大肠艾希杆菌检测.doc

大肠菌群及大肠杆菌测定
  ——MPN法检验流程（FDA BAM）
1、检样50g+450ml稀释液
2、适当十倍稀释样品
3、选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9mlLST肉汤并加有导管），每管接种1mL。在35℃下 ，培养24 ± 2h ~48 ± 2h。
4、（1）没有产气管→报告阴性
（2）有产气管：①接种BGLB肉汤管→查MPN表报告结果（大肠菌群）
                            ②接种EC肉汤 →在44.5±0.5 ℃ （水浴培养）24 ± 2h ~48 ± 2h。
                            →产气管接种EMB平板（35℃、18~24h），从EMB平板上挑取5个可疑菌
                            转接到PCA斜面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接种LST复检产气  
                            →查MPN表报告结果（大肠菌群）。               
大肠菌群测定——MPN法检验几点说明
MPN检索表：
   MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。
初发酵和证实试验：
    1）两步法进行了两次乳糖发酵试验。初发酵和证实实验所用培养基不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”。
    2）初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。
产气量与倒管：
    在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。
大肠杆菌测定——EMB选择性分离鉴别
EMB平板典型大肠杆菌菌落特征：                     
中心黑色或紫红色，有或无绿色金属光泽
大肠杆菌测定——EMB选择性分离鉴别
EMB是一种弱选择性培养基，一些球菌也可在该培养基上生长；l高压灭菌可使得美蓝还原从而使培养基的颜色呈不均一橘黄色，轻轻摇动培养基可以恢复原有的正常紫色，倾注平板前应先摇匀；
大肠杆菌在该培养基上并不一定总是呈现绿色的金属光泽；
该培养基受可见光易使其中的成分氧化，储存及培养细菌时都应在避光条件。

大肠杆菌测定——革兰氏染色
基本步骤：
将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗；
滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；
滴加95%乙醇脱色约15～30s,直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗；
滴加番红复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。
结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。