染色体核型分析.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,你们好,染色体标本制备及核型分析,染色体核型分析,一、名词解释,二、染色体标本制备,三、染色体核型分析,实验耗材,前期处理,实验步骤,玻片标本质量评价,计数标准、合格指标,染色体核型排列,核型检测的可重复性,一、名词解释,核型,分裂相,一个体细胞中的全部染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。,小鼠：,40,，,XY,、,40,，,XX,人类：,46,，,XY,、,46,，,XX,细胞分裂过程中每个时期的细胞形态特征，包括细胞的总体形状和遗传物质的变化。,一、名词解释,数量变异,（性染色体丢失,/,增加、近端着丝粒染色体三体）,（中期）分裂相,核型,结构变异,（缺失、重复、倒位、易位）,二、染色体标本制备,实验耗材,仪器设备：,超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、离心机、光学显微镜、刻度离心管、乳头吸管、棕色试剂瓶、载玻片、吹风机、玻片架、染色缸,主要试剂：,秋水仙素、低渗液、卡诺氏固定液、吉姆萨染液、胰酶、,1N,HCl,、,1N,NaOH,、,MEF,培养基、,PBS,二、染色体标本制备,前期处理,样品要求：对数期生长，状态良好，紧密度高，折光性好，细胞量,T25/60 mm,平皿,差速贴壁法去除,MEF,（,KSR,培养体系除外）,终止,培养,前,12,小时，,加入,秋水仙素,（,100ug/ml,）,，最终浓度为,0.10.2ug/ml,。,作用：破坏纺锤体,防护：有剧毒、无挥发性,因素：时间、浓度,二、染色体标本制备,实验步骤,二、染色体标本制备,细胞收获,制片,固定,预固定,低渗处理,消化并收集细胞至离心管,，吹打成,单细胞悬液,，,250 g,，,5 min,离心，弃上清,实验步骤,二、染色体标本制备,细胞收获,制片,固定,预固定,低渗处理,加入,37,预热的,低渗液（,0.075 mol/L,）,5 ml,，吹打至均匀，,37,水浴,15-20 min,。,实验步骤,二、染色体标本制备,细胞收获,制片,固定,预固定,低渗处理,加入,37,预热的,低渗液,（,0.075 mol/L,）,5 ml,，吹打至均匀，,37,水浴,15-20 min,。,实验步骤,配制,：,0.075 mol/L,KC,l,溶液,作用：低渗作用,因素：时间、温度、浓度,二、染色体标本制备,细胞收获,制片,固定,预固定,低渗处理,实验步骤,离心弃上清，将细胞沉淀震荡悬浮或,气泡吹打法,轻柔地重悬细胞。沿管壁缓慢加入,固定液,0.5-1.0,mL,，,边滴加边震荡,均匀，静置,5 min,后离心弃上清。,二、染色体标本制备,细胞收获,制片,固定,预固定,低渗处理,实验步骤,离心弃上清，将细胞沉淀震荡悬浮或,气泡吹打法,轻柔地重悬细胞。沿管壁缓慢加入,固定液,0.5-1.0,mL,，,边滴加边震荡,均匀，静置,5 min,后离心弃上清。,配制：甲醇：冰乙酸,=3,：,1,，,现用现配,。,作用：固定并维持染色体结构的完整性,防护：甲醇毒性，,冰乙酸刺激性和腐蚀性,二、染色体标本制备,细胞收获,制片,固定,预固定,低渗处理,实验步骤,（,1,）加入,3ml,固定液,，静置,30min,，离心弃上清；,（,2,）再次加入,3ml,固定液,，吹打均匀并静置,30min,二、染色体标本制备,细胞收获,制片,固定,预固定,低渗处理,实验步骤,离心弃上清液，根据细胞数量情况，加入,12,mL,固定液，吹打细胞制成悬液，悬液呈微白色时为最佳,。,二、染色体标本制备,细胞收获,制片,固定,预固定,低渗处理,实验内容,用滴管吸,取,细胞悬液，,高空,滴在,冰冻玻片,上，,立即在酒精灯的火焰下过火几次,，,置,80,烤箱中烤片,2h,。,二、染色体标本制备,细胞收获,制片,固定,预固定,低渗处理,实验步骤,用滴管吸,取,细胞悬液，,高空,滴在,冰冻玻片,上，,立即在酒精灯的火焰下过火几次,，,置,80,烤箱中烤片,2h,。,要求：洁净、冰冻,处理：逐片清洗（洗洁精超声波自来水纯水），,95%,乙醇浸泡,24 h,，纯水逐片刷洗，放置于装有纯水的器皿中，,4,保存。,二、染色体标本制备,细胞收获,制片,固定,预固定,低渗处理,实验步骤,预热,胰蛋白酶,消化,25-30s,，,Giemsa,染色,10min,。,清水冲洗染液，用吹风机吹干。,二、染色体标本制备,细胞收获,制片,固定,预固定,低渗处理,实验步骤,预热,胰蛋白酶,消化,25-30s,，,Giemsa,染色,10min,。,清水冲洗染液，用吹风机吹干。,要求：,0.25%,，,p,H6.8,7.2,作用：,去除染色体上的蛋白质，便于染色。,配制：,Giemsa,原液：磷酸缓冲液（,pH 7.4,）,=1,：,9,，,现用现配,。,三、染色体核型分析,玻片标本质量评价,玻片颜色,蓝紫色 玫红色 着色浅,解决方案,配制新的染液；,适当提高胰酶消化玻片的时间。,三、染色体核型分析,玻片标本质量评价,细胞密度,过密 适中 过稀,解决方案,制备玻片时，对每一个样品都先进行试片，并在镜下观察细胞密度，从而调整悬液密度。,三、染色体核型分析,玻片标本质量评价,分裂相密度,足够 稀少,解决方案,适当提高固定液中冰醋酸比例；制备较多的玻片,三、染色体核型分析,玻片标本质量评价,分裂相形态,-,紧密度,过密 适中 过散,解决方案,过密：适当提高固定液中冰醋酸比例；,过散：适当降低固定液中冰醋酸比例。,三、染色体核型分析,玻片标本质量评价,分裂相形态,过密 适中 过散,解决方案,过密：适当提高固定液中冰醋酸比例，增加滴片高度；,过散：适当降低固定液中冰醋酸比例，减小滴片高度。,三、染色体核型分析,玻片标本质量评价,分裂相形态,解决方案,尽量将细胞吹打成单细胞悬液；,滴片时勿重复滴加同一区域。,重叠,三、染色体核型分析,玻片标本质量评价,染色体形态,适中 短小 过长 扭曲交联 消化过度,三、染色体核型分析,计数标准,合格指标,分裂相需完整独立，染色体不过于松散，周围无其他距离很近的分裂相。,染色体形态适中，不过度短小或纤长，染色体彼此间无交联缠绕或者交联的染色体能明确的区分。,染色体,G,显带普遍较清晰，质检人员能够精确的判断核型位置。,计数,30,个分裂相，正常比例,50%,数量是否异常,暂不涉及核型排列 结构是否异常,三、染色体核型分析,染色体核型排列,三、染色体核型分析,染色体核型排列,三、染色体核型分析,染色体核型排列,三、染色体核型分析,染色体核型排列,正常：,46,，,XY,大,Y,：,46,，,XY,，,Y,18,小,Y,：,46,，,XY,，,Y,G,组,三、染色体核型分析,核型检测的可重复性,染色体标本制备及核型分析,