位点,位于基因的末端,终止转录,检测目的基因是否导入受体细胞,22,2025/9/19 周五,6.3,基因工程常用的工具酶,酶的种类,功 能,限制性核酸内切酶,识别特异序列，切割,DNA,DNA,连接酶,催化,DNA,中相邻的,5,磷酸基和,3,羟基末端之间形成磷酸二酯键，使,DNA,切口封合或使两个,DNA,分子或片段连接,DNA,聚合酶,I,合成双链,cDNA,的第二条键,缺口平移制作高比活探针,DNA,序列分析,填补,3,末端,反转录酶,以,RNA,为模板合成,cDNA,第一链,多聚核苷酸激酶,催化多聚核苷酸,5,羟基末端磷酸化，或标记探针,末端转移酶,在,3,羟基末端进行同质多聚物加尾,切除末端磷酸基,碱性磷酸酶,23,识别,DNA,的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链,DNA,的一类内切酶，与相伴的甲基化酶共同构成细菌防御机制,限制修饰体系（限制外源,DNA,，保护自身,DNA,）,Hin,d,流感噬血杆菌种属,d,株 第三种内切酶,限制性核酸内切酶命名：属名、种名、株名,限制性核酸内切酶（,restriction endonuclease,）,-,剪,24,2025/9/19 周五,切割,DNA,后有,粘端与平端,之分或产生,匹配末端,识别位点常为回文结构,AAT,GAATTC,GTACCG,TTA,CTTAAG,CATGGC,限制性核酸内切酶,5-N,GAATTC,N-3,3-N,CTTAAG,N-5,5-NG,AATT,CN-3,3-NC,TTAA,GN-5,粘,末,端,(,Cohensive end or sticky end,）,5,突出端,EcoR1,5-N,CAG,CTG,N-3,3-N,GTC,GAC,N-5,5-N,CAG,CTG,N-3,3-N,GTC,GAC,N-5,平末端,Pvu 2,（,blunt end,）,25,DNA,连接酶也称,DNA,黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是把两条,DNA,黏合成一条。无论是双股或是单股,DNA,的黏合，,DNA,黏合酶都可以借由形成磷酸双脂键将,DNA,在,3,端的尾端与,5,端的前端连在一起。,DNA,连接酶（,DNA ligase,）,-,缝,26,27,28,对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶与,NAD(,而不是,ATP),反应形成酶,-AMP,中间物，但不能继续将,AMP,转移到,DNA,上促进磷酸二酯键的形成。,主要功能就是在,DNA,聚合酶,催化聚合，填满双链,DNA,上的单链间隙后封闭,DNA,双链上的缺口。这在,DNA,复制、修复和重组中起着重要的作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行,DNA,复制、修复和重组。,大肠杆菌,DNA,连接酶,29,T4 DNA,连接酶是,ATP,依赖的,DNA,连接酶，催化两条,DNA,双链上相邻的,5,磷酸基和,3,羟基之间形成磷酸二酯键。可接双链,DNA,的平末端、相容粘末端及其中的单链切口。,T4 DNA,连接酶可连接,DNA-DNA,，,DNA-RNA,，,RNA-RNA,和双链,DNA,粘性末端或平头末端。另外，,NH4Cl,可以提高大肠杆菌,DNA,连接酶的催化速率，而对,T4 DNA,连接酶则无效。,无论是,T4 DNA,连接酶，还是大肠杆菌,DNA,连接酶都不能催化两条游离的,DNA,链相连接。,T4 DNA,连接酶,30,2025/9/19 周五,6.4,基因的获取和克隆,（一）目的基因的获得,1.,用,PCR,技术获取基因,2.,用,RT-PCR,（逆转录,-PCR,）获得基因,3.,从基因组文库或,cDNA,文库中获取基因,4,人工合成基因,31,6.4.1 PCR,技术,1,、,PCR,原理,之,DNA,体内复制原理,DNA-DNA,杂交双链分子,变性,复性,不同来源的,DNA,分子,2,、,PCR,原理,之,DNA,物理性质,3,、,PCR,原理,之体外扩增条件,物理条件：,1,、变性（,Denaturation,）,2,、退火（,Annealing,）,3,、延生（,Extention,）,化学条件：,1,、模板（,Templates,）,2,、引物（,Primers,）,3,、,dNTPs,4,、,DNA,聚合酶,PCR,仪,4,、,RT-PCR,（,Reverse transcript,）,以,mRNA,为模板,反转录,出的,DNA,称,cDNA,。,1.cDNA,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反转录酶,引物,2.cDNA library,利用某种生物的,总,mRNA,合成,cDNA,，再将这些,cDNA,与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称,cDNA,文库。,cDNA,文库的特点,1.,基因特异性,来自结构基因，仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表正在表达的基因的遗传信息,2.,器官特异性,不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的,mRNA,所组建的,cDNA,文库也就不同。,3.,代谢或发育特异性,处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同。,4.,不均匀性,在同一个,cDNA,文库中，不同类型的,cDNA,分子的数目是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因转录而来的。,5.,各,cDNA,均可获得表达,建立,cDNA,文库的一般程序,1.mRNA,的分离与纯化载体,DNA,片段的制备。,2.,双链,cDNA,的合成。,1,）单链,cDNA,的合成：反转录法,2,）第二条,cDNA,的合成：碱解或酶解（,RNaseH,）,法除去,RNA,分子,3.cDNA,克隆载体的制备。,4.ds-cDNA,与载体,DNA,相连。,5.,重组,cDNA,分子的导入和克隆。,一、,Total RNAmRNA,mRNA,只占总,RNA,的,1%-5%,。,原理：,利用,mRNA,都含有一段,polyA,尾巴，将,mRNA,从总,RNA,中分离纯化。,方法：,寡聚（,dT,）,-,纤维素柱层析法。,mRNA,纯化,二、,cDNA,合成,cDNA,的合成包括第一链和第二链,cDNA,的合成。,第一链,cDNA,的合成是,以,mRNA,为模板,，反转录为,cDNA,，有,反转录酶,催化，该酶合成,DNA,时需要引物引导，常用引物是,oligo dT,。,第二链合成是以,第一链为模板,，由,DNA,聚合酶,催化。,cDNA,的第一链合成,反转录：以,RNA,为模板，合成,DNA,。与通常转录过程中遗传信息流从,DNA,到,RNA,的方向相反。,禽类成髓细胞瘤病毒（,AMV),的反转录酶,一类能引起鸟类等动物白血病、肉瘤以及其它肿瘤的病毒。,其反转录酶由一个,亚基和一个,亚基组成，有二种酶活力。,1,）,RNA,指导的,DNA,聚合酶活力。,2,）,RNaseH,酶活力，水解,RNADNA,杂种分子中的,RNA,，可沿,3,5,和,5,3,两个方向起外切酶作用。,引物,1,、,Oligo dT,引物,2,、随机引物（六聚体寡核苷酸）,这种非特异性引物可沿着,mRNA,多个位点结合,3,、特异性引物。,反转录酶,mRNA,cDNA,3,5,5,AAAAAAA,TTTTTTT,在总的,RNA,中可作为具有,mRNA,的特异引物,文库不能完全包含基因编码序列,产生一个大的具有特定序列的,cDNA,文库,cDNA,产物可能是小的，不具有多聚腺苷的模板也被可利用,可产生大量特定基因的,cDNA,文库,产生的,cDNA,文库应用范围有限,第一链合成过程,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反转录酶,引物,mRNA,cDNA,第一链,3,3,5,5,引物,cDNA,第一链,3,5,引物,或,RNaseH,碱,第二链合成,剩下的,cDNA,单链的,3,末端可能形成一个,弯回来的双链发卡结构,（机理不明），可成为合成第二条,cDNA,链的引物。用,DNA,聚合酶合成第二链,DNA,。,cDNA,第一链,5,cDNA,第二链合成,DNA,聚合酶,cDNA,第一链,cDNA,第二链,5,3,用,核酸酶,S1,可以切掉发卡结构（但这会导致,cDNA,中有用的序列被切掉）。,核酸酶,S1,cDNA,第一链,cDNA,第二链,5,3,cDNA,第一链,cDNA,第二链,5,3,5,3,cDNA,合成,缺点：合成效率低,;1%mRNA,能合成,cDNA,。,改进,RNaseH,酶,能识别,mRNA-cDNA,杂交分子中的,mRNA,，并将其降解成许多小片断。,小片断正好成为,DNA,聚合酶的引物，用来合成冈,崎片断,。,DNA,聚合酶,I,能除去引物并修补后再使用,DNA,连接酶,连成一整条,DNA,链。,mRNA,cDNA,3,5,反转录酶,引物,mRNA,cDNA,第一链,3,5,引物,mRNA,cDNA,第一链,3,5,mRNA,mRNA,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,cDNA,第二链,cDNA,第一链,3,RNaseH,DNA ligase,去引物,三、,cDNA,末端修饰,借助,末端转移酶,给载体和双链,cDNA,的,3,端分别加上几个,C,或,G,，成为粘性末端。,在双链,cDNA,末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。,接上人工接头,粘性末端,CCC,CCC,末端转移酶,加人工接头,四、,cDNA,克隆载体,如果用,功能测定,来筛选目的基因，可用质粒载体来构建,cDNA,的表达文库。,如果通过,分子杂交或抗体,筛选目的基因，可用噬菌体载体构建,cDNA,文库。,噬菌体载体,Zap cDNA,载体,5,、,Inverse-PCR,6,、,Cross-over PCR,例：内含子的删除,Pf-1,Px-intron2,Pr,Px-intron2,exon1,First round PCR,exon2,Pr,Pf-1,Anneal(Second round PCR),RoAmyX,7,、,Error-prone PCR,8,、,Real-time PCR,9,、,SSH-PCR(suppression subtractive,hybridization),10,、,Q-PCR,（,Quantitative PCR,）,。,64,PCR,应用,之目的基因的改造,基因定向突变（,site-directed mutagenesis,）是进行基因改造最常用的技术。最常用方法是以双链,DNA,为模板，经加热变性后，与含突变碱基的引物退火，利用,PCR,方法改变特定碱基,，从而将突变碱基引入,DNA,序列中,65,PCR,法（,引物法）,设计引物,分段,PCR,66,2025/9/19 周五,再次,PCR,获得突变基因,67,2025/9/19 周五,6.5,基因的克隆和表达,质粒,表达型质粒载体的结构,69,2025/9/19 周五,6.5.1,常用克隆载体,类型：,T-,载体，,pUC,系列，,pMD,系列，一些,表达型质粒,特点：功能单位,小,，拷贝数,多,70,2025/9/19 周五,T-vector,71,2025/9/19 周五,Blue white Screen,72,2025/9/19 周五,73,2025/9/19 周五,6.5.2,常用表达系统,原核细胞：大肠杆菌、芽孢杆菌等,真核细胞：丝状真菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞等,74,6.5.3.,原核细胞表达载体,pBV220,、,pET,等,多种载体有商品化供应,原核细胞,RNA,聚合酶可以识别的启动子,原核细胞转录终止子,原核细胞核糖体结合位点,其他调控序列,结构特点,克隆基因在原核生物中表达的必要条件是携带克隆基因的载体具备原核生物中所需要的以下表达调控序列,:,75,蛋白表达方式,表达产物不仅仅含有目的蛋白，还带有一段融合的其他的标签序列用于检测和纯化。最后应用时，可能需要切除标签部分,非融合表达,表达产物直接是单一目的蛋白,融合表达,76,原核细胞表达系统的优缺点,优点,表达系统简单，容易操作,成本低，易于大量生产,生长周期短,缺点,需要翻译后修饰的蛋白不能用此表达系统,77,2025/9/19 周五,6.5.4,真核表达载体,主要包括质粒载体和病毒载体，使用的调控表达元件最初多来源于病毒,78,2025/9/19 周五,真核细胞表达系统的优缺点,表达系统相对复杂,成本高,生长周期长,优点,可表达需要翻译后修饰的蛋白表达系统简单,缺点,6.6,基因表达载体,PgpdA,/,Eco,R I,Hygro,/,Not,I,TtrpC,/,Bam,H I,RoAmy,/,Nhe,I,Eco,R I,80,6.7,目的基因到宿主细胞过程,81,感受态细胞,（,competent cell,）,使用理化或化学的方法对受体细胞进行处理或诱导，从而使其处于最适摄取和容纳外来,DNA,的一种生理状态。,6.7.1 DNA,转移过程中的几个概念,1,、,接合（,Conjugation,）,Conjugation is the mechanism by which genetic material is transferred between two bacterial cells by plasmids.,发生在原核生物，细胞间的直接接触时候，两个细胞直接接触处形成,conjugation tube,，单链,DNA,可以直接通过这个通道转移，这个通道的形成需要有相应的基因表达（如,pilin,形成,sex pilus,）。单链转移完毕，供体和受体细胞分别合成互补链，完成,conjugation,。,6.7.1 DNA,转移过程中的几个概念,2,、,转化（,Transformation,）,Certain prokaryotes are able to take up free DNA released by other bacteria.This process is called transformation.,（,Brock p283,）,原核生物的,transformation,定义中，关键词是,free DNA,，也就是说，是裸,DNA,本身，不是通过其他媒介（如病毒）转移到原核生物里面。,87,6.7.1 DNA,转移过程中的几个概念,3,、,转染（,Transfection,）,The introduction of DNA into mammalian cells is called transfection.,与原核生物的转化完全相同,-,对于真核生物，转染就是原核生物中转化的同义词。之所以在真核生物中使用转染这个词来代替转化，是因为人们之前已经习惯了用转化这个词表示真核细胞变为恶性细胞。,原核生物中，偶尔也用到,transfection,这个词，当细菌的转化过程中吸收的外源,DNA,是病毒,DNA,时就应该称此过程为转染。,6.7.1 DNA,转移过程中的几个概念,4,、,转导（,Transduction,）,Transfer of host DNA from one cell to another by a virus.,（,Brock p265,）,转导是指通过病毒将一个宿主的,DNA,转移到另一个宿主的细胞中而引起的基因重组现象。如果供体,DNA,未与受体,DNA,发生重组则称此转导过程为流产转导。,病毒 宿主,DNA,整合（,integrate,）,6.7.1 DNA,转移过程中的几个概念,5,、,感染（,Infection,）,The invasion of a cell or organism by other(especially pathogenic)organisms.,转导是指的目的基因（宿主,DNA,）的转移过程，其主体是目的基因，但是实现转导的手段是病毒感染，这里的主体是病毒载体。,例如：通过逆转录病毒感染，把,ADA,基因转导到造血干细胞里面。但是我们不能这样说：通过逆转录病毒转导，把,ADA,基因感染到造血干细胞里面。,92,6.4,目的基因的检测与鉴定,1,、,PCR,检测,2,、限制性酶切检测,3,、活性检测,4,、蛋白电泳检测,其它。,1,X,2,48 kDa,93,2025/9/19 周五,基因操作知识点一览图,94,2025/9/19 周五,复习,理论部分,真核,原核,突变,蛋白质质或量的改变,编码,倒位,缺失,插入,点突变,疾病的引发或治疗,转录调控序列,单顺反子,Protein,CDS,mRNA,tRNA,rRNA,miRNA,Ribozyme,snRNA,7sLRNA,anti sense RNA,UTR,ORF,调控序列,多顺反子,真核,原核,不连续,连续,内含子,原核,70S,真核,80S,原核,真核,启动子,终止子,正、负调控蛋白结合位点,启动子,上游启动子原件,PolyA,信号,反应元件,基因,结构基因,？,？,？,UP,DOWN,contents,96,2025/9/19 周五,复习,实践部分,97,2025/9/19 周五,复习,目的基因获取方法？,质粒？基本性质？表达型质粒具备哪些基因元件？,基因克隆？,DNA,体外重组技术？,限制性内切酶及其功能？连接酶及其功能？,PCR,反应需要的物理过程及化学物质？,逆转录酶及逆转录,PCR,过程，,cDNA,构建步骤？,感受态细胞？结合？转化？转导？,基因工程基本操作的四个步骤及其目的？,