干细胞课件.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,Lawrence M.Hinman,Ph.D.,Professor,Department of Philosophy,University of San Diego,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Lawrence M.Hinman,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Lawrence M.Hinman,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Lawrence M.Hinman,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Lawrence M.Hinman,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Lawrence M.Hinman,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Lawrence M.Hinman,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Lawrence M.Hinman,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Lawrence M.Hinman,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Lawrence M.Hinman,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Lawrence M.Hinman,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Lawrence M.Hinman,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,第十九章 干细胞,发育生物学的新领域,1,Lawrence M.Hinman,近年来在干细胞理论和技术研究方面取得了长足的进展。,1999,年,12,月,美国,科学,杂志把,干细胞生物学,和,以干细胞临床应用,为内容的干细胞生物工程评为,20,世纪世界科学进展的最重要领域。已经成为继人类基因组大规模测序之后最具活力、最有影响和最有应用前景的生命科学研究领域之一。,2,Lawrence M.Hinman,内 容,第一节 干细胞生物学,第二节 干细胞工程原理与技术,3,Lawrence M.Hinman,第一节,干细胞生物学,干细胞的定义和生物学特点,干细胞的分类,干细胞自我更新与分化的调控,4,Lawrence M.Hinman,干细胞的定义,干细胞（,Stem Cells,）,是一群未分化的，具有,自我更新,(self-renewal),能力和,多向分化 潜能,(potency),的细胞。它既能产生表型与基因型完全相同的子代细胞；也能产生组成机体各组织和器官的高度分化的细胞。,5,Lawrence M.Hinman,干细胞的起源和进展,1896 E.B Wilson,首次用这个名词描述寄生虫生殖系的祖细胞,1963 Till,和,McCulloch,发现小鼠骨髓中存在能够自我更新的细胞,1968,骨髓移植治疗重症联合免疫缺陷综合症,(SCID),获得成功,1978,在人类的脐带血中发现存在造血干细胞,1981 Evans,和,Kaufman,建立小鼠胚胎干细胞系,1997,白血病起源于造血干细胞的发现证实了肿瘤干细胞的存在,1998 Thomson,等建立第一个人胚胎干细胞系,1996,克隆羊,Dolly,诞生,2000s,很多报道表明成体干细胞具有可塑性,2001,美国,Advanced Cell Technology,公司的科学家首次采用克隆技术培育出人类早期胚胎（,6,个分裂球）,2004-2005,韩国研究者黄禹锡,(Hwang Woo-suk),声称利用体细胞核转移技术培育出几种人类胚胎干细胞系，后来被证实是伪造的,2006,英国科学家用脐带血干细胞分化出第一个人造肝细胞,6,Lawrence M.Hinman,干细胞的起源和进展,2007.1,科学家发现在羊水中存在一种新型干细胞，它可以在研究与治疗中替代胚胎干细胞,2007.6 3,个研究小组同时报道发现小鼠正常的皮肤细胞可以重新编程成为干细胞,；同时科学家,Shoukhrat Mitalipov,首次报道通过体细胞核转移技术制备猴胚胎干细胞成功,2007.10 Mario Capecchi,Martin Evans,和,Oliver Smithies,分获诺贝尔生理和医学奖，奖励他们在胚胎干细胞和小鼠基因,“,敲除,”,方面的贡献,2007.11,日本科学家宣布成功把人体皮肤细胞（纤维原细胞）改造成类似胚胎干细胞的多潜能干细胞,诱导性多潜能干细胞,2008.1,不需要破坏胚胎即可制备人类胚胎干细胞系（,Advanced Cell Technology,）,2008.1,美国科学家利用人的成纤维细胞核进行体细胞核转移技术获得了人类的胚泡（囊胚）,2008.3,自体间充质干细胞成功治疗关节变性病,2008.10,德国科学家成功把人类睾丸细胞改造成多潜能干细胞，美国科学家将人类发根的角化细胞转化为类胚胎干细胞,7,Lawrence M.Hinman,干细胞的生物学特点,属低分化细胞，缺乏分化标记；,在机体的数目和位置相对恒定；,具有自我更新能力；,具有多向分化潜能，即具有分化发育的可塑性，其分化受所处周围微环境（,niche,）的影响；,能无限地分裂、增殖；,分裂的慢周期性，绝大多数干细胞处于,G0,期；,两种生长方式：一是对称分裂，形成两个相同的干细胞；二是不对称分裂，一个子代细胞保持干细胞特性，另一个成为祖细胞，最终分化成终末细胞。,8,Lawrence M.Hinman,干细胞的生长分裂方式,9,Lawrence M.Hinman,干细胞的分类,根据发生学来源分类,胚胎干细胞（,Embryonic stem cells,ESCs,）,是指由胚胎内细胞团（,inner cell mass,ICM,）经体外抑制培养，在传代过程中筛选出的具有多能性的细胞。,成体干细胞（,Adult stem cells,）,是指存在于一种已经分化组织的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞。例如：造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、肝干细胞、皮肤表皮干细胞、胰腺干细胞等。,10,Lawrence M.Hinman,人类胚泡的形成,11,Lawrence M.Hinman,原肠胚期发育成,3,个胚层，外胚层、中胚层和内胚层：,外胚层发育成神经系统、皮肤、指甲、鼻、口、肛门、眼球晶状体和视网膜。,中胚层发育成身体的排泄系统，循环系统和运动系统。,内胚层发育成内消化道，呼吸道等。,人类组织分化,12,Lawrence M.Hinman,13,Lawrence M.Hinman,胚胎干细胞又称全能干细胞,它是从胚胎细胞团中分离出来、能在体外培养的一种高度未分化细胞,是一种具有全能性或多向性分化潜能的细胞。,其特点是能大量繁殖并保持未分化状态,;,在一定条件下能向内、中、外,3,个胚层组织和细胞分化,;,易于进行基因改造操作,注入囊胚后能广泛参与宿主胚胎各组织器官的生长发育,形成嵌合体,;,在体外培养扩增时,经遗传操作、选择和冻存,均不失其全能性,;,在不同生长条件下具有不同的功能状态。,14,Lawrence M.Hinman,成体干细胞横向分化的普遍性,预测并阐明横向分化机制,就有可能利用病人自身健康组织的干细胞诱导分化成病损组织的功能来治疗疾病。,这样既可解决免疫排斥问题,又可避免胚胎细胞来源不足和社会伦理问题。,目前研究的成体干细胞主要有造血干细胞、角膜缘干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞、脂肪干细胞和胰腺干细胞等。,15,特征,胚胎干细胞,(hESCs),成体干细胞,分化潜能,多潜能（,Pluripotent,）干细胞,可诱导分化成为三个胚层中所有种类的细胞,分化潜能多样，主要为多能（,multipotent,）干细胞,来源和分离方法,体外受精剩余的胚胎或用体外核转移技术,(SCNT),获得胚胎，但,SCNT,成功率极低，费用昂贵。技术要求高,虽然数目有限，个体特异性的成体干细胞较容易获得。需要外科方法的的介入来分离组织,(,入骨髓穿刺、鼻粘膜活检等）。细胞分离的技术要求不高,伦 理,主要的问题在于,分离胚胎干细胞会破坏胚胎，,利用体外核转移技术对人类克隆存在争论,该方面的问题较少，主要是提取成体干细胞要获得捐助者的知情同意，分离的细胞是否可以进行买卖等,体外培养与保存,在体外细胞培养时能够自我更新，可以在体外进行长期培养，并可以冻融。但体外培养需要维持其稳定性（不分化），长时间培养可能出现遗传的不稳定性,在体外培养很难生长，在体外环境中不能自我更新,免疫原性,个体特异性的,hESCs(,体外核转移技术,),在细胞治疗中免疫性低,来自自体的干细胞治疗不会产生免疫反应,肿瘤形成,肿瘤形成率高，干细胞治疗的遗传不稳定性,肿瘤形成率相对较低,细胞遗传修饰,容易进行遗传改造，细胞可以进行体外挑选，但也可以产生不需要的突变,遗传改造较难（由于细胞数量少，而且难于培养），可采用细胞融合进行基因治疗。,疾病传播风险,有病毒感染的风险（来自饲养细胞和血清），需建立不依赖饲养细胞、不依赖血清生长的胚胎细胞系,异体移植需考虑配型,治 疗,目前尚无人体治疗和临床研究的报道,已用于临床治疗（如治疗白血病和淋巴瘤）,16,Lawrence M.Hinman,根据分化潜能分类,全能干细胞（,Totipotent stem cell,）,多潜能干细胞（,Pluripotent stem cell,）,多能干细胞（,Multipotent stem cells,）,单能干细胞（,Unipotent stem cell,）,17,Lawrence M.Hinman,全能（,Totipotent,）,干细胞,是指具有无限分化潜能，能分化成所有组织和器官的干细胞，包括胎盘。其具有发育成完整个体的能力。,Totipotent cells have the potential to become,any type in the adult body,any cell of the extraembryonic membranes(e.g.,placenta).,18,Lawrence M.Hinman,多潜能（,Pluripotent,）,干细胞,是具有自我更新能力和高度增殖以及多向分化潜能，并可以定向诱导分化为三个胚层中所有种类的细胞，它可以用来形成复杂的组织和器官。但与全能干细胞相比，它失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定限制。,自然状态下存在的三种多潜能干细胞：,胚胎干细胞（,Embryonic stem cells,，,ES,）：来源于体外受精的胚泡的内细胞团；,胚胎生殖细胞（,Embryonic germ cells,，,EG,）：来自胎儿性腺的原生殖细胞；,胚胎肿瘤细胞（,Embryonic Carcinoma Cells,EC,）：来自畸胎瘤，但为非整倍体细胞。,19,Lawrence M.Hinman,胚胎生殖细胞（,Embryonic germ cells,，,EG,）,指来自于,5-10,周龄的胚胎性腺区的早期生殖细胞。在发育后期，性腺区发育成睾丸或卵巢，原始生殖细胞（,primordial germ cell,，,PGC,）产生精子或卵子。,胚胎肿瘤细胞（,Embryonic Carcinoma Cells,EC,）,是来源于恶性畸胎瘤的一种多潜能干细胞。畸胎瘤是由机体内幼稚生殖细胞发生变异而形成的肿瘤。恶性畸胎瘤内既含有各种各样分化成熟的组织，还含有一些未分化的、能不断增殖的干细胞，因其形态和发育潜能都类似胚胎细胞，而且是恶性的，故称其为胚胎肿瘤细胞。,20,Lawrence M.Hinman,Human pluripotent embryonic stem(ES)and embryonic germ(EG)cells,21,Lawrence M.Hinman,ES cell=,胚胎干细胞,EG cell=,胚胎生殖细胞,EC cell=,胚胎肿瘤细胞,SSEA=,阶段特异性胚胎抗原,TRA=,抑制肿瘤抗原,-1LIF=,白血病抑制因子,bFGF=,碱性成纤维细胞生长因子,EB=,胚体,22,Lawrence M.Hinman,人工方法获得多潜能干细胞：,体细胞核移殖技术（,Somatic cell nuclear transfer,，,SCNT),人工诱导的多潜能干细胞（,Induced pluripotent stem cell,iPS,）,23,Lawrence M.Hinman,多能（,Multipotent,）干细胞,是指能分化成与其来源相近的特定组织或器官的干细胞（例如造血干细胞可以分化为红血细胞、白血细胞和血小板，肝干细胞能够分化为成熟的肝细胞、胆管上皮细胞，神经干细胞能够分化为神经元、神经胶质细胞等）。,24,Lawrence M.Hinman,Blood Cell Differentiation from Hematopoietic Stem Cells(HSCs).,25,Lawrence M.Hinman,单能（,Unipotent,）干细胞,只能产生一种细胞类型；但是，具有自我更新属性，将其与非干细胞区分开,。,如肝干细胞、胰腺干细胞、肠上皮干细胞、角膜缘干细胞等,。,受损的小鼠肝脏内，在肝胆管周围存在,FoxL1,表达阳性（水蓝色）的肝干细胞，它们被肝纤维细胞（品蓝）所包裹，构成了干细胞生存和发挥功能的微环境。,26,Lawrence M.Hinman,干细胞自我更新与分化的调控,内源性调控,细胞内多级水平的分子调控,外源性调控（干细胞微环境）,细胞因子,细胞间的相互作用,细胞外基质,环境的理化性质,Wnt,信号通路,TGF-,转化生长因子,-,bFGF,碱性成纤维细胞生长因子,BMP,骨形成蛋白,S1P,鞘氨醇,-1-,磷酸,PDGF,血小板来源的生长因子,BDNF,脑源性神经营养因子,27,Lawrence M.Hinman,内 容,第一节 干细胞生物学,第二节 干细胞工程原理与技术,28,Lawrence M.Hinman,第二节 干细胞工程原理与技术,干细胞的来源,干细胞的分离和培养,干细胞定向诱导分化,干细胞检测方法,29,Lawrence M.Hinman,干细胞工程,细胞治疗（,cytotherapy,）,是应用具有特定功能的细胞群或细胞克隆治疗肿瘤、感染、自身免疫性疾病、基因缺陷等疾病的一种涉及生物免疫学和基因学的治疗手段。,第一代细胞治疗：全血输注；,第二代细胞治疗：骨髓和外周血干细胞移植；,第三代细胞治疗：在分离纯化少量干细胞基础上，通过细胞工程技术，在体外扩增和定向诱导分化，或对其进行基因改造后，将产生大量的目的细胞回输体内进行治疗。,干细胞工程,是利用干细胞的增殖特性，多向分化潜能及其增殖分化的高度有序性，通过体外培养干细胞、诱导干细胞定向分化，或用转基因技术处理干细胞以改变其特性，以达到利用干细胞为人类服务的目的。,30,Lawrence M.Hinman,干细胞的来源,干细胞的来源：,胚胎（体外受精、,核移殖技术）、,胎儿与新生儿脐带血、成体,31,Lawrence M.Hinman,干细胞的分离纯化,解离（散）组织制备细胞悬液：机械分离、酶学解离或免疫疗法（,immunosurgery,）,人类胚胎干细胞的分离,32,Lawrence M.Hinman,干细胞的分离纯化,利用细胞体积和密度不同分离纯化,利用细胞对不同基质的粘附性不同分离细胞,Arterioscler Thromb Vasc Biol.2008;28(9):1584-95.,33,Lawrence M.Hinman,干细胞的分离纯化,利用细胞表面标志分离纯化,细胞表面标志（,cell surface marker,）,存在于某种细胞表面的特异性的表面蛋白，利用这些表面蛋白的特异性表达，应用抗体结合或其他的方法可以检测或获得相应的细胞。,流式细胞分选术,免疫磁珠分选术,Identifying Cell Surface Markers Using Fluorescent Tags,Microscopic Image of Fluorescent-Labeled Stem Cell,34,Lawrence M.Hinman,未分化造血干细胞表面标记,35,Lawrence M.Hinman,流式细胞术,Fluorescence activated cell sorting,FACS,36,Lawrence M.Hinman,CD34+Stem Cells,健康人外周血,CD34+,细胞绝对值（,1.060.51,）,10,7,/L CD34+,细胞占白细胞总数的（,0.160.05,）,%,粒细胞,淋巴细胞,单核细胞,37,Lawrence M.Hinman,免疫磁珠细胞分选（,MACS,）,38,Lawrence M.Hinman,干细胞体外培养,胚胎干细胞体外培养的条件：,质量良好的囊胚,有效的内细胞团分离,可靠稳定的培养系统,有效稳定的传代,39,Lawrence M.Hinman,Directed differentiation of mouse embryonic stem cells.,干细胞定向诱导分化,干细胞自发分化,干细胞定向诱导分化,40,Lawrence M.Hinman,胚体（,embryoid body,EB,）,在体外培养环境中，如果在胚胎干细胞的培养体系中撤除抑制细胞分化的因子（如饲养细胞或白血病抑制因子,LIF,等），胚胎干细胞就会失去保持未分化状态的能力，可以自发形成多细胞结构，即胚体。胚体中含有,3,个胚层的细胞，胚体继续分化，可以自发分化为血细胞、内皮细胞及神经细胞等不同类型的细胞。,体外培养（明胶基质）的小鼠胚胎干细胞形成的胚体（,200,）,Biochemistry(Mosc).2008;73(13):1438-52.,干细胞自发分化,41,Lawrence M.Hinman,人类胚胎干细胞的自发分化,(A),当人类胚胎干细胞移植到免疫缺陷小鼠的睾丸囊内，免疫组化,HE,染色显示为典型的畸胎瘤：（,1,）软骨，（,2,）原始神经细胞，（,3,）复层扁平上皮，（,4,）腺上皮，（,5,）肌肉，及其他细胞。,(B),免疫组化显示人类胚胎干细胞的胚体。（,Scale bars:A,800,M;B,100,M,）,Development,131,5515-5525(2004),42,Lawrence M.Hinman,干细胞定向诱导分化,干细胞定向诱导分化,加入生长和分化因子（激活内源性转录因子）,干细胞遗传改造（转染外源性转录因子）,与特定分化细胞（饲养细胞）共培养,43,Lawrence M.Hinman,J Cell Biochem.2008;105(3):633640.,体外诱导,hESC,向神经细胞分化,生长和分化因子,悬浮培养法,附着培养法,bFGF,44,Lawrence M.Hinman,Nature Immunology,5,359-360(2004),利用,OP9,和,OP9-DL1,细胞作为基质细胞在体外诱导胚胎干细胞分化为,T,和,B,淋巴细胞,共培养法,45,Lawrence M.Hinman,胚胎干细胞的诱导分化,NR,未报到,;BMP,骨形成蛋白,;,GFs,生长因子,;EGF,表皮生长因子,;VEGF,血管内皮生长因子,;GDNF,胶质细胞源性神经营养因子,;SCF,干细胞因子,;GCSF,粒细胞干细胞因子,;EB,胚体,;END-2,内脏内胚层样细胞系,.,Endocrine Reviews 2006;27(2):208219,46,Lawrence M.Hinman,干细胞的检测方法,根据细胞形态检测,：,如体积小、核浆比大,根据生长特性检测,：,呈克隆状生长；,ES,细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清，克隆周围有时可见单个,ES,细胞和分化的扁平状上皮细胞,根据特异性细胞表面标记分子检测,：,流式细胞术，免疫荧光,Werstern blot,检测细胞内特异基因的表达水平,：,定量,PCR,基因芯片,Werstern blot,分化潜能检测,：,体外分化实验；体内分化实验（移殖与重建）,核型检测,其他,：,利用干细胞的慢周期性，采用标记滞留细胞的方法来识别在体内的静息干细胞；胚胎干细胞碱性磷酸酶（,AKP,）染色（未分化为阳性）等,47,Lawrence M.Hinman,Biochemistry(Mosc).2008;73(13):1438-52.,小鼠,ES,细胞的碱性磷酸酶活性检测和,SSEA-1,抗原免疫荧光分析。,48,Lawrence M.Hinman,人类胚胎干细胞,H1,在化学合成培养基中的表型分析,Proc Natl Acad Sci U S A.2006;103(18):6907-12.,49,Lawrence M.Hinman,人类胚胎干细胞,H1,在体内和体外的分化能力检测。,A,为裸鼠体内自发分化；,B,和,C,为体外诱导形成神经细胞。,a.,腺泡,b.,成骨细胞,c.,神经上皮细胞,d.,视网膜色素上皮细胞,e.,腺上皮细胞,f.,柱状上皮细胞,Proc Natl Acad Sci U S A.2006;103(18):6907-12.,50,Lawrence M.Hinman,基因治疗,生物大分子治疗,细胞治疗,疾病的,生物治疗,51,Lawrence M.Hinman,干细胞生物工程及其意义,干细胞生物工程,是指在体外对干细胞进行操作,包括体外增殖,定向诱导,横向分化,基因修饰和组织成形等。,干细胞生物工程,科学价值在于其诱人的应用前景,用细胞技术治疗疾病将是未来医学发展的方向,已从干细胞中培养出血液、内皮、心肌、骨、软骨、肌腱、神经细胞等。,52,特异性分化细胞系的建立,胚胎干细胞可形成生物个体的所有组织细胞。,人们正致力于人类胚胎干细胞的识别、分离、体外培养扩增与分化诱导工作。,目前的研究表明,人类胚胎干细胞可在体外诱导为造血干细胞、神经干细胞和心肌干细胞等。,53,组织和器官培养,在适当控制的条件下,胚胎干细胞有可能在体外培养体系中形成各种人体组织甚至人体器官。,如果这一目标得以实现,将使临床上器官移植所面临的器官来源紧缺以及免疫排斥等棘手问题得以解决。,现已可能在体外诱导形成肌肉、骨、软骨、韧带、肌腱以及脂肪组织等。同时,人们正致力于利用胚胎干细胞来制备肺和肾等人体器官。,54,基因治疗研究,胚胎干细胞也可能与基因治疗技术结合起来,治疗某些遗传性疾病。,由于蛋白质只能作用于细胞表面分子而发生作用,;,而且基因治疗常有依赖病毒序列作为基因载体的弊病,因此限制了,“,分子治疗,”,的应用。,干细胞具有自我扩增和分化功能,因此导入的,“,外源基因,”,可以有效地得以扩散,;,干细胞可以在体外进行操作,对基因的改造和修饰可以在体外完成并经筛选后再导入体内,避免由于基因插入而导致的细胞失常,;,干细胞是人体细胞,作为载体其毒性最小,而且作为生命的最小单元,是导入组织的最佳形式。,55,基因调控、定向诱导和横向分化,定向诱导是指在体外把胚胎干细胞定向诱导分化为成熟的功能细胞,而横向分化则是把一种组织的成体干细胞诱导分化成另一种组织的,“,干细胞,”,或功能细胞。,不论定向诱导还是横向分化,它们的共同基础就是干细胞基因表达的调控。,目前研究基本上都是实验现象的观察,对其机制还缺乏了解,更不用说在体外进行完全的定向诱导和横向分化。因此,必须对干细胞发育的分子调控机制做深入的探讨。,56,干细胞生物工程是,21,世纪的一个热点领域,干细胞可为组织工程研究提供良好的种子细胞,深入研究多能干细胞的分化机制、建立体外三维立体培养条件及开发可在体内应用的新型生物材料、在体外构建不同的组织器官用于临床是干细胞生物工程研究的核心。,干细胞生物工程的研究还处在一个初始阶段,特别是许多理论问题尚未阐明,;,技术上所面临的困难和障碍也很多,如细胞的来源、培养细胞的方法、诱导生长以及组织和器官的三维结构重建等等。,尽管如此,干细胞生物工程研究领域最新成果已经向人们展示了一个美好的前景,在未来的世界中,人们有望利用干细胞技术来修复或更换受损的组织器官。,57,Buy organ donors now!,58,Lawrence M.Hinman,