电泳纯度(非还原型SDS-PAGE)测定标准操作规程.doc

细胞因子电泳纯度（非还原型SDS-PAGE）测定标准操作规程
依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。
范围：适用于细胞因子纯度的检测。
目的：检测细胞因子蛋白质纯度。
原理：蛋白质具有不同的电荷和分子量，在经过阴离子去污剂SDS处理后，蛋白质分子上的电荷被中和，在聚丙稀酰胺凝胶电泳时，不同的蛋白质按照其分子量大小进行分布，电泳迁移率仅取决于蛋白质的分子量。由于不连续的PH梯度作用，样品被压缩成一条狭窄区带，采用染色液染色，经扫描仪扫描胶片可及时观察结果。
内容：
1 材料
1．1样品：经二人复核批号无误后检测
1．2试剂
甲醇 CH3OH 分析纯
无水乙醇 CH3CH2OH 分析纯
浓盐酸 HCl 分析纯
甘油 C3H8O3 分析纯
硝酸银 AgNO3 分析纯
重铬酸钾 K2Cr2O7 分析纯
正丁醇 C4H9OH 分析纯
甲醛 HCHO 分析纯
丙烯酰胺 CH2CHCONH2 分析纯
甲叉双丙烯酰胺（CH2CHCONH2）2CH2 分析纯
过硫酸铵 （NH4）2S2O8 分析纯
TEMED（四甲基乙二胺）(CH3)2N(CH2)2N(CH3)2 分析纯
甘氨酸 C2H5NO2 分析纯
SDS（十二烷基硫酸钠）C12H25O4SNa 分析纯
乙酸 CH3COOH 分析纯
碳酸钠 Na2CO3 分析纯
溴酚蓝 C19H10Br4O5S 分析纯
1．3注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版要求。
1．4设备
1．4．1扭力天平 上海第二天平仪器厂
1．4．2垂直板状电泳槽 北京东方仪器厂
1．4．3恒温恒流电泳仪 法玛西亚公司
1．4．4快速电泳槽 BIORAD USA
1．4．5全自动扫描仪 CS-930 日本岛津
1．4．6 TS-1型摇床
1．5器皿：500ml瓶、100ul移液器、1ml吸管、10ml吸管3000ml三角瓶、平皿、1000ml烧杯、80ml烧杯，以上器皿经本室洗刷组处理。
2 方法
2．1准备工作
2．1．1工作环境：控制区，确认场地清场合格，摘下“清场合格”标志牌，挂上“使用中”标志牌。
2．1．2调试仪器设备
2．1．2．1恒温恒流电泳仪工作状态良好，已经挂“备用”标志牌。
2．1．2．2全自动扫描仪工作状态良好，已挂“备用” 标志牌。
2．1．2．3扭力天平工作状态良好，已挂“备用” 标志牌。
2．1．3摘下扭力天平“备用” 标志牌，挂“运行中” 标志牌。
2．1．4配液：以下溶液的配制完成后，均需经二人复核无误后，在瓶外贴标签，注明溶液的名称、浓度、体积、批号及配制日期。
2．1．4．1聚丙烯酰胺凝胶母液 100ml
用扭力天平准确称取丙烯酰胺30g, 甲叉双丙烯酰胺0.8g，加50ml注射用水溶解后定容至100ml，过滤，置于棕色瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4℃冰箱放置。一般不超过1～2个月。
2．1．4．2分离胶缓冲液 100ml
用扭力天平准确称取Tris18.15g，溶于80ml注射用水中，溶解后，加浓盐酸调节pH8.8，补加注射用水至100ml，置于250ml瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4℃冰箱放置。
2．1．4．3浓缩胶缓冲液 100ml
用扭力天平准确称取Tris6.05g，溶于80ml注射用水中，溶解后，加浓盐酸调pH6.8，补加注射用水至100ml，置于250ml瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4℃冰箱放置。
2．1．4．4 1%SDS 50ml
用扭力天平准确称取SDS 0.5g，溶于50ml注射用水中，溶解后，置于棕色瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温保存。
2．1．4．5 1% TEMED 50ml
用吸管准确吸取TEMED0.5ml，溶于50ml注射用水中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4℃冰箱放置。
2．1．4．6 1% 过硫酸铵 50ml
用扭力天平准确称取过硫酸铵0.5g，溶于50ml注射用水中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4℃冰箱放置。
2．1．4．7电极缓冲液 3000ml
用扭力天平准确称取Tris9g 、甘氨酸43.2g、SDS3g，溶于2000ml注射用水中，补加注射用水至3000ml，置于3000ml三角瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温贮存。
2．1．4．8固定液 500ml
用量筒准确量取甲醇250ml，乙酸50ml，补加注射用水至500ml，置于500ml瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温贮存。
2．1．4．9洗液 3000ml
用量筒准确量取无水乙醇300ml，乙酸150ml，补加注射用水至3000ml，置于3000ml三角瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温贮存。
2．1．4．10重铬酸钾溶液 200ml
用扭力天平准确称取重铬酸钾10g，加注射用水至200ml；加浓HNO32ml摇匀溶解，置于棕色瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温保存。
2．1．4．11硝酸银溶液 200ml
用扭力天平准确称取硝酸银0.4g，加注射用水至200ml，置于棕色瓶中，避光保存，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，限当次试验使用。
2．1．4．12显色液 3000ml
用扭力天平准确称取Na2CO318g，加注射用水至3000ml，溶解后，加0.6ml甲醛，置于3000ml三角瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温贮存。
2．1．4．13终止液 500ml
用吸管准确吸取乙酸5ml，溶于500ml注射用水中，置于500ml瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温贮存。
2．1．4．14样品处理液（非还原型） 10ml
用扭力天平准确称取Tris0.303g、SDS0.8g、溴酚蓝0.189g，溶于2ml注射用水中，加入甘油4ml，浓HCl0.189ml，加注射用水定容至10ml，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4℃冰箱放置。4℃贮存。
2．1．5样品准备：将样品自冰箱内拿出，放置室温融化后，将样品与样品处理液按3：1（V/V）的比例混匀，沸水处理3～5分钟，待用。
2．2操作过程
2．2．1．1分离胶（13.5%）制备
聚丙烯酰胺胶母液14.4ml, 分离胶缓冲液8ml, 1%SDS 3.2ml，注射用水 3.2ml，1%过硫酸铵1.6ml，1%TEMED1.6ml，制成胶量32ml。
2．2．1．2浓缩胶(4.5%)的制备
聚丙烯酰胺凝胶母液2.4ml,, 浓缩胶缓冲液4ml, 注射用水4.8ml，1%SDS 1.6ml，1%过硫酸铵1.6ml，1%TEMED1.6ml， pH6.8，成胶量16ml。
2．2．1．3灌胶
灌胶时先将电泳槽阳极侧用透析纸包上，在电泳槽内加满水，靠水压封住阳极侧缝隙，以免胶溶液漏出；在两玻璃板间加分离胶，加胶完毕后，用注射器沿玻璃板在液面上覆盖一层（约0.3cm高）正丁醇；待胶凝固后，将电泳槽内注射用水及胶表面的正丁醇倒掉，并用滤纸吸干；向电泳槽内加入电极缓冲液、在浓缩胶位置插上梳子，在分离胶上加浓缩胶，待胶凝固后抽去梳子。
2．2．2加样:将处理后样品按每孔不少于5ug的蛋白量，加入样品槽内.
2．2．3电泳: 打开电泳仪，摘下“备用”标志牌，挂“运行”标志牌，调定电流，起始电流15mA，待指示线跑至分离胶处，改电流为25 mA，电泳时间约为2.5小时，待指示剂至底线处，停止电泳,关闭电泳仪，摘下“运行”标志牌,挂“备用”标志牌。
2．2．4染色
电泳完毕后取下胶片，置于5倍胶体积的固定液内12h（或室温振荡30分钟）；洗液洗三次，每次10分钟，37℃摇床内振荡；取5ml重铬酸钾母液加入200ml注射用水中，将胶片置其中,避光,振荡10分钟；用注射用水洗数次至黄色本底变白；加入新配制的0.2 %AgNO3溶液白炽灯下照射30分钟；水洗五次；显色液500ml中加甲醛0.35ml，待样品蛋白带及分子量蛋白带清晰后弃去显色液加入终止液。
2．2．5扫描
2．2．5．1打开扫描仪,摘下“备用”标志牌,挂上“运行”标志牌。
2．2．5．2对胶片进行扫描,同时记录下扫描结果。
2．2．5．3关闭扫描仪,摘下“运行”标志牌,挂“备用”标志牌。
2．2．6摘下场地“使用中”标志牌,挂“待处理”标志牌。
3 结果判定
3．1判定标准:
染色后胶片经扫描仪扫描，样品蛋白带含量应在95%以上，二聚体量不超过5%。
3．2判定结果填写记录。
4 清场
4．1需要低温贮存的液体放入冰箱，避光的液体放入阴暗处。
4．2称药之后将药品瓶盖盖紧，放回药品柜。
4．3关闭扭力天平，清洁干净后放回原处，挂“备用”标志牌。
4．4清洁工作台面，用专用抹布擦净，地面用专用拖布拖净。
4．5用过的玻璃器皿用纯化水冲洗干净后返回洗刷组。
4．6填写清场记录。
4．7清场后由车间工序负责人或质量监督员检查合格后,摘下“待处理”标志牌,挂“清场合格”标志牌。
5 注意事项
5．1本实验所用SDS需高纯度SDS,如不纯需重结晶。
5．2样品必须经沸水处理3-5分钟,以免有亚稳聚合物存在。
附:SDS-PAGE(快速电泳)
准备工作同前。
1 制胶
1．1分离胶制备：（13.5%）
聚丙烯酰胺凝胶母液7.2ml, 分离胶缓冲液4ml, 1%SDS 3.2ml，注射用水 1.6ml，1%过硫酸铵0.8ml，1%TEMED0.8ml，制成胶量16ml。
1．2浓缩胶的制备(4.5%)
聚丙烯酰胺凝胶母液1.2ml, 浓缩胶缓冲液2ml,注射用水2.4ml，1%SDS 0.8ml，1%过硫酸铵0.8ml，1%TEMED0.8ml， pH6.8，成胶量8ml。
1．3灌胶：先将分离胶液加入制胶器内，上面加一薄层正丁醇，待胶凝固后，在浓缩胶位置上插梳子，在分离胶上加浓缩胶，待胶凝固后抽去梳子。
2 预电泳：打开电泳仪，摘掉“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。
恒定电压200V，时间30分钟。
3 上样
将处理后样品按每孔不少于5ug的蛋白量，加入样品槽。
4 电泳
恒定电流40mA，电泳时间1h。指示剂至底线处，停止电泳。关闭电泳仪，摘下“运行”标志牌，挂“备用”标志牌。
其余步骤同前。