植物良种繁育的遗传学基础.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,林木育种学课程主要内容,章 次,内 容,学 时,第一章,遗传基础,2,第二章,种质资源,4,第三章,引种,2,第四章,选择育种,2,第五章,第六章,种源选择,优树选择,2,2,第七章,第八章,林木种子园,杂交育种,2,8,第九章,第十章,复习,倍性与辐射育种,植物繁殖,4,6,2,科技教育和人文教育的协调：“知识经济”时代的教育目标,1,适应社会需要与导引社会变革：教育的职责,2,高技术和高情感的统一：实现人的潜能革命,3,“知识,-,能力,-,人格”的协调发展：深入推进素质教育,同济大学校长教授,教育部副部长：吴启迪,人最不了解的是人自身,英国著名哲学家和科学家,培根,课程成绩,平时成绩,30,期末成绩,70,College of Forestry,YANG Keqiang PhD,Email:,yangwere,13954809385,welcome you!,1.Introduction-,引言,1.1.DNAPerpetuity,DNA,是不朽的分子！,Johann Gregor Mendel(1822,1884),Experiment in plant hybridization,Mendels first law:Alleles of the same gene separate to different gametes,Mendels second law:Alleles of two different genes segregate independently of each other in gametogenesis.,孟德尔,Thomas Hunt Morgan(1866,1945,）,(,莫尔根,),Principle of linkage:alleles of genes to be passed together from one generation to the next.,Alfred Henry Sturtevant,（斯狄文特）,(18911970),Gene mapping,Genetic histrory,www.esp.org/books/sturt/history/,Morgan won the 1933 Nobel Prize in Physiology or Medicine,.,Walter Sutton,（苏特）,:,细胞学与孟德尔遗传学,cytology and Mendelism(1902).,Oswald Theodore Avery,（艾弗里,）,(1877,1955,）,Identified DNA as the genetic material(1945).,Pieces of DNA can transfer genes into bacteria cells,and transform them genetically.,Fred Griffith,:,some unknown“principle”had transformed the harmless R strain of Diplococcus to the virulent S strain.,Oswald Theodore Avery (1877,1955,）,Identified DNA as the genetic material(1945).,Pieces of DNA can transfer genes into bacteria cells,and transform them genetically.,Fred Griffith,:,some unknown“principle”had transformed the harmless R strain of Diplococcus to the virulent S strain.,Its true?,Alfred Day Hershey,（赫尔希,）,(1908,1997,）,Blender experiment,:,Used,T2,phages in which the protein was labeled with 35S and the DNA with 32P for the final proof that DNA is the molecule of heredity.,Alfred Day Hershey (1908,1997,）,Blender experiment,:,Used,T2,phages in which the protein was labeled with 35S and the DNA with 32P for the final proof that DNA is the molecule of heredity.,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969,William Thomas Astbury,（,阿斯特伯里,）,(1898,1961),First X-Rays of DNA(1938),Maurice Wilkins,（,威尔金斯,）,(1916,）,X-Rays of DNA(1950),Rosalind Franklin,（,罗沙琳德,弗兰克林,）,(1920,1958,）,The rose of science!,X-Rays of DNA(1952),Linus Pauling,（,鲍林,）,(1901,1994),Oregon Agricultural College,He was one of the people who utilized the methods of X-ray crystallography to determine the structures of organic molecules,.,I wanted to understand the world!replied Linus Pauling,a two-time Nobel laureate(,1954,1962,),when asked why he became a scientist.,www.paulingexhibit.org/,1953,A GRAET YEAR for BIO.!,James Dewey Watson,（,沃森,）,(1928,）,DNA has come a long way.,Francis Harry Compton Crick,（,克里克,）,(1916,2004-7-30,）,。,1A,2.Structure of dNTP,Base Tautomerism,碱基互变,4,。,Chargaff rules,-A=T,GC,helical,10 layer,Lines,Between,Cross,Patterns,(10,Residues,Per turn),Evidence for the Double Helix,DNA,双螺旋的证据,1.Fiber Diffraction data,:,-Helical geometry,-3.4 A spacing(1A=10,-10,m),-34 A pitch,N,aissance,of DNA double-helix!,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1962,“Central Dogma of Molecular Biology,”,Francis Harry Compton Crick.,Central Dogma,The new era was coming!,把酒酹滔滔，心潮逐浪高！,To be&to do,Human Genome Project,To be&to do,Human Genome Project,1010101010101001010101010011010101010101001010101010010100111000011100000111000001100010101010101001010101010101010010101010100101001110000111000001110000011000100101010100101010101010101001010101010010100111000011100000111000001100010101010101001010101010101010010101010100101001110000111000001110100111,1.2.,核酸的组成与性质,1.2.1,组成,核酸的组成成分是核苷酸，核苷酸由含氮碱基、戊糖、磷酸构成，核苷酸连接成核酸链的模式如图：,组成核酸的碱基为嘌呤和嘧啶的衍生物。,DNA,组成：,dAMP,dGMP,dCMP,dTMP,RNA,组成：,AMP,GMP,CMP,UMP,修饰成分：,指在核酸中含量较少，而且结构不同于上述,8,种成分的组分，绝大部分是主要成分的衍生物，有的修饰成分结构复杂，叫做高度修饰成分,(higher modified component),，修饰成分和主要成分连接方式完全相同。近一、二十年来在不同的核酸分子中先后发现很多修饰成分,(modified component),据不完全统计有近,80,种。,T=A,C,G,DNA/RNA?,DNA,二级结构的多形性,此种双连异形,(heteronomous),区段不能与组蛋白结合形成核小体，成为无核小体标志。,DNA,多态型类型：,B,型：,watson-crick,模型,(,相对湿度,92%),A,型：,B,型经脱水形成的结构（相对湿度,75,）,RNA,双螺旋（如,tRNA,双螺旋区）为,A,型构象,双螺旋结构的多态性,螺旋类型 碱基倾角,N,对,/,圈 大沟 小沟 螺距 夹角 糖苷键,B,右,0 10,宽（,5.7,）窄（,1.17,）,3.4nm 36 C G,A,右,20 11,深（,11,）,宽浅（,0.27,）,2.8nm 33,反 反,Z,左,7 8 4.5nm -60,反 反,A-B,混合型,rRNA,tRNA and mRNA,1.2.2.DNA,性质,A.,决定双螺旋结构的因素：,a.,氢键：键长,2.8-3.0,键能,4-6,千卡,/mole,b.,碱基堆集力：疏水作用力,c.,带负电荷的磷酸基的静电斥力,e.,碱基分子内能,B.,DNA,的变性与复性,变性,(denaturation),：,在一系列物理化学因素作用下,DNA,一级结构不变而二级结构中的氢键遭到破坏,DNA,双螺旋结构部分解体,或全部解离成两条单链,DNA,分子的过程,两股链成为无规则线团,叫变性或熔解。,复性,(renaturation),：,引起变性的外界条件消除后,(,如加热变性后再缓缓降温,),已分开的双螺旋又可重新缔合成双螺旋，这叫复性。,变性与降解：,变性与降解不同，降解是指在温度，,pH,急剧变化或酶超声波，高速搅拌及电离辐射等条件下，不仅,DNA,二级结构遭到破坏，同时一级结构的共价键也被切断，,DNA,分子量也发生变化。,图,7-2,某些,DNA,的,Tm,值,d(G-C),Poly,Poly d(A-T),E.coli DNA,在不同浓度,KCl,中的熔解,DNA,的,Tm,值与,G-C,含量之关系,引起变性的条件,a,温度,熔解温度,Tm:OD260,的升高达到极大值一 半时的温 度。是变性温度范围的中点。,变性曲线与碱基均一性的关系：,Tm=69.3+0.41(G+C),Tm,值，,Tm,一般在,70-85,之间，大小与下列因素有关：,DNA,均一性，均一性高，熔解过程温度范围小。,G-C,含量，,G-C,含量高，,Tm,值越高成正比关系，所以测定,Tm,可推算,G-C,含量,(G-C)%=(Tm-69.3)2.44,介质离子强度,低离子强度介质中，,DNA,熔解温度低，熔解温度范围宽，高离子强度介质反之，所以,DNA,制品应保存在高浓度,Buffer,中，常在,1mol/L NaCL,中保存。,b.pH,介质,pH,改变，可导致,DNA,变性,是由于在酸性条件下，以氢键形式存在的,-NH,2,解离，在碱性条件下以氢键形式存在的酮基转变成烯醇或羟基两者均导致氢键破坏。,酸：,NH,2,+H,-NH,3,；碱：,C=O+OH,-OH,一般情况下介质,pH,在,5.58.5,范围以内变化时，,DNA,的,Tm,值不会有多大变化。,c.,离子强度,离子强度高，,Tm,高。,d.,有机试剂对变性与复性的影响,导致,DNA,变性的有机试剂：,甲酰胺、脲、氨基甲酸酯、醇类。,影响复性因素：,DNA,顺序复杂性、片段大小，,DNA,浓度。离子强度高，复性快。,脲对变性的影响：,影响氢键稳定性,1.3,核酸的提取原理,核酸的析出；降解的防止；核酸沉淀；核酸纯化。,1.3.1,核酸提取中核酸酶的抑制,DNA,提取时，主要考虑获得分子要长。所以，要防止机械剪切。防止核酸酶对核酸的破坏。措施：尽可能减少机械剪切，如用宽口吸取器；不要剧烈搅动；使用低温（如用液,N,2,）；用核酸酶抑制剂；高温灭菌处理器具及试剂等。,1,DNase,的抑制,大多数,DNase,需要二价金属离子：,Mg,+,、,Ca,+,等。所以加入,EDTA,（乙二胺四乙酸）、,EGTA,（乙二醇二氨基乙醚四乙酸）、柠檬酸等螯合剂即可抑制,DNase,活力，,EGTA,可抑制,Ca,+,。,2,RNase,的抑制,RNase,复性能力很强，且是单链蛋白，环境中存在广泛。,RNase,抑制措施：,防止污染，操作带手套。,所用器皿要严格消毒灭菌及灭活,RNase,。高温高压灭菌：,180,烘,2,小时或灭菌锅处理。,核酸酶抑制剂例如,0.1%DEPC,（二乙基焦碳酸）,37,处理,12,小时，处理器皿试剂、水，但不能处理,Tris(,三羟甲基氨基甲烷,),。,其它的,RNase,抑制剂,RNasin,：从鼠肝或人胎盘中提取得到的一种酸性蛋白，如人胎盘,RNAsin MW=51,，,000,，,pI=4.7,，最适,pH:78,。作用机理：能与各种,RNAase,酶非共价地结合而抑制其活性，为非竞争性抑制剂，作用完后可很容易地用酚抽提除去。,氧钒基,-,核苷复合物,:,可与,RNase,结合，几乎可完全抑制,RNase,酶活，效果较好（带负电）。,皂土：,皂土是膨润土酸钠盐，带负电荷，,RNAase,是带正电的碱性蛋白，两者结合可抑制,RNase,。,Macaloid:,为复合硅酸盐，带负电，可吸附,RNase,。,SDS:,十二烷基硫酸钠，去污剂使酶蛋白变性。,Sarkosyl,十二烷基肌酸钠。,胍类,:,硫氰酸胍和异硫氰酸胍是蛋白质的强变性剂，和,-,巯基乙醇一起使用能有效抑制,RNAase,酶活力。,-,巯基乙醇破坏,RNAase,中的二硫键。,多胺类,:,如精胺、腐胺、尸胺等，对,RNAase,也有抑制作用。,肝素：,硫酸酯粘多糖，为天然抗凝血物质。,1.3.2,核酸的分离提取,从生物材料中分离提取核酸是一个不断去除细胞内的脂类、蛋白质、多糖、其它物质等而把核酸分离出来，同时也把所使用的各种不同试剂除去的过程，因此根据生物材料的不同及特点，采用不同的方案。,1.3.2.1,选材,应富含所要提取的核酸。,1.,如提,DNA,，应选取幼嫩材料。,2.,提取,RNA,，如,mRNA,，应选用一定表达阶段的材料，如种子蛋白,mRNA,，要在开花后。取种子萌发期的,mRNA,，应在种子萌发期。,3.,细胞器,DNA,或,RNA,，则应首先分离细胞器，如线粒体或叶绿体。,1.3.2.2,破碎细胞,材料,+,提取液（材料不同加提取液不同,如不同的抑制剂、去垢剂）,1,破碎方法：,高等动植物材料，用液,N,2,研碎材料后加提取剂。提取动植物材料应有所不同。,也可用匀浆器匀浆。,细菌用溶菌酶溶液分解细胞壁。,细胞器，用蛋白酶、去垢剂解离蛋白质并破碎细胞。,2,去垢剂,阴离子去垢剂：,SDS,；,Sarkosyl N(-97),：,SDS,类似物；,脱氧胆酸钠：与,SDS,效果相似，但比,SDS,易与核酸分离。除去：,0.2M.pH5.0 NaAc+2,倍体积乙醇沉淀核酸，即可除去，其在乙醇中溶解。,作用：溶解膜蛋白、脂蛋白，解聚核蛋白，其与蛋白质带正电荷（,NH,+,3,）的侧链结合，形成复合物，而使原来与蛋白质结合的核酸（带负电）分开。加入浓,KAc,可使,SDS-,蛋白复合物沉淀，并使多余的,SDS,转化为溶解度小的,K,盐同时沉淀，以除去,SDS,。,非离子型去垢剂,聚氧乙基十六烷基醚：,C,16,H,33,-O,（,CH,2,CH,2,O,）,n,H,聚氧乙基十六烷基酚醚：,TritonX-100,作用温和，可在不完全破裂细胞时使用，例如细菌质粒,DNA,，提取只需用非离子去垢剂在细胞膜上“打孔”质粒,DNA,释去，而染色体,DNA,被阻留在细胞内。,1.3.2.3,核蛋白的解聚和蛋白质的去除,1,去垢剂法 用,SDS,，,Sarkosyl,LDS,等，使核蛋白体解聚，把核酸和蛋白质分开。,2,有机溶剂法 蛋白质变性剂 苯酚，氯仿或酚氯仿 酚：氯仿：异戊醇,=25,：,24,：,1 ,盐酸胍和,Licl,作用：使蛋质变性，从核蛋白体中释放，所以也叫去蛋白剂，抑制,RNase,活性。,3,蛋白水解酶：蛋白酶,K,或蛋白酶,E,。,1.3.2.4,核酸的沉淀,将核酸从提取液及混合处理液中沉淀下来是提取核酸去除杂质的重要步骤。,核酸是水溶性的多聚阴离子，它的钠盐和钾盐在很多有机溶剂中不溶，也不会被有机溶剂变性，因此，可用做核酸的沉淀。最常用的沉淀剂是乙醇，其次还有异丙醇，,PEG,及十六烷基三甲基溴化铵（,CTAB,）等。,1,乙醇沉淀核酸,乙醇浓度：一般为加,2,倍体积核酸溶液的无水乙醇。,RNA,则应为,2.5V,体积的冷无水乙醇，可沉淀核酸浓度：,0.1g/ml,。,条件：要求核酸溶液中有一定的盐浓度，如,Nacl 0.1mol/L,NaAc 0.25mol/L,或,NH,4,Ac 2.5mol/L,沉淀核酸时的温度和时间，以及沉淀后离心速度和时间，取决于核酸分子大小，浓度及有无助沉淀物存在。助沉淀物，如,MgCl,2,，提,DNA,时的,RNA,等，分子越小，浓度越稀，沉淀时所要温度越低，时间也要长，离心时要求速度要高，离心时间也要长。,如,:1kb,的,DNA,片段，或,1kb,的,DNA,片段，并有,RNA,为助沉淀剂的，只需,0,放,0.5-1hr,，高速离心数分钟。,200,的,DNA,，乙醇沉淀效率低，则要在乙醇沉淀前先加,MgCl,2,至,0.01mol/L,。,注意,：,沉淀核酸若将和,PNK,（多核苷酸激酶）反应，（如酶切载体或目的基因），则沉淀时不可加入,NH,4,Ac,，因,NH,+,4,是,PNK,的强抑制剂。,2,核酸的,NaAc,异丙醇沉淀,沉淀剂浓度 在,0.3mol/lNaAc,浓度下，加入,0.54-1,倍体积异丙醇能选择性地沉淀出,DNA,和大分子,rRNA,，而多糖和小分子,RNA,不沉淀。,优缺点：,优点,异丙醇沉淀时所用体积小，一般不必要长时间放置，,缺点,异丙醇不易挥发除去，蔗糖，,NaCl,等在低温时易和,DNA,共沉淀。,1.4 Plant Genomic DNA Extraction,1.4.1 CTAB,法,原理：,CTAB,（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（,0.7mol/L NaCl,）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（,0.3mol/L NaCl,）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将,CTAB,与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开。然后将,CTAB,与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，,CTAB,能溶于乙醇。,步骤：,（,1,）,称取,0.4-0.5,克幼叶,分别置于相应的研钵中，并加充足的液氮（一般分三次加）研磨，直至成粉末状。,（,2,）,迅速将粉末转入,2mL,离心管中，加入,CTAB,缓冲液,100mmol/LTrisHCI(pH8.0),1.4mol/LNaCI,50mmol/LEDTA,2%CTAB1200L,20%pvp140L,-,巯基乙醇,40L,（现加现用），充分混匀。,（,3,）,65,水浴,30,分钟，水浴过程中充分混匀，晃动,23,次。,（,4,）,冷却至室温，常温离心,12000rmp 10min,（,6,）,取上清液（约,1000L,），置,2mL,离心管中，加入等体积氯仿,-,异戊醇,1/24,（,v/v,）,，倒转离心管数次，混匀。,（,7,）,置于,65,水浴,5,分钟，水浴过程中倒转晃动一到两次。,（,8,）,冷却至常温，,12000rpm,离心,10min,（,9,）,取上清液，置,2mL,离心管中，加入等体积氯仿,-,异戊醇,1/24,（,v/v,）,，倒转离心管数次，混匀。,（,10,）,常温离心,12000rmp 10min,（,13,）,取,2L,的离心管，加入,1mL70%,的乙醇，将,DNA,挑入其中，晃动洗涤,1-2,次。倒掉,70%,乙醇，加入,1mL,无水乙醇洗涤一次，倒掉无水乙醇。超净工作台，至乙醇挥发干净,。,（,14,）,加入,650L,高盐溶解,DNA,。,（,15,）,待,DNA,完全溶解后，加入,4LRNA,酶。,37,水浴,40,分钟。,（,16,）,加入,2,体积的无水乙醇，,1/10,体积的,NaAc(pH5.0),置冰上，跳出,DNA,于,0.5mL,的离心管中。用,70%,乙醇，无水乙醇各洗涤一次，置超净工作台干燥。加入,50LTE10mmol/LTris,HCI(pH8.0),，,1mmol/LEDTA(pH8.0),溶解,DNA,。,（,17,）,将,DNA,样分装，一份加入,2V,无水乙醇，于,-70,长期保存在；一份溶于,TE,中,-20,保存，用于近期研究,（,11,）,重复（,9,）,-,（,10,）步,1,2,次。,（,12,）,取,5mL,离心管，将上清液（约,650L,）转入其中。加入,2,上清液体积的无水乙醇，轻轻的旋转试管，试管中即有棉絮状,DNA,出现,1.4.2 SDS,法,原理：,利用高浓度的,SDS,，在较高温度（,55-65,）条,件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出,核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白,质及多糖杂质沉淀,最常用的是加入,5mol/L,的,KAC,于,冰上保温，低温条件下,KAC,与蛋白质及多糖结合成不,溶物），离心除去沉淀后，上清中的,DNA,反复用酚,/,氯,仿抽提，用乙醇沉淀水相中的,DNA,。,试剂,1,、提取缓冲液,：,100mmol/L TrisCl,pH8.0,20mmol/L EDTA,500mmol/L NaCl,1.5%SDS,。,2,、提取缓冲液,：,18.6g,葡萄糖，,6.9g,二乙基二硫代碳酸钠，,6.0gPVP,，,240ul,巯基乙醇，加水至,300ml,。,3,、,80:4:16/,氯仿,:,戊醇,:,乙醇,4,、,RnaseA,母液,5,、其它试剂：液氮、异丙醇、,TE,缓冲液，无水乙醇、,70%,乙醇、,3mol/L NaAc,。,操作步骤：,1.,在,50ml,离心管中加入,20ml,提取缓冲液,60,水浴预热。,2.,幼叶,0.5-1g,剪碎,在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中,剧烈摇动混匀,60,水浴保温,30-60,分钟,(,时间长,DNA,产量高,),不时摇动。,3.,加入,20ml,氯仿,/,戊醇,/,乙醇溶液,颠倒混匀,(,需带手套,防止损伤皮肤,),，室温下静置,5-10,分钟,使水相和有机相分层,(,必要时可重新混匀,),。,4.,室温下,5000rpm,离心,5,分钟。,5.,仔细移取上清液至另一,50ml,离心管,加入,1,倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状,DNA,沉淀。,6.,在,1.5ml eppendorf,中加入,1ml TE,。用钩状玻璃棒捞出,DNA,絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含,TE,的离心管中,DNA,很快溶解于,TE,。,7.,如,DNA,不形成絮状沉淀,则可用,5000rpm,离心,5,分钟,再将沉淀移入,TE,管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于,TE,可在,60,水浴放置,15,分钟以上，以帮助溶解。,8.,将,DNA,溶液,3000rpm,离心,5,分钟,上清液倒入干净的,5ml,离心管。,9.,加入,5l RNaseA(10g/l),37 10,分钟,除去,RNA(RNA,对,DNA,的操作、分析一般无影响，可省略该步骤,),。,10.,加入,1/10,体积的,3mol/L NaAc,及,2,体积的冰乙醇,混匀,-20,放置,20,分钟左右,DNA,形成絮状沉淀。,11.,用玻棒捞出,DNA,沉淀,70%,乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。,12.,将,DNA,重溶解于,1ml TE,-20,贮存。,13.,取,2l DNA,样品在,0.7%Agarose,胶上电泳,检测,DNA,的分子大小。同时取,15l,稀释,20,倍,测定,OD260/OD280,检测,DNA,含量及质量。,1.4.3,植物总,DNA,提取时常遇到的问题,1.,植物材料中含有较多的多酚类物质，使,DNA,呈褐色。,解决办法,:,提高,CTAB,提取缓冲液中巯基乙醇的含量,或在,SDS,提取液中加入,6%,的,PVP,（聚乙烯吡咯烷酮）。,2.,植物细胞壁难以破碎。,解决办法,:,在,SDS,提取液中加入蛋白酶,K,在液氮冷,冻条件下研磨。,1.4.4,植物,DNA,样品纯度及浓度的鉴定,用于,Southern,杂交的植物,DNA,样品在纯度、长度及浓度上均有较高的要求。纯度上应无蛋白质、,RNA,、多糖及抑制限制性内切酶活性的物质；在长度上不应低于,50kb,；浓度应在,0.5-1,g/l,之间。目前主要采用琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法进行检测。,（,1,）琼脂糖凝胶电泳,1.,所提植物,DNA,应呈现出一条分子量较大的清晰条带。如样品呈弥散状，说明,DNA,已严重降解，可能原因是：所用的器皿及试剂是否灭菌；材料收集后是否立即冷冻，研碎过程中或研碎后进入提取液前是否融化；是否有剧烈振动、吸管口过窄、产生起泡、反复吹打等操作。,2.,如在溴酚兰处出现明亮的荧光区，说明,RNA,过多，可用,RNA,酶消化。,3.,如在样品槽内有荧光出现，说明,DNA,为完全溶解或浓度过高，或样品不纯。,4.,估算样品的浓度。,（）紫外分光光度法测定,1.,纯度：,纯净的,DNA,溶液其,OD,260,OD,280,应为,1.8,，,OD,260,OD,230,应大于,2.0,。如果,OD,260,OD,280,大于,1.8,，表明应中含有较多的,RNA,；如果,OD,260,OD,280,小于,1.6,，则说明样品中蛋白质较多；,OD,260,OD,230,小于,2.0,时，表明溶液中有残存的小分子及盐类杂质，可增加,70%,乙醇洗涤沉淀的次数。,2.,浓度：,DNA,样品浓度（,g/l,）,=OD,260,稀释倍数,0.05,不同木本植物基因组,DNA,电泳图谱,Fig Agarose gel eletrophoresis of,genomic DNA,from different plants,泳道从右向左依次为：,M,为,-Hind digest DNA,1-22,是选取的树种依次为：石榴、核桃、月季、黄栌、腊梅、黄连木、盐肤木、龙柏、接骨木、栓皮栎、紫叶李、刺槐、白玉兰、鹅掌楸、银杏、喜树、大叶黄杨、小檗、英桐、芍药、柳树、桃,M:-Hind digest DNA 1-22,different forest plants:Common Pomegranate,Walnut,Rose,，,Cotinus,Wintersweet,Chinese Pistache,Chinese Sumac,Sabina,Williams Maiden,Orienal Oak,，,Black Locust,Yulan Magnolia,Chinese Tuliptree,Ginkgo M,，,aiden,Camptotheca acuminata Lusterleaf Box,Barberry,London Planetree,Willow,Peach,1.4.3 CTAB,法提取基因组,DNA,限制性内切酶的酶切,(,1),用限制性内切酶,EcoRL,（购自,Promega,公司）酶切，酶切反应在以下反应体系中进行：,基因组,DNA,:8,L ddH,2,O:12L,RE10BufferH,:2,L EcoRI:1L,合计,20 L,(2),按如上配置，分加到,22,个,1mL,的离心管中，,37,温水浴,12,小时。,(3),称取,0.36g,琼脂糖，溶于,30ml,的,DNA,缓冲液中，微波加热至沸腾，取出冷却至,50,左右，加入,0.5 ng.L,-1,EB 2L,。注意操作时应带,PE,手套。,(4),将标准分子量,DNA,按,20ng.L,-1,50ng.L,-1,100ng.L,-1,200ng.L,-1,梯度稀释，同时取出,6-8L,的混合液，加溴酚蓝染料,5L,，依次点样于在,1.2%,琼脂糖凝胶（含,2LEB,）泳道中，,0.5TBE(45mmol/L Tris-,硼酸，,1mmol/LEDTA),缓冲液中，,120V,200mA,定压电泳，,30,分钟。,(5),将凝胶取出后在紫外光下成像，调节焦距，用凝胶电泳分析软件分析，积分获取图像，调节图像的亮度及对比度,不同木本植物基因组,DNA,的限制性内切酶的酶切图谱,Fig.Analysis of digested DNA from different plant species by agarose gel eletrophoresis,泳道从右向左依次为：,M,为,-Hind digest DNA,1-22,是选取的树种依次为：石榴、核桃、月季、黄栌、腊梅、黄连木、盐肤木、龙柏、接骨木、栓皮栎、紫叶李、刺槐、白玉兰、鹅掌楸、银杏、喜树、大叶黄杨、小檗、英桐、芍药、柳树、桃,M:-Hind digest DNA 1-22,different forest plants:CommonPomegranate,Walnut,Rose,，,Cotinus,Wintersweet,ChinesePistache,ChineseSumac,Sabina,Williams Maiden,Orienal Oak,，,Black Locust,Yulan Magnolia,Chinese Tuliptree,Ginkgo Maiden,Camptotheca acuminata Lusterleaf Box,Barberry,London Planetree,Willow,Peach,1.5,RNA Extraction from Plant,OURS,图 不同方法提取葡萄总,RNA,的电泳结果,1.,改进,UNIQ-10,法，幼叶；,2.,改进,UNIQ-10,，成熟叶；,3.,改进,SDS/,酚法，幼叶；,4.,改进,SDS/,酚法，成熟叶；,5.,改进,SDS/,酚法，完熟果皮；,6.,改进异硫氰酸胍法，幼叶；,7,改进异硫氰酸胍法，成熟叶,.,