复方肝复康针剂的制备.doc

说 明 书
一种预防与治疗慢性肝纤维化和肝硬化的中药制剂

技术领域
本发明涉及一种治疗肝病的复方中药制剂，特别是一种用于预防和治疗非病毒性、免疫性肝损伤以及病毒性肝损伤所致的肝纤维化和肝硬化的复方中药制剂，以及该制剂的制备方法。

背景技术
目前全世界肝病患者日益增多，肝病的发病率占各种传染病法定报告的第一位。肝病，特别是肝硬化和肝纤维化的预防和治疗仍是一道全球性难题。迄今为止，西药对于肝硬化的治疗在国内外尚缺乏良策，化学疗法对人体有极大的副作用，主要表现在对人体免疫系统的损害，而由此副作用带来的后果往往是易反弹，病情反复不见好转，康复率低。
但肝纤维化和肝硬化并非不可逆转 [Friedman SL Hepatic fibrosis.[M]In: Schiff ER,Sorrell MF, Mddrey WC. Schiff, Disease of the Liver. 8th ed. Philadelphia: Lippincott-Ra- ven,1999. 371-386]。近年来，在中医药的科研与临床中，发现中医药对各型肝病的治疗显示出一定优势，取得了较好的效果。[王英凯、王丹、唐彤宇，临床肝胆病杂志, 2002,4 (18): 253-255.]。
本草纲目记载：鳖甲能疏肝解郁，软坚散结，清虚热，通血脉，滋肝肾之阴而潜纳浮阳；丝瓜络具有活血化淤，清热化痰，行血脉之功效。而中医认为肝炎、肝纤维化和肝硬化是由于肝郁气滞导致血淤，经隧阻塞，血不养肝，气血瘀滞是本病的主要特点，治疗上宜以益气活血为主。[李道宽，辽宁中医学院学报,2000,2 (4):288-289.]。已有实验证明鳖甲对早期或者晚期肝硬化大鼠均有促进肝细胞恢复及纤维组织重吸收的作用。[王英凯，王丹，唐彤宇，临床肝胆病杂志,2002,4 (18):253-255.]。现代研究发现鳖甲可抑制肝、脾组织的增生，调节免疫功能，提高淋巴细胞的转化率，延长抗体存活时间，并促进骨髓造血，有利于防止癌细胞的突变和扩散，丝瓜络具有镇痛抗炎和抗肝损伤之功效。[肖培根，新编中药志[M], 第一卷, 第一版, 北京:化学工业出版社. 2002.215-218.]。
中国专利针对“鳖甲与丝瓜络”的应用公开了“治疗痛风病的中药”（专利申请号97107394.5），其公开的处方是炒桑枝、（米泔水泡）苍术、（盐水炒）知母、萆、苦参、木通、防已、丝瓜络、赤芍、王不留行、炙乳香、炙没药、地骨皮、牡丹皮、路路通、鳖甲、怀牛膝、（盐水炒）黄柏、茜草根、签草、羌活、独活、甘草；其主要功效是治疗痛风病，无毒副作用，用药安全。中国专利同时公开了“一种治疗脏腑疾病的中草药肾天素”（专利号为03145571.9），它由：黄柏、莪术、三棱、大黄、银柴胡、栀子、胡黄连、青皮、鳖甲、秦艽、黄芩、山豆根、知母、防风、地骨皮、贝母、牛膝、大腹皮、生地黄、麦冬、熟地黄、葶苈子、石菖蒲、茯神、款冬花、紫菀、川芎、白芷、薤白、百合、鹿茸、牡蛎、黄芪、甘草、赤芍、白芍、石决明、当归尾、刺疾藜、丝瓜络、瓦楞子、守宫、凌霄花、龟版、刘寄奴、泽兰、旋复花、木蝴蝶、厚朴、虻虫、沉香加工制备而成。该中草药对肾、肝、肺的治疗有特殊的疗效，无毒副作用。它可直接调解人体新陈代谢，清热开窍、豁痰解毒、化浊生肌、消肿止痛，使五脏六腑恢复正常状态。
中国专利中尚未见：以鳖甲与丝瓜络为原料，制成用于预防和治疗非病毒性、免疫性肝损伤以及病毒性肝损伤所致的肝纤维化和肝硬化的复方中药制剂。

发明内容
本发明的目的在于提供一种具有活血化淤,软坚散结,调节免疫功能的用于预防和治疗非病毒性、免疫性肝损伤以及病毒性肝损伤所致的肝纤维化和肝硬化的复方鳖甲软肝制剂。
本发明的另一目的在于提供该复方中药制剂的制备方法。
本发明的解决方案是基于祖国医学对肝病发病机理的认及治疗原则，参考现代药理研究成就，从祖国医药宝库中，筛选出能疏肝解郁，软坚散结，清虚热，通血脉，滋肝肾之阴而潜纳浮阳的鳖甲和具有活血化淤，清热化痰，行血脉之功效的天然食用植物药丝瓜，按中医理论组方，提取精华，使其发挥抑制肝、脾组织的增生，调节免疫功能，提高淋巴细胞的转化率，延长抗体存活时间，并促进骨髓造血，防止癌细胞的突变和扩散，以及镇痛抗炎和抗肝损伤的作用。
本发明制剂是由鳖甲和丝瓜络按照下列重量配比:
鳖甲 10-60 丝瓜络 3-20 。
本发明所述中药制剂是任何一种药剂学上所说的剂型，包括针剂、散剂或块剂。
本发明所述中药制剂的制备方法包括下列步骤
A、原料制取：
1、选取和炮制处理鳖甲：
选取脊椎动物鳖科鳖的背甲。称取鳖甲10—60 克，按照《中国药典》2000版一部附录规定的烫法进行炮制处理，用沙炒至表面淡黄色，筛滤取出。
2、选取和处理丝瓜络
将丝瓜络碾制成粉末，备用；
B、醋淬：将炮制处理后的鳖甲趁热用500ml浓度为5%--35%的乙酸溶液醋淬；
C、烘干：捞出鳖甲，除去残肉，用清水洗净，再放入60℃鼓风烘箱中烘干待用；
D、混合萃取：将烘干后的鳖甲与制成粉末的丝瓜络一起放入烧瓶中，倒入纯净水150-600ml；将烧瓶放入微波炉中，用微波强度为250-600W萃取；时间为10—50分钟；鳖甲和丝瓜络与纯净水的重量百分比为20-70：600。
E、蒸馏浓缩：将包括药物的萃取药液进行蒸馏，浓缩提取，制得药剂。
本发明所述的B醋淬步骤中，所用500ml浓度为5%--35%的乙酸溶液醋淬；时间为10—60分钟。
本发明所述的E蒸馏浓缩步骤中，将包括药物的萃取液进行蒸馏浓缩提取所需时间为 30分钟—2小时。
本发明所述的A原料制取步骤中，所诉《中国药典》2000版一部附录规定的烫法为：常用的辅料为洁净的沙子、蛤粉或滑石粉；取沙子、蛤粉或滑石粉置锅内，一般用武火炒热后，加入净药材，不断翻动，烫至泡酥或规定的程度时，取出，筛去沙子、蛤粉或滑石粉，放凉；如需醋淬时，应趁热投入醋中淬酥。
本复方制剂的制备方法还可以按上述数据比例同等倍数适当扩大或缩小。
本方剂中鳖甲为鳖科动物鳖的背甲，含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物、钙磷、铁、维生素（A、B1、B2）、尼克酸、动物胶、角蛋白、碘和维生素D等。疏肝解郁，软坚散结，清虚热，通血脉，能滋肝肾之阴而潜纳浮阳。汉代医圣张仲景曾用鳖甲煎丸治疗脾脏肿大。现代研究发现鳖甲可抑制肝、脾组织的增生，调节免疫功能，提高淋巴细胞的转化率，延长抗体存活时间，并促进骨髓造血，有利于防止癌细胞的突变和扩散。日本东京大学医学部的研究人员将甲鱼冷冻粉碎，制成粉末，投喂给接种了癌细胞的老鼠。30天后，结果发现每天喂给甲鱼粉的老鼠体内癌肿缩小了近1/3。体外实验表明，甲鱼的上甲壳能抑制人体肝癌、胃癌细胞的呼吸，用美蓝法试验对肝癌、胃癌、急性淋巴细胞白血病具有抑制组织增生，提高血浆蛋白含量，增强免疫功能。
本方剂中丝瓜络为葫芦科植物丝瓜的干燥成熟果实的维管束，主要化学成分为氨基酸、蛋白质、动物胶、微量元素等。其主要成分为木聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖、皂苷元、齐墩果酸、丝石竹皂苷元和丝石竹皂苷元内酯等。《本草纲目》记载：丝瓜络具有活血化淤，清热化痰，行血脉之功效，民间关于丝瓜络的使用也极为广泛。
本发明所述的复方制剂选用药膳同源的天然物质为原料，无需煎煮、无苦涩感、营养丰富；各组分符合药政法规定，对人体无毒无害，利用各味中药的综合作用治疗肝病，尤其对非病毒性、免疫性肝损伤以及病毒性肝损伤所致的肝纤维化和肝硬化具有预防和治疗作用。

为表明本发明药物制剂对肝病的治疗效果，对本发明做一系列分析及对比实验分别如下：
本制剂对非病毒性、免疫性肝损伤以及病毒性肝损伤所致的肝纤维化和肝硬化的预防和治疗作用的验证
① 对非病毒性、免疫性肝损伤所致的肝纤维化和肝硬化具有预防和治疗作
用，可以通过动物实验分别在以下多方面得到证实，具体内容及过程如下:
实验动物：清洁级wistar雄性大鼠，210±10 g(四川省医学科学院医学实验动物中心提供)。
药品与试剂：40%四氯化碳菜子油溶液(4℃保存备用)，分析纯四氯化碳由天津市化学试剂一厂生产，菜子油为市售精装人体食用成品油；0.9%医用生理盐水系四川科伦药业股份有限公司生产，批号H 51021157；丝瓜络、鳖甲复方制剂由生化实验室制备；白蛋白、球蛋白、丙氨酸氨基转氨酶、天门冬氨酸氨基转氨酶测定试剂盒由北京中生北控生物科技股份有限公司提供；透明质酸测定试剂盒由上海森雄科技实业有限公司提供，其余试剂均为分析纯，水为重蒸水。
实验方法：大鼠适应5天后，随机分为对照组(11只)，模型组(75只)，大剂量组(15只)，小剂量组(15只)；前两周每2天的上午除对照组外，其余各组按5 ml/kg皮下注射40%四氯化碳菜子油溶液，以后每2天的上午注射剂量改为3 ml/kg，对照组以等剂量医用生理盐水代替四氯化碳溶液；各组注射同日的下午，对照组和模型组按0.33 ml/kg皮下注射生理盐水，大、小剂量组分别按0.66、0.33 ml/kg皮下注射复方制剂；除对照组饲喂自来水和普通标准饲料外，其余各组饮用10%的乙醇水(体积比)，且前两周饲喂高脂低蛋白饲料(79.5%玉米面+20%猪油+0.5%的胆固醇)，以后改喂低蛋白饲料(99.5%玉米面+0.5%胆固醇)；在预防阶段中，若大鼠体重比上一次下降10%，则停注四氯化碳溶液一次[5]。两个半月后从模型组随机抽出14只改喂普通标准饲料和自来水进入治疗阶段外，其余大鼠均停食不停水18小时后乙醚麻醉，摘除眼球取血，室温30 min后4000 r/min离心10 min，取血清测定各指标；观察肝脏色泽、形态，肝、脾称重并制作肝脏切片，预防阶段结束。模型组抽出的14只大鼠再随机分成两组进入治疗阶段，每组7只，治疗对照组和治疗组每2天按0.66 ml/kg分别皮下注射生理盐水和复方针剂，均饲喂普通标准饲料和自来水，18天后同法处理各组大鼠。
验证方法：
血液生化指标测定：白蛋白、球蛋白、天门冬氨酸氨基转氨酶、丙氨酸氨基转氨酶、透明质酸酶测定采用试剂盒。
肝脏病理：取肝脏大叶，12%福尔马林固定，石蜡包埋，常规切片，H E染色，光镜下观察各组大鼠肝组织病理学变化。
数据分析：采用STATISTICAL 6.0处理数据，结果以平均值±标准差（）表示，组间比较用t检验，P < 0.05为显著性差异，P < 0.01为极显著性差异。

验证结果：
一、复方鳖甲软肝制剂对非病毒性、免疫性肝损伤所致的肝纤维化、肝硬化的预防作用
造模情况：预防阶段结束时，与对照组相比，模型组大鼠毛色灰暗，行动呆板且活动明显减少，反应迟钝，食量、饮水量都明显减少，大鼠肝、脾脏肿大(表3)，肝脏色泽暗淡，表面可见明显结节及白色颗粒状小突起，边缘凹凸不平，其切片在光镜下大多可见假小叶，肝窦变窄甚至消失，肝索排列紊乱(图1)。ALT、AST、HA较对照组显著升高(P < 0.01)，A、G显著降低(P < 0.01)(表1)，肝硬化造模成功。
表1 复方针剂对大鼠肝功生化指标的影响 (`，n＝7)
组别
A
(g/L)
G
(g/L)
A/G
ALT
(U/L)
AST
(U/L)
HA
(ng/mL)
对照组
40.21±1.92b
37.45±2.92b
1.07±0.02 b
35.46±3.57b
109.53±8.17b
26.20±4.64b
模型组
24.28±2.42
27.17±2.04
0.89±0.03
105.75±6.57
252.54±10.30
38.83±5.02
小剂量组
29.92±4.56
30.69±1.97
0.97±0.06
99.49±7.49
211.63±11.4 b
32.92±6.56
大剂量组
36.14±2.71bc
35.38±1.73a
1.02±0.04 a
74.57±5.96bc
184.53±8.71bc
30.21±4.81a
注： a P < 0.05，b P < 0.01与模型组相比；cP < 0.05与小剂量组相比。
1. 血液生化指标：与对照组比，模型组A、G显著降低(P < 0.01)，ALT、 AST、 HA显著升高(P < 0.01)，A/G倒置。与模型组相比，大剂量针剂组显著升高A (P < 0.01)和G (P < 0.05)，显著降低ALT、AST (P < 0.01)和HA (P < 0.05)。小剂量组显著降低AST (P < 0.05)外，其余肝功指标与模型组相比无统计学意义。大、小剂量组相比，大剂量组显著升高A (P < 0.05)、显著降低AST (P < 0.05)和ALT (P < 0.05)(表1)。说明该针剂对肝硬化具有一定的保肝和抗肝纤维化作用，大剂量效果好于小剂量。

2. 肝脏病理：肝脏读片及评分标准均由四川大学华西公共卫生学院病理教研室执行，除纤维增生计为0、1、2、3、4分五个等级外，其余指标均计0、1、2、3分四个等级，统计各组不同分值下的大鼠数量。模型组肝脏切片光镜下明显可见假小叶，与模型组相比，大剂量组脂肪变性、纤维增生、肝细胞坏死、肝窦血管化程度明显减轻，无一例出现假小叶(图1)。大剂量组除肝细胞水肿外，其余各指标均显著轻于模型组。小剂量组仅肝细胞坏死明显轻于模型组。两剂量组间相比，大剂量组脂肪变性、胞浆凝固、纤维增生、炎细胞浸润程度明显轻于小剂量组(表2)。
表2 大鼠肝脏切片评分情况 (n = 7)
指标

组别
肝细胞水肿
脂肪变性
胞浆凝固
肝细胞坏死
纤维增生
炎细胞浸润
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
4
0
1
2
3
对照组
7
0
0
0
7
0
0
0
7
0
0
0
7
0
0
0
7
0
0
0
0
7
0
0
0
模型组
0
2
3
2
0
0
1
6
0
4
3
0
0
3
4
0
0
0
3
2
2
0
1
2
4
小剂量组
0
3
2
2
0
1
2
4
0
4
3
0
0
6
1
0
0
1
2
3
1
0
1
3
3
大剂量组
0
3
2
2
0
5
2
0
0
7
0
0
0
7
0
0
1
6
0
0
0
1
5
1
0
注：肝细胞水肿数目在同一切片三个不同视野中平均数量小于10%计1分,10-15%计2
分,15-20%计3分；同法可得脂肪变性细胞数量平均小于25%计1分,25-50%计2分,50-75%计3分；胞浆凝固细胞数量平均小于5%计1分,5-10%计2分,10-20%计3分；肝细胞坏死细胞数量平均小于5%计1分,5-10%计2分,10-20%计3分；纤维增生为可见增生计1分,明显可见增生计2分,视野中未形成全部假小叶的计3分,整个视野全部形成假小叶的计4分。
3. 肝、脾指数及死亡率：与对照组相比，模型组大鼠肝、脾明显肿大，肝、脾指数显著偏高(P < 0.01)。与模型组相比，大剂量组肝指数显著偏低(P < 0.05)。两剂量组相比，大剂量组的肝指数显著低于小剂量组(P < 0.05)。除对照组外其余三组虽然肝、脾均有不同程度的肿大，但是大剂量组肝脏肿大程度明显轻于模型组和小剂量组(P < 0.05)，脾指数在三者之间无统计学意义，提示脾肿大可能未受中药影响，死亡率在四组之间两两比较差异较大(表3)。

表3 各组大鼠肝、脾指数及死亡率(`，n＝7)
组别
肝指数
脾指数
死亡率
对照组
3.41±0.26 b
2.31±0.21b
9.1%
模型组
5.65±0.86
4.47±0.74
70.7%
小剂量组
5.16±0.51
3.97±0.53
46.7%
大剂量组
4.02±0.42ac
3.61±0.51
33.3%
注： aP < 0.05，bP < 0.01与模型组相比；cP < 0.05与小剂量组相比。

二、复方针剂对非病毒性、免疫性肝损伤所致的肝纤维化、肝硬化的治疗作用
1. 血液生化指标：在治疗的第5、11、18天分别检测了两组大鼠肝功指标。比较表1和表4可以看出，去除病因后，对照组和治疗组大鼠A和G较以前有所升高，AST、ALT和HA较以前显著降低，说明大鼠在去除病因后存在一定的自愈倾向。与同一时期对照组相比，治疗组在第11天G、AST显著降低(P < 0.05)、HA显著升高(P < 0.05)，第18天时治疗组显著降低AST (P < 0.01)和ALT (P < 0.05)，说明此针剂具有一定的治疗肝硬化效果，但在治疗过程中治疗组A、G和HA并非持续升高或降低，可能由于治疗时间过短，治疗效果未能充分稳定所致(表4)。
表4 复方针剂对肝功生化指标的影响(`，n＝7)
时间
(天)
组别
A
(g/L)
G
(g/L)
A/G
AST
(U/L)
ALT
(U/L)
HA
(ng/mL)
5
对照组
33.38±3.74
39.31±5.33
0.85±0.6
153.36±8.62
59.23±5.57
16.47±1.18
治疗组
35.85±2.77
44.01±5.08
0.81±0.09
141.14±8.25
57.78±4.17
16.31±3.02
11
对照组
29.11±2.79
35.62±3.11
0.82±0.08
152.50±7.43
54.49±7.93
21.19±2.22
治疗组
31.20±1.37
28.59±1.49*
1.09±0.10*
131.61±5.91*
49.16±3.39
28.89±2.44*
18
对照组
34.71±4.95
44.01±5.08
0.79±0.11
148.22±6.50
52.55±4.05
24.49±1.98
治疗组
38.68±2.50
35.89±7.07
1.08±0.09*
117.41±6.44**
41.62±5.23*
26.41±2.11
注： * P < 0.05，** P < 0.01与同一时期对照组相比。

2. 肝脏病理：肝脏读片及评分标准仍由四川大学华西公共卫生学院病理教研室执行，评分标准与预防阶段2.3.2肝脏病理完全相同。与对照组相比，治疗组大鼠肝脏表观色泽大多好于对照组，表面白色小颗粒较少，光镜下观察发现，治疗组肝细胞水肿、胞浆凝固、纤维增生和炎细胞浸润程度总体轻于对照组，但两者仍可见假小叶(图2,表5)。

表5 大鼠肝脏切片评分情况 (n＝7)
指标

组别
肝细胞水肿
脂肪变性
胞浆凝固
肝细胞坏死
纤维增生
炎细胞浸润
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
4
0
1
2
3
对照组
0
0
7
0
0
7
0
0
0
3
4
0
0
7
0
0
0
0
0
2
5
0
0
1
5
治疗组
0
2
5
0
0
7
0
0
0
5
2
0
0
7
0
0
0
1
5
1
0
0
1
3
3

3. 肝、脾指数及死亡率：治疗阶段结束时，两组大鼠均无死亡；对照组肝、脾指数分别为4.16±0.34、3.94±0.48；治疗组肝、脾指数分别为3.98±0.54、3.16±0.21；虽然治疗组肝、脾指数均小于对照组，但无统计学意义。

以上研究结果表明：复方鳖甲软肝制剂对非病毒性、免疫性肝损伤所致的肝纤维化和肝硬化具有预防和治疗作用。

② 对病毒性肝损伤所致的肝纤维化和肝硬化具有预防和治疗作用，可以通
过动物实验分别在以下多方面得到证实，具体内容及过程如下:
实验动物： SPF级Balb/c雄性小鼠48只,8周龄，体重20±2g，购于四川省医学科学院医学实验动物中心。实验分为预防和治疗两个阶段。预防阶段，将健康小鼠随机分为4组：模型组24只，阴性对照组、大剂量组、小剂量组各8只。治疗阶段，将预防阶段模型组抽样后剩余的肝纤维化模型小鼠随机分为阴性对照组和药物治疗组，每组各8只。
药品与试剂：Con A 规格为25 mg/支,购自Sigma 公司。实验时溶于医用生理盐水配成2.5 mg/ml 的溶液。白蛋白(Alb)、总蛋白(TP)测定试剂盒由北京中生北控生物科技股份有限公司提供；丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转氨酶(AST)由南京建成生物工程研究所提供；透明质酸(HA)测定试剂盒，由上海森雄科技实业有限公司提供。由特殊工艺加工而成的丝瓜络、炙鳖甲复方针剂。
实验方法：预防阶段，阴性对照组小鼠按12.5 mg/ kg的剂量尾静脉注射生理盐水，其余各组等剂量尾静脉注射Con A溶液。每周1次，持续9周。同时，丝瓜络,炙鳖甲复方针剂按大（6.6ml/kg）、小（3.3ml/kg）剂量组皮下注射给药。阴性对照组和模型组则按6.6ml/kg的剂量皮下注射生理盐水，每3天1次，持续9周。9周后抽样6只模型组小鼠，摘除眼球取血，室温放置30 min后以4000 r/min离心10 min，取血清测定各指标，观察肝脏外表，切取肝大叶,10%福尔马林固定,石蜡包埋,常规切片,HE染色,光镜下观察肝组织病理学变化。确认造模成功后，马上以同样方法处理阴性对照、大、小剂量各组小鼠。
治疗阶段，阴性对照组小鼠按6.6ml/kg的剂量皮下注射生理盐水，药物治疗组小鼠按6.6ml/kg的剂量皮下注射瓜络,炙鳖甲复方针剂，持续31天。在此期间每周每组抽样6只小鼠做毛细管穿刺眼眶静脉丛取血，制备血清，测定各项指标，动态观测小鼠的治疗情况。
验证方法：
血液生化指标测定：白蛋白、球蛋白、天门冬氨酸氨基转氨酶、丙氨酸氨基转氨酶、透明质酸酶测定采用试剂盒。
肝脏病理：取肝脏大叶，12%福尔马林固定，石蜡包埋，常规切片，H E染色，光镜下观察各组大鼠肝组织病理学变化。
数据分析：采用STATISTICAL 6.0处理数据，结果以平均值±标准差（）表示，组间比较用t检验，P < 0.05为显著性差异，P < 0.01为极显著性差异。
验证结果：
一、复方鳖甲软肝制剂对病毒性肝损伤所致的肝纤维化、肝硬化的预防作用
造模情况：预防阶段进行到4周以后，模型组与阴性对组相比明显出现了食欲不振，体毛凌乱，毛色灰暗，反应迟钝等现象。预防阶段结束后取出肝脏肉眼观察也可发现模型组小鼠肝脏色泽暗淡,边缘凹凸不平。血清检测结果(表1)显示模型组ALT，AST，HA较阴性对照组皆极显著偏高 (P < 0.01)，G，A/G极显著降低 (P < 0.01)。这说明肝纤维化模型的构建是成功的。但是，血清检测中白蛋白这一项模型组与阴性对照组相比并没有出现预期的显著性差异，估计是因为白蛋白的半衰期长达19天[11]，虽然模型组小鼠在肝损伤后减少了白蛋白的合成，肝损伤之前合成的白蛋白并没有及时的分解掉，造成了检测结果中模型组的暂时性假偏高。值得一提的是，药剂组的白蛋白合成量与模型组、阴性对照组相比偏高，其中小剂量组产生了显著性偏高(P < 0.05)。这个现象说明复合针剂可以提高肝脏白蛋白的合成能力，可能具有增强机体免疫的功效。
1、血液生化指标：与模型组相比，小剂量组除能极显著降低A/G (P<0.01)之外,还能显著提高A/G（0.05）和显著降低ALT、AST (P<0.05)，但是大部分指标都与阴性对照组有显著性差异(A、ALT、AST，P<0.05)。而大剂量组则能显著降低G(P<0.05)、ALT、AST(P<0.01)，显著提高A/G(P<0.01)，而且各项指标都非常接近与阴性对照组（P>0.05）。与小剂量组相比,大剂量组显著降低ALT、AST(P<0.05)(表6)。说明此针剂对肝硬化具有一定的保肝和抗肝纤维化作用，且药效具有剂量依赖性。

表6 复方针剂对小鼠肝功指标的影响(`x ±SD，n＝6)
组别
A
(g/L)
G
(g/L)
A/G
ALT
(U/L)
AST
(U/L)
HA
(ng/mL)
对照组
32.49±1.36
24.90±1.57**
1.31±0.12
**
32.14±5.15
**
84.39±12.15
**
9.95±4.40
**
模型组
31.99±2.02
30.25±2.34
1.06±0.12
60.55±9.21
△△
142.83±15.72
△△
25.87±4.66
大剂量组
32.41±2.13
25.44±1.98**
1.36±0.07
**
35.30±6.59
**▲
91.35±7.31
**▲
-
小剂量组
34.69±1.37
*△
26.07±0.68*
1.32±0.06
**
45.46±8.92
*▲△
111.30±16.93
*△▲
-
t检验：与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01,与阴性对照相比△P<0.05,
△△P<0.01,大小剂量组相比，▲P<0.05, ▲▲P<0.01

2. 肝脏病理：模型组小鼠肝细胞严重水肿，大量肝细胞坏死，脂肪变性，汇管区内炎细胞浸润严重，局部区域出现明显的纤维增生 (图3) 。与模型组相比，大剂量组细胞坏死，炎细胞浸润，纤维增生的情况已经基本消失，细胞水肿，脂肪变性，胞浆凝集的病变程度也得到极大的缓解。小剂量组虽然也在一定程度上减轻了各种病变，但是其效果远远比不上大剂量组(表7)。这就说明复合针剂可以有效的保护肝细胞, 防止肝细胞的变性坏死，从而阻断纤维增生的发生和发展。并且，这种效果是有剂量依赖性的。肝脏读片及评分标准均由四川大学华西公共卫生学院病理教研室执行，除纤维增生计为0、1、2、3、4分五个等级外，其余指标均计0、1、2、3分四个等级。

表7 各组小鼠肝脏切片评分情况
指标

组别
肝细胞水肿
脂肪变性
胞浆凝固
肝细胞坏死
纤维增生
炎细胞浸润
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
4
0
1
2
3
对照组
7
0
0
0
7
0
0
0
7
0
0
0
7
0
0
0
7
0
0
0
0
7
0
0
0
模型组
0
0
4
3
0
1
4
2
0
4
3
0
0
0
6
1
0
5
1
1
2
0
1
5
1
小剂量组
0
0
5
2
0
2
5
0
0
7
0
0
1
6
0
0
3
4
0
0
1
1
5
1
0
大剂量组
0
3
3
1
1
4
2
0
3
4
0
0
6
0
1
0
6
1
0
0
0
6
0
1
0
注：肝细胞水肿数目在同一切片三个不同视野中平均数量小于10%计1分,10-15%计2分,15-20%计3分；同法可得脂肪变性细胞数量平均小于25%计1分,25-50%计2分,50-75%计3分；胞浆凝固细胞数量平均小于5%计1分,5-10%计2分,10-20%计3分；肝细胞坏死细胞数量平均小于5%计1分,5-10%计2分,10-20%计3分；纤维增生为可见增生计1分,明显可见增生计2分,视野中未形成全部假小叶的计3分,整个视野全部形成假小叶的计4分。

二、复方针剂对病毒性肝损伤所致的肝纤维化、肝硬化的治疗作用
1. 血液生化指标：在治疗的一个月内对两组小鼠作了4次血样抽查。结果显示，去除病因后,阴性对照组的ALT、HA的发展趋势是降低的，是良性发展的。这说明小鼠有一定的自愈能力。但即便如此,与同一时期阴性对照组相比，药物治疗组依然体现了它愈合在程度方面的显著差异(表8)。而且，ALT、HA在经过31天的治疗后都基本接近正常值。这说明剂量为6.6 ml/kg的复合针剂对Con A诱导的肝损伤是有一定治疗效果的。

表8 复方针剂对小鼠肝功指标的影响(`x ±SD，n＝6)
时间
(天)
组别
A
(g/L)
ALT
(U/L)
HA
(ng/mL)
0
对照组
31.99±2.02
60.55±9.21
25.87±4.66
治疗组
31.99±2.02
60.55±9.21
25.87±4.66
10
对照组
34.70±5.58
61.50±11.37*
25.87±4.66
治疗组
37.62±2.42
47.27±8.70*
23.55±5.27
16
对照组
32.40±1.96
69.39±11.23**
28.79±3.63**
治疗组
33.21±2.69
38.51±8.39**
9.96±1.97 **
24
对照组
30.73±1.84
59.22 ±9.66*
19.09±4.99*
治疗组
31.69±2.46
44.53±9.78*
13.05±2.17*
31
对照组
34.66±2.41
54.24±9.25**
21.17±5.49**
治疗组
34.87±2.43
34.96±9.37**
7.47±1.40**
t检验：对照组与治疗组相比，P*<0.05，P**<0.01

2. 肝脏病理：光镜观察结果(图4)显示，阴性对照组的肝细胞水肿和胞浆凝集的症状已经恶化，其它症状有缓解的趋势，但是其中脂肪变性和肝细胞坏死的症状的缓解情况比较轻微。这种现象说明，小鼠本身是有一定的自愈能力的。与阴性对照组相比，药物治疗组的所有肝脏病变指标都有不同程度的改善，而且部分指标已经趋于正常，其中以肝细胞坏死，肝脏炎性细胞浸润和纤维增生最为显著（表9）。这就说明，复合针剂对Con A诱导的免疫性肝损伤是有一定治疗效果的，它可以有效的清除坏死的肝细胞，加快降解增生的纤维组织，从而使病变的肝脏趋于正常。

表9 小鼠肝脏切片评分情况
指标

组别
肝细胞水肿
脂肪变性
胞浆凝固
肝细胞坏死
纤维增生
炎细胞浸润
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
4
0
1
2
3
对照组
0
1
2
3
0
4
2
0
0
3
3
0
0
1
4
1
2
4
0
0
5
2
3
1
0
治疗组
1
5
0
0
1
3
2
0
2
4
0
0
4
2
0
0
6
0
0
0
0
6
0
0
0

以上研究结果表明：复方鳖甲软肝制剂对病毒性肝损伤所致的肝纤维化和肝硬化具有预防和治疗作用。

附图说明
图1中A、B、C、D分别是在非病毒性、免疫性肝损伤所致的肝纤维化、肝硬化预防阶段结束时对照组、模型组、小剂量组、大剂量组大鼠肝脏切片 (HE染色，´40)。
图2中A、B分别是在非病毒性、免疫性肝损伤所致的肝纤维化、肝硬化治疗阶段结束时对照组和治疗租大鼠肝脏切片(HE染色，´40)。
图3中A、B、C、D分别是在病毒性肝损伤所致的肝纤维化、肝硬化预防阶段结束时对照组、模型组、小剂量组、大剂量组小鼠肝脏切片 (HE染色，´40)。
图4中A、B分别是在病毒性肝损伤所致的肝纤维化、肝硬化治疗阶段结束时对照组和治疗租小鼠肝脏切片(HE染色，´40)。

具体实施方式
实施例1
本发明制剂是由鳖甲和丝瓜络按照下列重量配比:
鳖甲 10克 丝瓜络 20克 。
本发明所述中药制剂的制备方法包括下列步骤
A、原料制取：
1、选取和炮制处理鳖甲：
选取脊椎动物鳖科鳖的背甲。称取鳖甲10克，按照《中国药典》2000版一部附录规定的烫法进行炮制处理，用沙炒至表面淡黄色，筛滤取出。
2、选取和处理丝瓜络
将丝瓜络20克碾制成粉末，备用；
B、醋淬：将炮制处理后的鳖甲趁热用500ml浓度为35%的乙酸溶液醋淬；
C、烘干：捞出鳖甲，除去残肉，用清水洗净，再放入60℃鼓风烘箱中烘干待用；
D、混合萃取：将烘干后的鳖甲与制成粉末的丝瓜络一起放入烧瓶中，倒入纯净水600ml；将烧瓶放入微波炉中，用微波强度为250W萃取；时间为50分钟；鳖甲和丝瓜络与纯净水的重量百分比为20：600。
E、蒸馏浓缩：将包括药物的萃取药液进行蒸馏，浓缩提取，制得药剂。
本发明所述的B醋淬步骤中，所用500ml浓度为35%的乙酸溶液醋淬；时间为60分钟。
本发明所述的E蒸馏浓缩步骤中，将包括药物的萃取液进行蒸馏浓缩提取所需时间为 30分钟。
本发明所述的A原料制取步骤中，所诉《中国药典》2000版一部附录规定的烫法为：常用的辅料为洁净的沙子、蛤粉或滑石粉；取沙子、蛤粉或滑石粉置锅内，一般用武火炒热后，加入净药材，不断翻动，烫至泡酥或规定的程度时，取出，筛去沙子、蛤粉或滑石粉，放凉；如需醋淬时，应趁热投入醋中淬酥。
本发明所述中药制剂是任何一种药剂学上所说的剂型为针剂，按照常规的针剂制备方法获得。

实施例2
同样道理
本发明制剂是由鳖甲和丝瓜络按照下列重量配比:鳖60 克，丝瓜络3克。
本发明所述中药制剂的制备方法包括下列步骤
A、原料制取：
1、选取和炮制处理鳖甲：
选取脊椎动物鳖科鳖的背甲。称取鳖甲60 克，按照《中国药典》2000版一部附录规定的烫法进行炮制处理，用沙炒至表面淡黄色，筛滤取出。
2、选取和处理丝瓜络
将丝瓜络3克碾制成粉末，备用；
B、醋淬：将炮制处理后的鳖甲趁热用500ml浓度为5%%的乙酸溶液醋淬；
C、烘干：捞出鳖甲，除去残肉，用清水洗净，再放入60℃鼓风烘箱中烘干待用；
D、混合萃取：将烘干后的鳖甲与制成粉末的丝瓜络一起放入烧瓶中，倒入纯净水150ml；将烧瓶放入微波炉中，用微波强度为600W萃取；时间为10分钟；鳖甲和丝瓜络与纯净水的重量百分比为70：600。
E、蒸馏浓缩：将包括药物的萃取药液进行蒸馏，浓缩提取，制得药剂。
本发明所述的B醋淬步骤中，所用500ml浓度为5%%的乙酸溶液醋淬；时间为10分钟。
本发明所述的E蒸馏浓缩步骤中，将包括药物的萃取液进行蒸馏浓缩提取所需时间为2小时。
本发明所述中药制剂是任何一种药剂学上所说的剂型为针剂，按照常规的散剂制备方法获得。
实施例3
本发明制剂是由鳖甲和丝瓜络按照下列重量配比:
鳖甲 40克 丝瓜络 10克 。
本发明所述中药制剂的制备方法包括下列步骤
A、原料制取：
1、选取和炮制处理鳖甲：
选取脊椎动物鳖科鳖的背甲。称取鳖甲40 克，按照《中国药典》2000版一部附录规定的烫法进行炮制处理，用沙炒至表面淡黄色，筛滤取出。
2、选取和处理丝瓜络
将丝瓜络10克碾制成粉末，备用；
B、醋淬：将炮制处理后的鳖甲趁热用500ml浓度为25%的乙酸溶液醋淬；
C、烘干：捞出鳖甲，除去残肉，用清水洗净，再放入60℃鼓风烘箱中烘干待用；
D、混合萃取：将烘干后的鳖甲与制成粉末的丝瓜络一起放