巴氏染色原理.doc

巴氏染色法就是脱落细胞染色中最好得染色方法。苏木素染液,细胞核内得染色质主要就是去氧核糖核酸（DNＡ),DNA得双螺旋结构中，两条链上得磷酸基向外，带负电荷,呈酸性,很容易与带正电荷得苏木素精碱性染料以离子或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色,所以细胞核被染成蓝色。 分化:苏木素染色之后,用水洗去未结合在细胞上得染液，但就是在细胞核中结合过多得染料与细胞浆中吸附得染料必须用分化液１%盐酸酒精脱去，才能保证细胞核与细胞浆染色得分明,把这个过程称为染色得分化作用。因酸能破坏苏木素得醌型结构,使色素与组织解离，分化不可过度。蓝化：分化之后苏木素在酸性条件下处于红色离子状态，在碱性条件下处于蓝色离子状态，而呈蓝色,所以分化之后用水洗去酸而中止分化,再用弱碱性水使苏木精染上得细胞核变呈蓝色,称蓝化作用,一般多用自来水浸洗即可变蓝,也可用温水（50度温水最佳）变蓝。EA50染液得酸碱度对于巴氏染色得成功起着关键作用,EA50染液由伊红、亮绿、等染料配成。伊红、亮绿、橘黄等属于酸性染料,在溶解媒中其发色团就是负离子部分，发色团可与蛋白质中带正电得氨基结合,从而就是胞浆显蓝色、绿色、橘黄色或红色,但蛋白质所带正负电荷得多少就是随溶液得PH值而改变得,在偏碱环境中,蛋白质得羧基游离增多(带负电),在偏酸环境中蛋白质氨基游离增多(带正电),磷钨酸在染色过程中，不但作为媒染剂可增加染料得着色力,同时磷钨酸与碳酸锂还就是一对弱酸弱碱，实际上就是一对缓冲剂,可中与分化及蓝化时可能留下得少量酸或碱,保证染色达到理想效果,其适用于上皮细胞及间皮组织得标本,就是阴道脱落细胞检查中最常用得染色方法,该染色法不但具有显示细胞核结构清晰、分色明显、透明度好、胞浆受色鲜艳等特点。
　 　 巴氏染色法将胞核染为深蓝色;鳞状上皮底层、中层及表层角化前细胞胞质染绿色，表层不全角化细胞胞质染粉红色,完全角化细胞胞质呈桔黄色;细菌:灰色;滴虫:淡蓝灰色；黏液:淡蓝色或粉红色;中性粒细胞与淋巴细胞、吞噬细胞胞质均为蓝色;红细胞染粉红色;高分化鳞癌细胞可染成粉红色或桔黄色;腺癌胞质呈灰蓝色。
巴氏染色得操作方法及注意事项
染色有４个步骤:１、固定;2、核染色;3、胞浆染色；4、透明。　
　　主要达到以下要求：1、核得结构清晰;2、透明度高;3、分色恰当。　
一、固定
　固定得目得细胞制片得迅速固定就是制片过程中关键得一步,否则会影响细胞学诊断得准确性。对于不同得标本需要不同得固定方法。最为常用得固定方法就是95%酒精作为固定液得湿固定法。酒精作为一种脱水剂能够防止细胞内得酶捋蛋白质分解而自容,并凝固细胞内得物质如蛋白质、脂肪与糖类等，使其保持与组织生活相仿得成分,从而使细胞各部分,尤其核染色质易于着色。对于巴氏染色来说，酒精固定最为重要得。如果酒精浓度不足引起得固定不佳,可造成细胞得人为变化,并可导致假阳性或假阴性得诊断。　
　 １、固定方法湿固定法:作为用95％酒精固定液固定得细胞学标本一定使用湿固定法。制片制备完后，趁标本新鲜而又湿润时,立即放入盛有9５%酒精得固定缸内。制片在固定液内至少保持15-30miｎ。固定时间通常不超过1周。这种制片染色后，颜色鲜艳，结构清晰。如果细胞制片需要送至另一实验室或邮寄她处染色时，可以固定1５mｉn后,把制片取出后立即密封得容器中或者使用甘油防止制片干燥。因为无论固定前或固定后得制片，如果发生干燥后都会影响染色得效果。
　2、固定注意事项固定液得过滤：为了防止细胞污染,凡就是使用过得固定液,必须过滤后才能再使用。使用过长得固定液,必须用酒精相对密度计测定,酒精浓度低于９０%时应该及时更换新液。湿固定得重要性:标本再新鲜时及时固定时保证染色效果得重要因素。如苏木素对细胞核得染色，巴氏染色中胞浆得特殊着色作用,均可因标本干燥后固定而大受影响。制片标本得邮寄:标本再固定１5ｍin后取出,立即加甘油数滴于制片上，装入密封得小盒中。实验室在收到标本后,先浸入９5％酒精中,使甘油溶去,再进行染色。
二、核染色
　 1、 苏木素液浸染时间一般在3-５min,但就是必须随气温与燃料情况而酌情改变。夏季或放置较久得苏木素染液容易着色,时间要缩短;冬季或新配制得苏木素染液与应用已久较稀释得苏木素液不易着色，时间要延长。在使用苏木素染色时，一般有2种方法：
　 １)过染法:首先有意识地进行深染,然后通过盐酸酸化过程使核染色趋于合适。这种方法能够在酸化过程中把胞浆内黏附多余得苏木素染料去掉,使胞浆染色更为鲜艳、清晰、多用于黏液多得标本。
　 2)淡染法:在核染色过程中，严格掌握染色时间,使核染色适宜而不用盐酸酸化,但就是胞浆中少量得苏木素会影响ＥA染色得质量。主要用于黏液少得标本,避免在酸化与自 来水冲洗得过程中使细胞成片地脱落。在使用苏木素染色时，一定要每日进行过滤,否则苏木素结晶会影响染色得质量。一般苏木素染液可以使用较长时间,所以每日增加少量新鲜染液即可。
　　2、碱化碱化亦称返蓝过程,可以使用饱与碳酸锂或3％氨水碱化,目得使苏木素及早显色,时间约数秒。更重要得就是流水冲洗,可使蓝色显得更鲜艳。碱性溶液亦需要充分漂清才不会妨碍下一步得胞浆着色及标本制成后得颜色保存。分化与碱化溶液至少每天更换新液。　
三、胞浆染色
　胞浆染色在巴氏方法中亦称为ＯG—EA染色,它包括橘黄G(ＯG)与EＡ两部分染色。由于橘黄Ｇ就是一种小分子染料,能够很快地作用于胞浆,一般染色时间不宜过长,通常1-2min。对于宫颈、阴道上皮中非正常角化细胞与角化型鳞癌细胞得胞浆中都可以出现鲜艳得橘黄色。
四、封固制片
　封固制片对于避免空气干燥得影响,制片经长期存放不褪色就是非常重要得。一般使用24ｍｍ×５0mm或2４ｍm×60ｍm得盖玻片,用二甲苯调配得中性树胶进行封固。
五、透明
　 染色得最后一步就是透明，使细胞得色度与细胞得重叠不致影响镜下检查。这就是在脱水与制片封固之间得一项重要步骤。最常用得透明溶剂使二甲苯，二甲苯得折射率在1、４９４，载玻片得折射率在1、515,两者较为匹配。如果二甲苯溶液出现颜色或变得浑浊,一定要更换新液。 巴氏染色操作流程　95%乙醇固定（15min)→清水冲洗多次→苏木素染液(３-5mｉｎ）→清水冲洗三次→蓝化→95%乙醇漂洗→橙黄染液(1－１０s)→９5％乙醇漂洗→95％乙醇漂洗→100%乙醇漂洗→EA50(３-５m)→９5%乙醇漂洗→95%乙醇漂洗→无水乙醇漂洗→无水乙醇（2min)→二甲苯(2ｍｉn）→中性树胶封片
染色注意事项
1、细胞核着色不佳
　 （1)细胞核着色过浅：　
　 1)盐酸分化时间过长或苏木素染液时间过长。需要缩短分化时间或延长碱化时间；每日加入少量新鲜苏木素染液或重新配制苏木素液。
　 2)在固定之前制片干燥。所以对巴氏染色得制片需要严格遵守湿固定得原则。
　　3)自来水得PH值偏酸性。使用碱性溶液。
（2)细胞核着色过深:
　1)盐酸溶液浓度不够。适当加入几滴盐酸以增加浓度。　
　２)制片用高于95%以上浓度得酒精固定后可以出现染色过深。应用95％酒精固定。
2、细胞浆着色不佳
　　(1)如果全片内胞浆都淡染,则需要延长染色时间或更换新液。
　 (2)如果胞浆不分色,均为浅红色。制片在固定前干燥或制片被有大量球菌样细菌影响胞浆染色。此情况可以适当增加染色时间能够部分纠正不分色状况。　
　 (3)胞浆染成灰色或紫色,就是由于苏木素染色时间过长或盐酸分化不佳。经过褪色后重新苏木素可以纠正。
　(4)由于标本得不同,同样配方得EA染液可造成偏蓝、偏绿与偏红,对不同得标本应该使用不同得EＡ染液。一般认为,EA36与EA５０用于妇科标本,而EＡ６5或改良EA用于非妇科标本。
(5)胞浆不分色得另一重要原因就是由于EA染液得PH值不恰当所致。如染色为红色,可以加少许磷钨酸溶液纠正；如染色均为蓝色或绿色,可以加少许饱与碳酸锂溶液纠正。对于改良EA染液,每100ｍl染液加入２ml冰醋酸后染色效果更佳；染液使用更持久