醋酸菌的诱变育种及工艺条件的优化.doc

大 学
毕 业 论 文

醋酸菌的诱变育种及工艺条件的优化
Breeding of Acetic Acid Bacteria and the Optimization
of Process Conditions

2011年 6 月 01 日
烟台大学

醋酸菌的诱变育种及工艺条件的优化

烟台大学毕业论文任务书
院（系）：化学生物理工学院
姓名

毕业论文题目
醋酸菌的诱变育种及工艺条件的优化
指导教师

具体要求(主要内容、基本要求、主要参考资料等)：
1）认真查阅相关资料，弄清实验目的、意义，搞好整体设计
2）认真探索实验方法，找出实验的关键
3）熟练实验操作技术，保证实验数据的准确性
4）实验数据真实可靠，文献引用要合理，论文撰写要规范
主要参考文献：
[1] 冯 静, 施庆珊, 欧阳友生, 陈仪本. 醋酸菌多相分类研究进展. 微生物学通报 SEP 20, 2009, 36(9): 1390-1396.
[2] M. Ameyama, E.Shinagawa, K.Matsushita and Adachi: Agr.Biol.Chem, 2010, 48:
3099
进度安排：
第1~2周：确定论文题目，布置文献查阅相关事宜。阅读、整理文献，写开题报告。
第3~4周：进入实验室，熟悉环境、实验仪器。
第5~12周：预试验。正式试验，及整理实验数据。
第13~14周：论文初稿。
第15周：论文修改及定稿。

指导教师（签字）：
年 月 日
院（系）意见：

教学院长（主任）（签字）：
年 月 日
备注：

[摘要] 本实验从陕西农家醋醅和实验室自制果醋中分离得到两种菌种A1和B，以其为出发菌种，进行诱变以期得到高产酸量的菌株。结果表明：采用紫外诱变处理，得到A11和B11菌株，分别比亲株产酸量提高18 %和4.9 %。因起始酒精度、发酵温度、溶氧量（摇床转速）对醋酸菌的发酵产量有较大的影响。故对A11和B11菌株进行单因素优化，最终得到的最佳条件是：
A11 ：初始酒精含量5 %、摇床转速150 r/min、发酵温度28℃；
B11 ：初始酒精含量6 %、摇床转速150 r/min、发酵温度30℃。

关键词：醋酸菌；分离；紫外线（UV）诱变；单因素试验
Abstract: In this study, we got two kinds of strains, A1 and B, from Shan xi peasant vinegar and laboratory fermented homemade fruit vinegar in the experiment. Started by them as bacteria, we hope to get strains that could make high yield on acid consumption. The results show that: we got A11 and B11 strains by the ultraviolet mutation processing, and their consumption of acid increased by 18% and 4.9 %. Starting alcohol degrees, fermentation temperature and oxygen (the speed of the wave bed) have great influence on the acetic acid bacteria fermentation yields. We made single factor optimization on A11 and B11 strains, and we got the best condition is:
A11: 5 % of the initial alcohol content, rotation speed 150 r/ min,
fermentation temperature 28 ℃;
B11: 6 % of the initial alcohol content, rotation speed 150 r/min,
fermentation temperature 30 ℃.

Key words: acetic acid bacteria, separation, ultraviolet (UV) mutagenesis, single factor test

IV

目　录
1 前 言 1
1.1 概述 1
1.1.1 醋酸菌的简介 1
1.1.2 醋酸菌的培养及保藏 1
1.2 诱变育种 1
1.2.1 物理诱变―紫外线诱变 2
1.2.2　化学诱变―甲基磺酸乙酯(EMS)诱变 2
1.3 醋酸菌生产性能的研究进展 3
1.3.1 影响醋酸菌生长的生态因子 3
1.3.2 生产性能的有关研究 3
1.4 果醋的营养保健功能 4
1.5 研究的目的和意义 4
1.6 课题创新点 4
2 材料与方法 5
2.1 主要材料 5
2.1.1 样品 5
2.1.2 醋酸菌培养基 5
2.1.3主要仪器设备 5
2.2 主要操作方法 5
2.2.1醋酸菌的分离与纯化 5
2.2.2 诱变方法 5
2.2.3 单因素试验 6
2.2.4醋酸菌的鉴定及检测方法 7
2.2.5 醋酸菌的生长曲线 7
3 结果与分析 8
3.1 醋酸菌原始菌株的筛选 8
3.1.1 分离筛选 8
3.1.2 醋酸菌菌株的定性鉴定 8
3.1.3醋酸菌生长曲线的绘制 10
3.2 诱变育种 11
3.2.1 紫外线诱变的菌株筛选 11
3.2.2 EMS诱变的结果筛选 15
3.3 醋酸菌产酸量的影响因素 17
3.3.1 单因素试验设计 17
3.3.2 单因素实验设计检验 21
3.3.3 小结 22
4 结 论 23
结论与展望 24
参考文献 25
致 谢 26

烟台大学毕业论文

25

量得到提高，而且可能使其利用原材料的成本得到降低。
成功的诱变育种需要：1）处理可用于筛选的大的微生物群体；2）预期的特性突变率高；3）可以用视力诊断或简单测定鉴别突变的有效方法。
1.2.1 物理诱变―紫外线诱变
物理因素中目前使用得最方便且十分有效是紫外线，而其此种诱变方法有很多先例，可以予以借鉴。用紫外线诱变醋酸菌，能使其产量有稳定的提高[13]。
紫外线是波长136~390 nm的短于紫外波长的射线，它是一种非电离辐射，能使被照射物质的分子或原子中的内层电子提高能级跃迁到能量高的外层轨道（称为激发），导致分子的理化变化。紫外线辐射最主要的则是引起DNA形成嘧啶二聚体，他会阻碍双链的解链和复制，阻碍碱基的正常配对，从而导致基因突变[14]。它的遗传效应主要是引起GC→AT 的转换或移码突变。由于存在光复活作用，即白光照射能活化光激活酶并将嘧啶二聚体解而使DNA恢复正常，故辐照和处理后的培养应避免可见光照射（应在红光下操作）[15]。
测定紫外光的剂量有直接法（以尔格/平方毫米表示绝对剂量）和间接法（以辐照时间或致死率作为相对剂量）两种。微生物所受射线的剂量决定于灯的功率、照射距离和时间[16]。如果功率和距离是固定的话，则剂量就和照射的时间成正比，故照射时间的长短可作为相对剂量。一般用15W的紫外灯，距离固定在30 cm左右，挑选出致死率达到90 %~99.9 %所需的辐射时间进行诱变处理。
但各类微生物所需的最适时间不同，一般营养体需要辐照3~5 min，芽孢要10 min，芽孢杆菌的营养体则要1~3 min，革兰氏阳性菌和无芽孢菌较易杀死，用30 s，放线菌的分生孢子用30 s~2 min [17]。
辅射同时要有电磁搅拌设备，以求照射均匀，尤其在菌液浓度较大或菌体、孢子等较大而重时很容易在处理期间发生沉降，此时电磁搅拌更显重要。照射前紫外灯宜先开灯预热20~30 min，使光波稳定。
1.2.2　化学诱变―甲基磺酸乙酯(EMS)诱变
EMS，即甲基磺酸乙酯，是一种烷化剂，自1953年Kolmark首次发现EMS的诱变作用后，EMS便被广泛地应用于动物、植物和微生物育种中，并取得了显著的成果。但其尚未应用于醋酸菌的诱变育种，故对其在此领域应用的研究具有一定的科研价值。
 （1） EMS诱变育种原理
    甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulphonate，简称EMS)，是一种改变DNA结构烷化剂，对生物系统作用的重点主要是核酸，对修复酶的钝化也有一定的作用它与DNA中的磷酸嘌呤、嘧啶作用，使之突变。主要原因是烷化剂具有一个或多个活性烷基，这些烷基能被转移到其他分子上置换氢原子，发生烷化作用。烷基化位点主要在G(鸟嘌呤)的N7位置上，由于上N7的烷基化，使之成为带一个正电荷的季铵基团。这个季铵基团产生两个效应:一是促进第一位氨基上氢解离。使G不再与C配对而与T配对，从而造成G∶C-A∶T转换。二是N7成为季铵基团后，减弱了N9位上的N-糖苷键，而产生了去嘌呤作用。大部分的无嘌呤位点都可以被无嘌呤内切酶系统所修复，但是有时复制在修复之前进行，则在无碱基位置上可以通过插入任何一个碱基，在第二轮复制以后，则原来的G∶C对可以变为任何碱基对G∶C、C∶G、A∶T、T∶A，既有转换，又有颠换。此外，它也可与核苷结构的磷酸反应，形成酯类而将核苷酸从磷酸与糖分子之间切断，产生染色体的缺失。总之，碱基熔化后易从DNA链上裂解下来，造成DNA的碱基缺失及修补，从而引起突变[18-20] 。
（2） EMS诱变突变体的鉴定
目前常用的鉴定方法有：形态学方法、细胞学方法、诱变与离体培养技术相结合方法、生理生化方法、现代分子生物学方法、遗传学方法等[21]，特别是随着分子生物学的发展，人们逐渐将从分子水平对变异体进行早期鉴定，其中分子标记辅助选择技术具有准确、有效等优点，从而减少了选择群体和缩短育种时间。
（3）EMS诱变前景
在今后一段时期内，如何提高诱变频率和选择效率仍是EMS研究的关键问题，我们在进一步发挥诱变育种的特长与优势的同时，有必要从各个方面进行深入研究诱发突变的机理，以提高诱变频率，并结合分子标记及其它生物标记技术，提高选择效率。
1.3 醋酸菌生产性能的研究进展
1.3.1 影响醋酸菌生长的生态因子
醋酸菌的生长需要适宜的生态环境，不同的生态环境，必将影响其正常的活动规律及其代谢能力，影响醋酸菌生长的因素主要表现在以下几个方面：
（1） 温度
温度是醋酸菌代谢的主要调节因素，是醋酸菌生长繁殖和产酸的必要条件。醋酸菌的最适生长温度为25℃-37℃。但是微生物生长速度最快时的温度未必是发酵积累产物最多的温度[22]。
（2） 初始酒精浓度
酒精是醋酸菌生长代谢所需能量的提供者，但较高的酒精浓度对醋酸菌的生命活动有一定的抑制作用[23]，因此，在醋酸发酵过程中要根据醋酸菌耐酒精的能力，将酒精浓度控制在一定的范围内。
（3） 溶氧量
醋酸菌为严格好氧微生物，只有在有氧的条件下才能生长。生产中只有通气良好，才能正常发酵。在含有较高浓度乙醇和醋酸的环境中，菌种对缺氧非常敏感，中断供氧会造成菌体死亡。
1.3.2 生产性能的有关研究
醋酸菌只有在合适的条件下才能生长和发酵良好，故在人工培养醋酸菌时，要了解菌种性能以控制合适的发育和发酵条件，取得较好的发酵效果。黄仲华等对所分离出的优势醋酸菌进行了耐乙醇能力、分解乙酸盐能力、耐食盐能力和耐高温能力的试验研究；祖国仁、施安辉等对分离出的优势醋酸菌进行了产酸速度、耐酒精度、耐温度、酒精转化率等性能的试验研究；国外用多种不同菌种混合发酵，不仅发酵速度加快，还能形成其他有机酸与酯类物质，增强了产品的香味和固形物成分。
1.4 果醋的营养保健功能
食醋含有丰富的有机酸、糖分、氨基酸、B族维生素和水溶性钙、磷、铁、锌、等矿物质，以及醇、醛、酚、酯等微量成分。现代营养学、医药学研究表明，醋对人体健康有很多益处[24]
水果中含有丰富的糖资源，是酿醋用的上等原料，与粮食醋相比，果醋的营养成分更为丰富[25]。果醋中富含有机酸、醇、酷类等以及维生素、氨基酸和矿物质，这使得果醋具有丰富的营养价值，且有多种保健功能，如可预防高血压、高血脂，促进血液循环、增强钙质吸收、延缓衰老、开胃消食等功效[29]。
1.5 研究的目的和意义
我国是水果生产大国，而且果醋及果醋饮料逐渐兴起为第四代饮料产品，将有巨大的市场发展潜力。但水果实际加工量很低，水果加工滞后于种植业的发展。开发高质量的果醋及果醋饮料，不但可以节约粮食，充分利用水果资源，还可以解决水果销路难的问题，增加果农收入。同时，开发高质量的果醋及果醋饮料对提高我国水果资源综合利用价值，发展我国的水果加工业有一定的帮助。综上总结则选育高产醋酸菌为重中之重。
正如所有发酵工业主要是利用微生物的转化作用一样，食醋中微生物及其酶的作用对发酵制品质量及风味也有重要的影响。总结目前食醋生产现状，存在如下问题：
(1) 菌种的产酸量不够高，因此导致大生产过程中原料的损失较多，导致成本高；
(2) 菌株发酵过程代谢产物过于单一，导致成品醋的口感不良；
(3) 醋酸发酵条件的不确定，造成发酵浪费。
故此，微生物高产菌种的选育及其优良特性的充分发挥，对酿醋工业尤为关键。 传统食醋酿造在漫长一个历史时期，是利用自然界野生的有益微生物，产品质量高低不一，质量没法保持稳定 。因此设法提高醋酸菌的生产质量是当务之急。
1.6 课题创新点
传统的诱变方式主要有亚硝酸诱变处理、吖啶橙诱变处理、5-溴尿嘧啶诱变处理、2-氨基腺嘌呤诱变处理、盐酸羟胺诱变处理及紫外线诱变处理等，都取得了不错了效果。本课题首先是采用了传统的紫外诱变处理菌种，第二种诱变方法是采用了甲基磺酸乙酯（EMS）诱变育种，EMS诱变其他菌株如酵母菌或者植物如玉米等已有很多先例，但是用于醋酸菌的诱变育种是首例，经过对其他实验的总结进行醋酸菌的EMS诱变的尝试实验设计，其诱变结果充分验证了此种育种方法用于醋酸菌株的可行性。

2 材料与方法
2.1 主要材料
2.1.1 样品
陕西农家醋醋醅、实验室自制果醋以及分离出的菌种
2.1.2 醋酸菌培养基
基础培养基：1 % 酵母粉，1 % 葡萄糖，pH 4.5，0.1 MPa灭菌20 min，使用前加入3 % （V/V）无水乙醇。
分离培养基：1 % 酵母粉，1 % 葡萄糖，1 % 碳酸钙，1.5 % 琼脂，pH 4.5，0.1 MPa灭菌20 min，使用前加入3 % （V/V）无水乙醇，分装制成CaCO3平板分离培养基。
斜面保藏培养基：1 % 酵母粉，1 % 葡萄糖，1 % 碳酸钙，1.5 % 琼脂，pH 4.5，0.1 MPa灭菌20 min，使用前加入3 %（V/V）无水乙醇，摆成斜面即为菌种保藏培养基。
产酸实验培养基：豆芽汁，1 % 葡萄糖，灭菌后加入4 %（V/V）无水乙醇。
2.1.3主要仪器设备
HZQ-F160振荡培养箱 中国哈尔滨市东联电子技术开发有限公司
恒温培养箱 上海福玛实验设备有限公司
D-MS-Ⅰ直流磁力搅拌器 天津市华兴科学仪器厂
YC-260-L医用冷藏箱
BA200生物显微镜
2.2 主要操作方法
2.2.1醋酸菌的分离与纯化
取10 g研磨好的曲样，10 mL果醋分别放入富集(基础)培养基中进行摇床培养48 h，得到10-1的稀释液，10倍梯度稀释，取10-3，10-4，10-5稀释度的样品稀释液涂布于平板分离培养基上，每一稀释度涂布三个平板，每个平板用0.1 mL稀释液，涂好后30±0.5 ℃倒置培养48 h，挑取HC值（溶钙圈与菌落直径之比）较大，菌落丰厚的单菌落。然后进行划线分离得到纯种菌株，接种于斜面保藏培养基中，30±0.5 ℃培养 24 h 后保藏于4 ℃冰箱备用。
2.2.2 诱变方法
2.2.2.1 紫外诱变
采用紫外线照射诱变的方法，对分离出的菌A和菌B进行形状改良。诱变筛选流程如下：
始发菌株→ 活化→ 紫外线（UV）诱变处理→ 分离纯化→ 初筛→ 复筛→ 菌种保藏

诱变处理过程大致如下：
（1）制备菌悬液：将培养好的斜面上的菌株用5 mL　0.85 %的无菌生理盐水洗下，轻轻震荡，使菌苔打散成乳白色悬浊状，配成一定浓度（1×108 cfu/ mL）的菌悬液，将菌悬液注入无菌培养皿中，置于磁力搅拌器上，搅拌十分钟，制成单细胞菌悬液。
（2）紫外诱变：取以上制备好的平皿置于超净工作台中，距紫外灯30 cm处，先不打开皿盖。紫外灯打开预热20分钟，以稳定光波。然后打开皿盖使菌液暴露在波长为253.7 nm，15 w的紫外光下照射，磁力搅拌，力求使细胞均匀吸收紫外光波。采用不同的照射时间（10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s）。
（3）涂布分离：避光十倍稀释涂布，用黑布包住培养[26]，防止回复突变，与同步培养的野生型菌株进行比较。
（4）制作致死率曲线：计算致死率(诱变后减少的菌落数／诱变前的菌落数×100 %)，做出致死率-照射时间曲线。依据大量资料，醋酸杆菌在偏低诱变剂剂量（70 %-80 %致死率）的情况下发生正突变的几率较高，故由图均选择75 %致死率时的诱变剂剂量进行诱变。
（5）初筛：以最佳照射时间处理菌悬液，取0.5 mL进行系列梯度稀释，进行平板涂布后30±0.5　℃倒置培养48 h。选择HC值大的菌株进行定性实验。
（6）复筛：以标准NaOH滴定法测定总酸量，根据总酸量高低确定优良菌种。
2.2.2.2 　EMS诱变
采用化学试剂EMS诱变方法，对分离出的菌A和菌B进行形状改良.诱变筛选流程如下：
始发菌株→ 活化→ 甲基磺酸乙酯（EMS）诱变处理→ 分离纯化→ 初筛→ 复筛 → 菌种保藏
诱变处理过程如下：
（1） 制备菌悬液：将培养好的斜面上的菌株用5 mL　0.85 %的无菌生理盐水洗下，轻轻震荡，使菌苔打散成乳白色悬浊状，配成一定浓度（1×108 cfu/ mL）的菌悬液。
（2） EMS诱变处理：取等量菌悬液加入无菌离心管中，每管2 mL，离心弃去上清液后加入2 mL pH7.0的磷酸缓冲溶液。加入40 μL EMS原液,放入30±0.5 ℃摇床培养，采用不同的反应时间（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min），加入2 mL 5 %硫代硫酸钠溶液终止反应。
（3） 涂布分离：离心弃去上清液并用无菌生理盐水洗涤离心三次后稀释涂布，培养。与同步培养的野生型菌株进行比较，计算致死率，作出致死率-照射时间曲线。
（4） 初筛：溶钙圈法，及醋酸菌的定性定量实验。
（5） 复筛：以标准NaOH滴定法测定总酸量，根据总酸量高低确定优良菌种。
2.2.3 单因素试验
(1) 温度对醋酸产量的影响
分别向温度为25℃、28℃、30℃、32℃、35℃的产酸培养基中接入接种量为5 %的菌种，摇床培养，醋酸发酵结束测定其产酸量，并分析不同温度对醋酸菌醋酸发酵的影响。
(2) 溶氧量对醋酸产量的影响
按照以确定温度的优化条件将醋酸菌按5 %的接种量接入产酸培养基中，在转速为120 r/min、130 r/min、140 r/min、150 r/min、160 r/min、170 r/min下振荡培养，醋酸发酵结束测定其产酸量，并分析不同溶氧量对醋酸菌醋酸发酵的影响。
(3) 初始酒精度对醋酸产量的影响
按照以确定温度和溶氧量的优化条件，分别向初始酒精度为3 %、4 %、5 %、6 %、7 %、8 %（v/v）的产酸培养基中接入菌种，摇床培养，发酵结束测定其产酸量，并分析不同酒度对醋酸菌醋酸发酵的影响。
2.2.4醋酸菌的鉴定及检测方法
2.2.4.1鉴定方法
(一) 采用碳酸钙平板，根据是否有透明圈产生来判断是否产酸，分离出HC值较大的醋酸菌，然后进行革兰氏染色及定性实验来具体确定是否为醋杆菌属醋酸菌。
(二) 革兰氏染色：将上述试管斜面上的菌株连续活化2次，在第2次活化24 h－30 h后，进行革兰氏染色，枯草芽孢杆菌作阳性对照、大肠杆菌作阴性对照。
(三) 定性试验：将上述斜面菌株活化2次，在第2次培养48 h后，接种于装有10 mL产酸试验培养液的(18×180) mm的试管中（各接两支），30±0.5 ℃静置培养，培养4 d时各取出一支，3000 r/min离心5 min，除去菌体，用氢氧化钠中和，加入10 %氯化铁 2－3 滴，在火焰上煮沸，能形成红褐色溶液者为产醋酸的菌株[27]。
2.2.4.2 检测方法
酸度的测定：标准NaOH溶液滴定法[28]。
总酸的测定：酸碱滴定法[29]。

2.2.5 醋酸菌的生长曲线
菌株接种于产酸培养基中，30℃ 120 r/min振荡培养，每天补加1 %（v/v）无水酒精，每天取样用血球计数板进行菌体计数，绘制醋酸菌的生长曲线，从而确定产酸定量测定的时间，应在对数中后期或稳定前期进行产酸量测定。

3 结果与分析
3.1 醋酸菌原始菌株的筛选
3.1.1 分离筛选
经过对醋醅和果醋的富集培养、分离纯化和筛选得到如下菌株，其形态特征见表1和表2。
表1 　醋醅中的产酸菌形态
Tab. 1　Vinegar grains in the form of acid bacteria
编号
number
菌体形态
Morphology

菌落特征
Colony characteristics
基本形态
The basic form
形状
Shape
表面
Surface
边缘
Edge
隆起形状
Bulge shape
颜色
Color
HC值
HC value
1#
椭圆，对生 Ellipse, opposite
斑点
Spotted
光滑 Smooth
整齐
Tidy
突起
Convex
乳黄色 Cream
4︰1
2#
短杆，对生 Short iron, opposite
圆形
Round
不光滑
Not Smooth
不整齐 Irregular
突起
Convex
白色
White
5︰2
3#
椭圆，对生 Ellipse, opposite
圆形
Round
光滑 Smooth
整齐
Tidy
扁平
Flat
乳白色 Milky
3.9︰2.7
4#
椭圆，对生 Ellipse, opposite
缺刻
Nick
不光滑
Not Smooth
不整齐 Irregular
扁平
Flat
乳白色 Milky
5.6︰5

表2　自制果醋中产酸菌的形态
Tab.2　The morphology of strains of vinegar made in laboratory
编号Number
菌体形态
Morphology
固体培养菌落特征
Colony characteristics of solid culture
基本形态
The basic form
形状
Shape
表面
Surface
边缘
Edge
隆起形状
Bulge shape
颜色
Color
HC值
HC value
B
椭圆，对生Ellipse，opposite
圆形Round
光滑Smooth
整齐Tidy
突起Convex
乳黄色Cream
2.8︰1.2
3.1.2 醋酸菌菌株的定性鉴定
3.1.2.1 形态特征
醋酸菌具有多种形态特征，细胞从椭圆形的到杆状，单生的、成对或成链排列，菌落特征为乳白色或乳黄色，圆形或斑点状，表面湿润，边缘比较整齐。优良的醋酸菌产酸量较高，这可以通过溶解碳酸钙产生的溶钙圈的直径与菌落直径之比来判断，可以看出1#、2#菌种的HC值比较大，即产酸量可能会比较大，其他两种菌的HC值比较小，但是2#菌种菌落表面不光滑，不符合醋酸菌菌落特征。而且具体产酸量的大小与HC值之比是否符合还有待验证。B

3.1.2.2 生理生化实验
挑选出产透明圈的菌株进行革兰氏染色，其染色结果如下各图所示： 　　
图1　镜检结果 1# 　 　 图2　镜检结果 2#
Fig.1　Microscopic exam result of 1# Fig.2　Microscopic exam result of 2#

图3 　镜检结果3# 图4　镜检结果4# 图5　镜检结果B
Fig.3 　Microscopic　exam　 Fig.4　Microscopic exam 　　Fig.5　Microscopic exam　　
result of 3#　　　　　　　 result of 4# 　　　　　　　　 result of B
从图1到图5五个照片中可以看出：1#、2#、B三株菌均为革兰氏阴性菌，且形状为棒状短杆菌或杆菌且都为对生的，与醋酸菌的特征相符。根据氧化葡萄糖生成葡糖酸能力的强弱，将醋酸菌分为葡糖杆菌属和醋杆菌属，定性实验即从这两种醋酸菌中鉴别出醋杆菌属醋酸菌。根据醋酸铁溶液呈红褐色这一现象可以区分。由图6、图7、图8可以看出上述挑选的菌株只有1#、B两种菌有红褐色溶液产生。将1#改标记为A，即该实验的结果为选育出A、B两种醋酸菌。

图6 实验结果 1# 　图7 定性实验结果B
Fig.6 Results of 1 # 　　　　　　　　　　　 Fig. 7　Results of Ｂ

图8 实验结果 2#
Fig. 8 Results of 2#
3.1.3醋酸菌生长曲线的绘制
(1)用显微镜直接计数法测得的菌A的生长曲线：

Log10(菌体数目)
时间/d

图9　菌A生长曲线
Fig.9　The growth curve of A

由图9可知，在开始的1 d内，醋酸菌增长较缓慢，此时醋酸菌处于延迟期；从第2 d开始醋酸菌数量激增，到第4 d醋酸菌数达到最大，这段时间内醋酸菌处于对数生长期；第4 d到第5 d醋酸菌数虽略有下降，但变化不大，此时醋酸菌处于稳定期；从第5 d起醋酸菌处于衰亡期，活菌数不断下降。在稳定前期（即第4 d）滴定测其产酸量为27.42 g/L 。
(2) 用显微镜直接计数法测得的菌B的生长曲线：
Log10(菌体数目)

时间/d

图10　菌B的生长曲线
Fig. 10　The growth curve of B
由图10可知，在开始的1 d内，醋酸菌增长较缓慢，此时醋酸菌处于延迟期；从第2 d开始醋酸菌数量激增，到第8 d醋酸菌的数目达到最大，这段时间内醋酸菌处于对数生长期；第8 d到第12 d醋酸菌的数目虽略有下降，但变化不大，此时醋酸菌处于稳定期；从第12 d起醋酸菌处于衰亡期，活菌数不断下降。在稳定前期（即第8 d）滴定测其产酸量为64.65 g/L。
3.2 诱变育种
3.2.1 紫外线诱变的菌株筛选
3.2.1.1 紫外线诱变致死率曲线及最佳诱变时间的确定
菌种A的致死率-照射时间曲线如下图所示：

时间/s
致死率/%
致死率%
时间/s
致死率%

图11　紫外诱变对A菌致死率的影响
Fig.11　The death rate of A by using UV mutagenesis
时间/s

由图11可以看出，在13 s的时菌A的致死率达到75 %，因此选定13 s为最佳诱变时间。
用同样的方法对菌B进行紫外诱变，致死率-照射时间曲线如下图：
致死率%
时间/s

时间/s
图12 紫外诱变对B菌致死率的影响
Fig.12 The death rate of B by using UV mutagenesis致死率%

由图12可以看出，在25 s时B的致死率为75 %，因此选择25 s为最佳诱变时间对该菌种进行诱变。
3.2.1.2 紫外诱变后的初筛
在最佳诱变时间对两种菌株进行诱变，根据HC值的大小进行初筛。菌体诱变前和诱变后的形态见表3。
表3　诱变前后醋酸菌的形态
Tab.3　The form of acetic acid bacteria before and after mutation
编号Number
菌体形态
Morphology
固体培养菌落特征
Colony characteristics of solid culture
基本形态
The basic form
形状
Shape
表面
Surface
边缘
Edge
隆起形状
Bulge shape
颜色
Color
HC值
HC value
A
椭圆，对生
Ellipse, opposite
斑点
Spotted
光滑 Smooth
整齐
Tidy
突起
Convex
乳黄色 Cream
4︰1
A11
椭圆，对生
Ellipse， opposite
斑点Spotted
光滑 Smooth
整齐
Tidy
突起 Convex
乳黄色Cream
5︰1.3
B
椭圆，对生
Ellipse, opposite
圆形Round
光滑Smooth
整齐
Tidy
突起Convex
乳黄色Cream
2.8︰1.2
B11
椭圆，对生
Ellipse， opposite
圆形Round
光滑Smooth
整齐Tidy
突起Convex
乳黄色Cream
4.5︰1.3
B12
椭圆，对生
Ellipse， opposite
圆形Round
光滑Smooth
整齐Tidy
突起Convex
乳黄色
Cream
4.0︰1.5
B13
椭圆，对生
Ellipse， opposite
圆形Round
光滑Smooth
整齐Tidy
突起Convex
乳黄色Cream
4.2︰1.8
通过表3的对比发现，诱变后的HC值明显变大。此类菌株有可能为高产醋酸菌，故挑选此类菌株进行定性实验。对A11、B11、B12、B13进行定性实验结果如下图所示：

图13 A11实验结果 图14 B11实验结果
Fig.13　Results of A11 Fig. 14 Results of B11

图15 B12实验结果 图16 B13实验结果
Fig.15　Results of B12 Fig.16 Results of B13
由图13、图14、图15、图16的实验结果可以看出，定性实验培养液均变为红褐色溶液，并与对照培养液形成鲜明对比，故此四种菌均为醋酸菌。但是仅凭定性实验和HC值的大小并不能确定产酸量的变化情况，须通过对如上的几种菌进行复筛实验以验证诱变的效果。
3.2.1.3 复筛
紫外诱变得到四种新菌种A11、B11、B12、B13，将四种菌接入定量实验培养基，于30±0.5 ℃下120 r/min摇床培养，待菌种到达稳定期后，立即用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液滴定酸度。紫外诱变前和诱变后的菌株的生长曲线如下：
时间/d
Log10(菌体数目)

图17　A、A11生长曲线
Fig.17　The growth curve of A and A11
Log10(菌体数目)

时间/d

图18　B、B11、B12、B13生长曲线
Fig.18　The growth curve of B、B11 、B12 and B13
图17中系列1为诱变前菌株A，系列2为诱变后所得菌株A11。如图可以看出，诱变前后两株菌的生长期基本没有变化，只是诱变后的繁殖力增强，因此在对数期，菌株的数目增大的幅度比较大。与此同时，产生的结果可能是在保证培养基中营养物质足够用的前提下，产酸量会发生较大的变化。
图18中系列1、2、3、4分别为B、B11、B12、B13。如图所示诱变后产生的三株醋酸菌的生长期基本与诱变前一致，只是繁殖力有所提高，因此单位时间内产生的菌体数目比诱变前有提高。另外，除了B12在对数期的增殖速率减小外其他的均变化不明显，因此，在保证培养基中的营养物质充足的条件下，产酸量均有可能增加。
对以上挑选的菌株进行总酸的测定，其诱变前后的产酸量见表4。
表4　诱变前后醋酸菌产酸量比较
Tab. 4　Mutation acid production of acetic acid bacteria before and after comparison
编号
Number
产酸量/(g/L)
The amount of acetic acid (g/L)
A
27.42
A11
32.36
B
64.65
B11
67.80
B12
62.83
B13
67.26
由表4可以看出，诱变后所得的菌种的产酸量发生了明显的提高。A菌株的产酸量有了很大的提高，在原来的基础上提高了约18 %，B菌株诱变产生的新菌株中B11的产酸量提高最大,约为4.9 %，B13次之，B12发生负向突变，产酸量降低。
3.2.2 EMS诱变的结果筛选
3.2.2.1 EMS诱变致死率曲线及最佳诱变时间的确定
对菌A、菌B进行EMS诱变，做出致死率-反应时间曲线，选择最佳诱变时间进行诱变 。
（1）菌A的致死率曲线如下：

致死率%

时间/min

致死率%
图19　菌A致死率曲线
Fig.19　Lethality curve of A致死率%

时间/min
由图19可以看出，在约17 min