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目录( 共十一章, 包括绪论)
绪论
第一章 实验室设备和一般技术
第二章 培养基及其配制
第三章 外植体的选择和灭菌
第四章 外植体的接种和培养
第五章 愈伤组织的培养
第六章 营养器官培养
第七章 植物快速繁殖和脱毒
第八章 细胞培养
第九章 原生质体培养和体细胞杂交
第十章 种质保存
参考书目: 请链接参考书目.

( 优酷网上的视频请插入到绪论中)
绪论

知识点: 1.掌握植物细胞工程的概念及相关的专有名词
　　　　2.理解细胞全能性理论
　　　　3.掌握植物细胞离体培养发生的途径
　　　　4.了解植物细胞工程的应用

一． 植物细胞工程( plant cell engineering) 概念
植物细胞工程是指植物在细胞水平上进行的遗传操作。其相关的理论和技术主要是: 植物生理学、 细胞生物学和分子生物学等。
植物组织培养( plant tissue culture) :在无菌条件下将离体的植物器官、 组织、 细胞或原生质体培养在人工配制的培养基上, 人为控制培养条件, 使其生长、 分化、 增殖发育成完整植株或生产次生代谢物质的过程和技术, 也叫离体培养( in vitro culture)
相关的专有名词:
外植体( explant) : 从植物体上切取下来用以培养的材料。
愈伤组织(callus): 由外植体增殖而形成的一种无特定结构和功能的细胞团。
继代培养(subculture): 由最初的外植体上切下新增殖的组织, 继续转入新的培养基上培养的过程。
胚状体(embryoid): 在离体培养过程中, 起源于非合子, 并经过胚胎发育过程分化出的类似胚的细胞群。
分化(differentiation): 导致细胞或组织形成不同结构并引起功能或潜在发育方式改变的一种过程。
脱分化(dedifferentiation): 原已分化的细胞失去原有的形态和机能, 又回复到没有分化的无组织的细胞团或愈伤组织的过程。
再分化(redifferentiation): 由脱分化状态的细胞再度分化形成另一种或几种类型的细胞的过程。
无性繁殖系(clone): 由同一外植体重复进行继代培养后所得的一系列无性繁殖后代。

二、 植物细胞工程的理论基础——细胞全能性
1.细胞全能性( cell totipotency) :每个植物细胞都具有该植物的全部遗传信息, 在合适的培养条件下都有发育成完整植株的潜在能力。
　　植物细胞全能性是经过生命周期、 细胞周期和组织培养周期来实现的。( P2, 图绪-1, 做成小动画)
2、 植物离体组织或器官分化成植株的途径
( Ｐ3, 图绪-2, 做成小动画)

三、 植物细胞工程的技术特点:
1.培养材料经济
经过植物细胞工程能使植物体的单个细胞、 小块组织、 茎段等离体材料经培养获得再生植株能够保证材料来源单一和遗传背景一致, 有利于试验成功, 对于新品种的推广和良种复状更新, 特别是名、 优、 特、 新的品种保存、 利用与开发有很高的应用价值和重要的实践意义。
2.培养条件可人为控制
植物细胞工程所采用的植物材料完全是人为提供的培养基和小气候环境条件下生长, 摆脱了大自然中四季、 昼夜的变化及灾害性气候的不利影响, 且条件均一, 对植物生长极为有利, 便于稳定地进行组培苗的周年生产。
3.生长周期短, 繁殖率高
4.管理方便, 利于工厂化生产和自动化控制

四、 植物细胞工程的应用
1.种苗快速繁殖
应用植物细胞工程繁殖种苗, 具有繁殖速度快、 繁殖系数高、 繁殖周期短、 能周年生产等特点, 再加上培养材料和所培养出的组培苗的小型化, 这就能达到在有限的空间内短期培养出大量的种苗, 远比常规嫁接、 扦插、 压条、 分株繁殖快得多。如1个兰花外植体一年可繁殖400万个原球茎, 1个草莓芽一年内可繁殖108个芽
2.苗木脱毒
3.培育新品种
具体应用方法: ( 1) 经过花药培养和花粉培养, 进行单倍体育种; 　
　　　　　　 ( 2) 经过胚胎培养, 使杂种胚发育成熟, 实现远缘杂交, 并缩短育种年限;
　　　　　　 ( 3) 经过原生质体融合和体细胞杂交, 可部分克服有性杂交不亲合性, 获得体细胞杂种, 从而创造新种或育成优良品种;
　　　　　　 ( 4) 在组织培养条件下开展基因工程育种;
　　　　　　 ( 5) 经过有用的细胞突变体的筛选和培养, 育成新品种。
4.种质保存和基因库的建立
5.药用植物的工厂化生产
请插入图片Ｐ0110, 0116, 0117, 0120, 0114, 0097, 0063, 试管开花图片
信息链接: 中国组培网:

作业:
1. 名词解释: 外植体、 细胞全能性、 愈伤组织、 脱分化、 再分化、 胚状体、 继代培养、 无性繁殖系
2. 植物离体组织或器官分化成植株的途径有哪些?
3. 结合实际, 谈谈植物细胞工程在农、 林、 医等的应用。

　( 优酷网上搜索的组织培养的植物组织培养及其应用2视频请插入到绪论中)

第一章 　实验室设备和一般技术
知识点: 1.理解实验室的设计原则与总体要求
　　　　2.掌握实验室的设计与组成
　　　　3.掌握常见仪器设备的使用方法
技能目标: 1.能根据需要和实际情况科学设计实验室和育苗工厂
　　　　　2.熟练使用组织培养的仪器设备

第一节 实验室的设计
一. 实验室的设计原则与总体要求
（一） 设计原则
（1） 防止污染
（2） 按照工艺流程科学设计, 经济、 实用和高效
（3） 结构和布局合理, 工作方便, 节能、 安全
（4） 规划设计与工作目的、 规模及当地条件等相适应
（二） 总体要求
（1） 实验室选址要求避开污染源, 水电供应充分。
（2） 保证实验室环境清洁。
（3） 实验室建造时, 应采用产生灰尘最少的建筑材料; 墙壁和天花板、 地面的交界处宜做成弧形, 便于日常清洁; 管道要尽量暗装, 安排好暗敷管道的走向, 便于日后的维修, 并能确保在维修时不造成污染; 洗手池、 下水道的位置要适宜, 不得对培养带来污染, 下水道开口位置应对实验室的洁净度影响最小, 并有避免污染的措施; 设置防止昆虫、 鸟类、 鼠类等动物进入的设施。
（4） 接种室、 培养室装修材料还须经得起消毒、 清洁和冲洗, 并设置能确保与其洁净度相应的控温控湿的设施。
（5） 实验室电源应经专业部门设计、 安装和验证合格后方可使用。
二. 实验室的基本组成
（一） 通用实验室
（二） 接种室( 无菌操作室外要有缓冲间)
无菌操作室基本要求是: 干净无菌、 密闭、 光线好。一般安装滑动门, 使空气不致流动, 以防外界菌及尘埃的侵入; 墙壁光滑平整, 地面平坦无逢, 便于清洁工作; 室内安装紫外灯, 以便灭菌, 还要有照明装置及灯座, 以备临时增加设备之用; 小的无菌操作室一般一间5~7㎡即可
（三） 培养室
需配有固定式培养架、 旋转式培养架、 转床和摇床、 控温控光设备, 以满足器官( 芽、 茎、 花药等) 、 愈伤组织、 细胞和原生质体的固体和液体培养的需要。
（四） 洗涤室
洗涤室需备有工作台面、 上水管和下水管、 水池、 落水架、 电源、 干燥箱等。
(五) 　细胞学观察室
　　用于观察、 记录培养材料的生长情况及结果。室内要有固定的水磨石或瓷砖台板, 以放置显微镜、 解剖镜、 倒置显微镜及照相设备等仪器。
(六) 驯化移栽室
　　用于试管苗的移栽。一般在温室或塑料大棚内进行。室内备有弥雾装置、 遮荫网、 移植床等设施; 钵、 盆、 移植盘等移植容器; 草炭、 蛭石、 沙子等移植基质。试管苗移植一般要求温室温度在15℃-35℃, 相对湿度70%以上。
第二节 常见设备和器材
一. 高压蒸气灭菌锅
对灭菌起作用的重要的是温度而不是压力。消毒灭菌时, 压力表读数为1.1kgf·cm-2或0.1MPa, 121℃时保持15-20min。有立式与卧式两种。(插入图片)
( 其使用能否制作成一flash动画? )
二． 精密pＨ计
(插入图片)
三． 超净工作台
一般由鼓风机、 滤板、 操作台、 紫外灯和照明灯等部分组成。
在每次操作之前, 要把实验材料和需使用的各种器械、 药品等先放入台内, 不要中途拿进。同时台面上放置的东西也不宜太多, 特别注意不要把物件堆得太高, 以免挡住气流。在使用超净工作台时应注意安全, 当台面上的酒精灯已经点燃以后, 千万不要再喷洒酒精消毒台面, 否则很易引起火灾。(插入图片)
四、 摇床
在液体培养中, 为了改进浸于液体培养中的培养材料的通气状况, 可使用摇床( 振荡培养机) 或旋转床( 旋转培养机) ( 插入图片)
五、 培养架
供旋转培养瓶用, 用三角铁制即可, 每层隔板可用玻璃制成。( 插入图片)
六、 显微镜
七、 电子天平

作业:
1. 将细胞工程常见的设备、 用具与所属的分室用线连起来
　　　高压灭菌锅
超净工作台　　　　　　
电子天平　　　　　　　配制室
冰箱　　　　　　　　　接种室
空调机　　　　　　　　培养室
培养基灌装机　　　　　灭菌室
光照定时器　　　　　　洗涤室
紫外灯　　　　　　　　观察室
晾干架

２.植物细胞工程实验室一般分成几个部分? 各部分的功能是什么?
3. 植物细胞工程实验室必备的设备有哪些?

第二章 培养基及其配制
知识点: 1.掌握培养基的组成
2.了解配制培养基之前需配母液( 贮备液)
3.掌握配制培养基母液的优点及配制方法
4.掌握培养基的灭菌技术
技能目标: 1.能够科学合理筛选和优化培养基
2.熟练配制培养基和灭菌( 后添加)

第一节 培养基的成分
一． 无机盐
包括大量元素: Ｃ、 Ｈ、 Ｏ、 Ｎ、 Ｐ、 Ｓ、 Ｋ、 Ｃa、 Ｃl、 Ｍg( 植物所需浓度大于0.5mmol/L)
微量元素: Ｆe、 Ｂ、 Ｍn、 Ｚn、 Ｃo、 Ｍo、 Ｃu等( 植物所需浓度小于0.5mmol/L)

温馨提示: 用酒石酸钠钾和柠檬酸替代Na2-EDTA作为Fe2+的螯合剂, 有时效果更加。但螯合剂对某些酶系统和培养物的形成有一定的影响, 使用时应慎重哦。( 请用比较生动有趣的画面显示这段文字, 或者加一个小动物来手指)
二、 碳源和能源
　　植物组织培养中被培养的外植体因光合作用能力低, 需要在培养基中添加一些碳水化合物作为生长发育的能源。一般添加蔗糖、 葡萄糖和果糖, 其中以蔗糖最常见且效果也最好, 它不但作为碳源和能源还具有维持培养基一定渗透压的作用。蔗糖作为碳源对离体的双子叶植物的根生长最好, 而葡萄糖则对单子叶植物的根生长较好。
温馨提示( 处理同上) : 蔗糖在高温高压下会部分水解, 形成葡萄糖和果糖, 更易被植物细胞吸收利用。若在酸性环境中, 这种水解更加迅速。如果以葡萄糖或果糖为碳源配制成的培养基需要过滤后才会有好的培养结果, 否则培养物经过高温高压灭菌, 会产生对细胞有害的糖与有机氮的复合物, 从而妨碍细胞的生长。
三、 维生素
维生素与植物体内各种酶的形成有关。在植物组织培养中一般以Ｂ族维生素为主, 其中以维生素B1、 维生素Ｂ6、 烟酸、 维生素Ｂ12、 生物素及维生素Ｃ、 肌醇最常见。
四、 氨基酸及有机附加物
氨基酸是良好的有机氮源, 可直接被细胞吸收利用, 在培养中含有无机氮的情况下, 更能发挥其作用, 主要有Gly、 Ser、 Tyr、 Gln、 Asn等及多种氨基酸的混合物( 如ＣＨ、 ＬＨ)
在某些植物组织培养中还加入一些天然有机物, 如: 椰子汁、 香蕉泥、 番茄汁、 酵母提取等。其作用是提供一些的微量营养成分、 生理活性物质和生长激素等。
五、 植物生长调节物质
生长调节物质是培养基中不可缺少的关键物质, 其用量极少, 但它们对外植体愈伤组织的诱导和器官的分化起着重要的调节作用, 其中以生长素类和细胞分裂素类最为常见。
1. 生长素类:
活性强弱为2, 4-Ｄ＞ＮＡＡ＞ＩＢＡ＞ＩＡＡ, 活性比为: ＩＡＡ: ＮＡＡ: 2, 4-Ｄ＝1: 10: 100
作用主要用于诱导愈伤组织的形成, 促进根的生长, 协助细胞分裂素促进细胞分裂和伸长。
ＩＡＡ不耐光和热, 易受到植物体内酶的分解, 其它生长素对热和光均稳定, 一般用少量95％酒精或1mol/L的NaOH溶液助溶。
2. 细胞分裂素
活性强弱为ＴＤＺ, 4-ＰＵ＞ＺＴ＞2-iＰ＞6-ＢＡ＞ＫＴ, 最常见的是人工合成、 性能稳定且价格适中的ＫＴ和6-ＢＡ。
在植物组织培养中, 其作用是抑制顶端优势, 促进侧芽的生长。
所有细胞分裂素对光、 稀酸和热均稳定, 但它的溶液在常温中时间长了会丧失活性。细胞分裂素能溶解于稀酸和稀碱中, 在配制时常见稀ＨＣl助溶。
温馨提示: 有时购买的6-ＢＡ或其它细胞分裂素在稀酸中不能溶解, 可用热蒸馏水助溶, 你会收到意想不到的惊喜哦。

六、 琼脂
海藻中提取的一种高分子碳水化合物, 主要作用是使培养基在常温下凝固。用量一般是6-10g/L。
七、 滤纸桥
在解决生根难的问题上经常采用。方法是将一张较厚的滤纸折叠成M形, 放入液体培养基中, 再将培养材料放在M形的中间凹陷处, 这样培养物可经过滤纸的虹吸作用不断从培养液中吸收营养和水分, 可保持足够的氧气。
八、 活性炭
加入活性炭主要是利用其吸附能力, 减少一些有害物质的影响, 如能够吸附一些酚类物质从而减轻组织的褐化( 在兰花组培中作用效果明显) ; 还能够创造暗环境, 有利于生根。温馨提示: 活性炭有木质和骨质之分, 一般挑选大颗粒活性炭用于组培效果好, 但价格较高, 小颗粒活性炭易沉淀在培养基的底部而影响培养效果。使用时要注意活性炭没有选择性, 既能吸附有害物质也能吸附有益物质, 特别是活性物质, 因此使用时应慎重。另外, 高浓度活性炭还削弱琼脂的凝固能力, 因此添加后要提高培养基中琼脂的含量。
九、 抗生素
主要有青霉素、 链霉素、 庆大霉素等, 用量为5-20mg/L。添加抗生素可防止菌类污染, 减少培养过程中材料的损失, 节约人力、 物力和节省时间。

第二节　　培养基的配制
一、 配制培养基母液
1. 目的: 节省配制时间, 保证配制的准确性和配制时的快速移取, 极大提高了工作效率, 便于低温保藏。
2. 配制方法
以MS培养基为例, 首先应该配制大量元素、 微量元素、 维生素和氨基酸等有机物、 铁盐和植物生物调节物质母液。配制时注意大量元素中的各种化合物一定要分别溶解后再倒入容量瓶中; 铁盐中的Na2-EDTA和FeSO4要分别溶解后, 然后将Na2-EDTA慢慢倒入FeSO4中; 植物生长调节物质需要使用助溶剂。
温馨提示: 2, 4-D用少量95%乙醇溶解效果比NaOH好; NAA先用少量95%乙醇溶后再用热水溶解。
母液的吸取量＝配制体积/扩大倍数
3. 配制程序
P25的图2-1做成动画或下载视频。

第三节　实验方案的设计
组织培养的目的是诱导培养物朝所预先设计的方向发展, 因此首要问题是找出最佳培养基及培养条件。一个好的实验设计方案将取得事半功倍的效果。
1. 单因子实验设计
在选择适当的激素种类和浓度配比上使用最多。单因子实验就是在实验过程中保持其它因素不变, 只改动其中一种因素, 从而找出这一因素对培养材料的影响及影响程度。( 一般每个处理至少10接种瓶, 每瓶至少3块培养物或3丛小幼苗)
2. 正交实验设计
植物离体培养的成功一般是由多种因素决定的, 正交设计能够方便的从众多因素中选出主要的影响因素及最佳水平, 能够由较少实验得到较多的信息。
例: 一个7因素2个水平的实验, 若将各因素水平全部组合都做一遍的话, 则需要27＝128次实验。若采用正交设计只需要做8次实验即可。虽然实验次数减少, 但因各因素水平搭配均匀, 8次实验基本代表了全部实验情况。
主要工具: 正交表
例: 假设影响某种植物试管苗生长的因素有光照时间( 10h、 14h) 、 光照强度( 1000lx、 lx) 、 pH(5.5、 5.8)、 温度(20℃、 25℃)、 蔗糖浓度(2%、 4%)、 BA浓度(0.5mol/L、 2.0 mol/L)、 NAA浓度(0.5 mol/L、 1.0 mol/L)等7个因子, 每个因子选择2个水平, 选择正交表L8( 27) , 将各个因素水平对号入座填表。
　　　　　1　　　　2　　　　3　　　　4　　　　5　　　　6　　　　7
1　　　　 1 1 1 1 1 1 1
2 1 1 1 2 2 2 2
3 1 2 2 1 1 2 2
4 1 2 2 2 2 1 1
5 2 1 2 1 2 1 2
6 2 1 2 2 1 2 1
7 2 2 1 1 2 2 1
8 2 2 1 2 1 1 2
根据8个实验的结果, 如: 出苗数量、 苗高、 生根数、 移栽成活率等, 综合考虑, 根据需要选取最适培养条件。也可经过一定的计算方法( 参考生物统计学书) 算出极差( R) , 极差( R) 表示各个因素在实验中所起作用的大小, R越大表示该因素的不同水平对实验结果的影响越大。

作业: ( 一) 计算题
1． 请您计算如何配制MS培养基的大量元素( 10倍) 200 ml各需KNO3、 NH4NO3、 MgSO4·7H2O、 KH2PO4、 CaCl2·2H2O多少mg?
2． 请您计算配制MS培养基的铁盐( 100倍) 各需Na2—EDTA和FeSO4·7H2O 多少mg?
3． 请您分别配制6—BA、 2, 4—D、 NAA( 0.5mg/ml) 50ml需6—BA、 2, 4—D、 NAA多少mg? 它们分别用什么少量溶解后用水定容?
4． 配制MS培养基200 ml需分别吸取大量元素( 10倍) 、 微量元素( 1000倍) 、 铁盐
( 100倍) 、 有机物( 100倍) 母液各多少ml? 培养基中若NAA0.5mg/L、 NAA0.2mg/L、
2,4-D0.5mg/L、 6-BA0.5 mg/L、 6-BA1.0mg/L和6-BA2.0mg/L分别从植物激素的母液( 0.5mg/ml) 中取多少ml? 该培养基中琼脂( 0.8%) 和蔗糖( 3%) 又需琼脂和蔗糖分别是多少mg?
( 二) 思考题
1.培养基包括哪些成分, 为何要配制培养基母液? 配制培养基母液时应注意什么?
2.如何筛选出最佳培养基?

第三章 外植体的选择与灭菌
知识点: 掌握外植体的选择与处理方法及常见的的消毒方法
技能目标: 能够正确选择和处理外植体

第一节 外植体的选择
一、 外植体的选择原则
1. 植物的基因型
一般来说, 草本植物易于木本植物; 双子叶植物易于单子叶植物。
2. 取材的部位
确定取材部位时, 一方面要考虑培养材料的来源是否有保证和容易成苗; 另一方面要考虑经过脱分化产生的愈伤组织的培养途径是否会引起不良变异, 丧失原品种的优良性状。( 较多用茎尖和叶片)
3. 取材季节
对大多数植物而言, 应在其生长开始的季节采样, 若在生长末期或已进入休眠期时取样, 则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应。
4. 器官的生理状态和发育年龄
一般情况下, 越细嫩、 年限越短的组织越具有较高的形态发生能力, 组织培养越易成功。
5. 植物的长势
生长健壮的器官或组织代谢旺盛, 再生能力强, 培养容易成功。
6. 外植体的大小
选择外植体的大小, 应根据培养目的而定。如果是胚胎培养或脱毒, 则外植体宜小; 如果是进行快速繁殖, 外植体宜大。但外植体过大, 消毒往往不彻底, 易造成污染; 过小则离体培养难于成活。
二、 外植体的预处理( 请链接此视频)
1.　喷杀虫剂、 杀菌剂及套袋
2.　室内盆栽
3.　外植体的修整
　　按教材P35的各器官的预处理进行
三、 灭菌与消毒的区别
1. 消毒是指杀灭或清除传播媒介上的病原微生物, 使之达到无害化的处理。
2. 灭菌是指杀灭或清除传播媒介上的所有微生物( 包括芽胞) , 使之达到无菌程度。
两者的主要区别在于灭菌杀菌强烈, 能杀死所有活细胞; 消毒作用则缓和, 主要是杀死或抑制在植物材料表面的微生物, 但芽孢、 厚垣孢子一般不会死亡。灭菌可包括消毒, 而消毒却不能代替灭菌。
四、 灭菌方法
1. 物理灭菌
包括: 过滤除菌( 请链接针头式滤菌器和抽滤瓶两张图片)
　　　热力灭菌: 干热灭菌( 灼烧和烘烤灭菌) 和湿热灭菌( 煮沸灭菌和压力蒸汽灭菌)
　　　辐射灭菌: 电离辐射、 紫外辐射、 超声波、 微波( 2540MHZ和915MHZ)
2. 化学灭菌
包括: 1) 熏蒸灭菌: 用加热焚烧、 氧化等方法, 使化学药剂变为气体状态扩散到空气中, 以杀死空气和物体表面的微生物。
　　　2) 涂抹灭菌: 用70%的酒精或0.2%新洁尔灭等化学药剂重复涂抹桌面、 墙面、 双手或植物材料表面
　　　3) 喷雾灭菌: 接种室或物体表面用70%－75%酒精或0.2%新洁尔灭溶液作喷雾处理, 可杀死空间的微生物, 也可使悬浮在空间的灰尘沉降到地面。
　　　4) 浸泡灭菌: 把接种器械、 接种材料直接浸泡在一定浓度的消毒剂中, 达到灭菌的目的。
五、 外植体的消毒
1.　基本原则: 既要杀死离体材料表面的全部微生物, 以不损伤或只轻微损伤植物材料。
2.　基本过程:
材料选取→材料预处理与修整→流水冲洗→　70酒精浸泡→无菌水漂洗→消毒剂处理( 请链接教材P33表3-2) →无菌水漂洗→无菌接种( 此过程请做成动画)

六、 污染原因和预防措施
在组培实验室中, 污染的病原分为细菌和真菌两大类(请链接污染图片)
预防措施: 1.枝条预培养
　　　　　2.在晴天下午采取材料
　　　　　3.加入抗生素

作业: 1.如何正确选择与处理外植体?
2.灭菌与消毒有何区别? 请您简述组培中常见的理化灭菌方法。
　　　3.外植体的污染主要有哪些? 请简述可能的原因及预防措施。

第四章 外植体的接种与培养
知识点: 1.掌握外植体接种技术
2.掌握外植体的培养方法和培养条件
3.掌握外植体褐变和玻璃化的概念, 了解其形成的原因。
技能目标: 熟练掌握外植体的接种技术和培养方法。

一． 外植体的接种
　外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料在无菌环境中切割或分离出器官、 组织或细胞转入到无菌培养基上的过程。也叫无菌操作。
1. 接种室的消毒
2. 外植体的接种操作过程( 链接动画或视频)
二．外植体的培养
外植体的培养是指在人工控制的环境条件下, 使离体材料生长、 脱分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。
( 一) 培养方法:
　固体培养和液体培养方法的比较
培养方式　　　　　优点　　　　　　　　　　　　　　缺点
固体培养　　操作简便, 设备简单, 易于观察, 　　　养分分布不均匀, 外植体与培养基接触
氧气充分　　　　　　　　　　　　　 面积小, 代谢废物易累积基部, 影响细胞组织的正常代谢, 受光不均匀, 细胞群生长不一致
液体培养　　组织与培养液接触面积大、 均匀　　　　为解决氧气的一足, 需购买昂贵的摇床等设备, 不便观察
(二)培养条件
1.温度
在植物组织培养中, 不同植物繁殖的最适温度不同, 大多为25℃±2℃。
2.光照
　　主要表现在光质、 光照、 光周期
3.培养基的pH值
一般培养基的pH值在5.6-6.0之间。
4.湿度
一般要求培养室内常年保持70%-80%的相对湿度。
5.氧和其它气体
( 三) 外植体的褐变( browning) 及其防止
褐变、 菌类污染和过度含水化( 玻璃化) 是植物组织培养中的三大难题。
褐变是指在组培过程中, 由培养材料向培养基中释放褐色物质, 致使培养基逐渐变成褐色, 培养材料也随之变褐而死亡的现象。主要是由于酚类物质与多酚氧化酶作用被氧化形成褐色的醌类物质和水, 而醌类又会在酪氨酸酶等酶作用下使外植体的蛋白质聚合, 生长停顿, 最终导致死亡。
1.影响褐变的因素
主要是外植体本身、 培养基及培养条件等方面。
（1） 组培植物种类和品种
一般来说, 植物材料中单宁类和多种羟酚类化合物含量高, 易引起个植体材料的褐变。多数木本植物比草本植物易引起褐变, 多年生草本植物比一年生草本植物易引起褐变。
（2） 外植体的生理状态和大小
外植体的老化程度越高, 其木质素含量也越高, 越容易发生褐变, 成龄材料一般比幼龄材料褐变严重。外植体小的材料更易褐变, 较大的材料褐变较轻。外植体的受伤程度对褐变产生明显影响, 伤口加剧褐变发生。各种灭菌剂对外植体的伤害也会引起褐变。
（3） 取材时间和部位
一般在春夏季, 特别是春季采用生长旺盛部位的外植体产生褐变较轻, 已木栓化或木质化的枝条和处于休眠状态的休眠芽作为外植体褐变严重。
（4） 培养基成分
在液体培养基上加滤纸桥和半固体培养基上褐变程度较固体培养基上轻。
低盐培养基, 特别是Mn和Cu离子浓度较低时, 外植体褐变较高盐培养基轻。
较高浓度的6-BA或KT会加重外植体的褐变程度。
培养基的pH值较低时常有利于减轻外植体的褐变。
加入抗氧化剂、 活性炭或PVP可减轻褐变。
（5） 培养条件
光照过强、 温度过高、 培养时间过长均加速褐变。
2.防止措施
(四)试管植物的玻璃化(vitrification)现象及其预防措施
当植物材料进行离体繁殖时, 有些培养物的嫩茎、 叶片往往会出现半透明状和水渍状, 这种现象称为玻璃化。这是试管苗的一种生理失调症状, 玻璃化的出现会使试管苗生长缓慢, 且因其嫩茎不易诱导生根, 使繁殖系数大为降低, 很难移栽成活。
1. 玻璃化产生的原因
（1） 激素浓度
（2） 温度
（3） 湿度
（4） 琼脂浓度
（5） 光照强度
（6） 培养基成分( 一般认为提高培养基中的碳氮比可减少玻璃化的比例。
2. 预防措施

作业: 1.名词解释: 外植体接种与培养; 初代培养; 继代培养; 褐变; 玻璃化
2.思考题: 1) .接种室怎样进行消毒? 外植体接种的具体操作步骤?
　　　　　　　　2) 固体培养与液体培养各有何优缺点?
　　　　　　　　3) 影响外植体的培养条件有哪些?
　　　　　　　　4) 外植体褐变、 玻璃化产生的原因有哪些? 有哪些预防措施?

第五章 愈伤组织的培养( 插入愈伤组织图片)
一． 愈伤组织的概念与其形态特点
二. 愈伤组织的诱导和分化
一) 愈伤组织的诱导
一般认为诱导愈伤组织成败的关键不在于植物材料的来源, 主要在于培养的条件。脱分化的难易程度与植物的种类、 组织和细胞的状态有关, 一般单子叶植物比双子叶植物难; 成熟的植物细胞和组织比未成熟的植物细胞和组织难; 单倍体细胞比二倍体细胞难。
常见的植物生长调节剂: 生长素类( 2, 4－D、 IAA和NAA)
　　　　　　　　　　　细胞分裂素类( 6－BA、 KT和ZT)
二) 愈伤组织形成
可分为在三个时期: 起始期、 分裂期和形成期。一般来说, 诱导启动阶段需要较高浓度的生长素和细胞分裂素, 细胞分裂阶段需要适当降低激素浓度, 有的则需要去掉生长素或细胞分裂素或二者都不加。
优良的愈伤组织需具备的特性1.高度的胚性, 能使这些愈伤组织得到再生植株;
2.分散性好, 容易建立优良的悬浮系;
3.增殖能力旺盛
4.经过长期继代保存不丧失胚性。
三) 愈伤组织的保持
愈伤组织保持的方法: 将原来的愈伤组织切割成小块转移到新鲜培养基上继代培养。用于继代的愈伤组织必须达到一定大小( 直径约5mm, 重量约为100mg) , 否则在新鲜培养基上难以恢复分裂、 生长或生长十分缓慢。
正常情况下, 继代后的愈伤组织3－7d内可恢复生长, 2－3周内处于旺盛生长时期, 并在此时达到最大致积。进行愈伤组织继代培养的合适时间是愈伤组织生长即将达到顶峰之前, 这时的愈伤组织细胞处于旺盛分裂之中, 继代后易进入生长。
四) 愈伤组织的再分化
愈伤组织再分化成再生植株的方式: 1.产生芽后, 在茎基部长根;
　　　　　　　　　　　　　　　　2.先长根, 再长芽;
　　　　　　　　　　　　　　　　3.在愈伤组织的不同部位分别形成根和芽
芽的发生属于外起源, 根的发生属于内起源
外植体时, 形成根
　　　　　　　　脱分化↓←高生长素( 如2, 4－D) 　　　　　　　
愈伤组织
　　　　　　　　再分化↓←低生长素/细胞分裂素
　　　　　　　　　　　芽
　　　　　　　　　　　↓←高生长素/细胞分裂素
　　　　　　　　　　　根
　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　完整植株
五) 体细胞胚胎发生
在离体或活体下, 经过体细胞经原胚期、 球形胚期、 心形胚期、 鱼雷胚期和子叶期等阶段形成的胚叫体细胞胚状体( somatic embryoid) 。
1.产生的方式:
1) 直接由器官上发生
2) 培养物先形成愈伤组织, 由愈伤组织再分化形成胚状体。这种方式比较常见。
3) 在花药或花粉培养中, 可由小孢子发育成胚状体。
4) 在单细胞及原生质体培养中, 一个细胞先形成一个胚性细胞团, 再从胚性细胞团上的细胞起源发育成胚状体。
2.早期体细胞胚状体与丛生芽的区别:
1） 胚状体具有极性( 茎端和根端) , 是一种单极性结构。
2） 在组织学上, 胚状体的维管组织与母体植物或外植体的维管组织无直接联系, 其维管组织的分布呈”Y”字形。
3.研究胚状体的主要意义:
1） 增加繁殖系数。因为它能够直接生长成小植株, 成苗率高。而且由愈伤组织、 细胞或器官培养中, 诱导胚状体的数量比诱导芽多得多。
2） 愈伤组织分化的芽不容易发育成小植株的培养物, 可是诱导胚状体, 就容易得到小植株。
3） 胚状体的维管束与合子胚一样,是独立产生的, 与母体维管束不相连,因此能够得到无病植株。
4） 可应用于细胞全能性的理论研究。不论是体细胞或小孢子或胚乳细胞都有再生成完整植株的全能性。植物细胞的全能性能够在培养条件下表现出来。研究这一特性对于建立植物的无性系, 了解细胞分化和形态发生的机制都十分重要。
5） 能够利用胚状体进行同步分裂的研究, 以了解细胞周期的真实过程和认识控制从亲代细胞到子细胞过程中生化变化系列的因子。一般用生长激素和细胞分裂素控制细胞同步分裂。
4.人工种子( artificial seed) ( 插入图片)
人工种子是指将植物离体培养产生的体细胞胚包埋在含有营养成分和保护功能的物质中, 在适宜条件下发芽出苗的颗粒体。包括: 体细胞胚、 人工胚乳和人工种皮三部分。
　　人工种子的优越性:
1） 经过细胞悬浮产生的胚状体增殖快, 繁殖系数大( 1L培养基可产生10万个胚状体) , 能在室内大量生产, 便于人工控制。
2） 便于将基因工程、 原生质体融合等技术培养出来的植物新品种, 经过人工种子获得快速繁殖, 提高育种效率。
3） 使用过程中, 人工种子可进行机械化播种, 大量快速繁殖苗木, 是种苗生产的新途径。
4） 在人工种子的制作过程中, 能够加入某些农药来防治病虫害, 也可加入某些生长调节物质来调节植物的生长发育。
人工种皮及人工胚乳的制作

作业:
1. 名词解释: 愈伤组织; 体细胞胚状体; 人工种子
2. 思考题:
1） 一般用哪类植物生长调节物质来诱导愈伤组织?
2） 愈伤组织的形成一般分为哪几个时期? 良好的愈伤组织应当具备哪些特性?
3） 简述愈伤组织再分化的途径。
4） 早期体细胞胚状体与丛生芽的区别在哪?
5） 体细胞胚状体产生的方式有哪些?
6） 人工种子与天然种子相比有哪些优越性?

第六章 营养器官培养
　　营养器官培养( vegetative organ culture) 是指植物根、 茎、 叶等器官在离体条件下, 在无菌的人工环境中将其作进一步培养发育, 最终长成幼苗的过程。器官培养的特点在于能保持器官所具有的特征性结构培养。经过器官培养能够快速建立试管苗, 实现快速繁殖。