小学期9七年制基因组王丽华.pptx

实验安排实验安排1 1、上午：基因组、上午：基因组DNADNA的提取的提取2 2、中午：酶切、中午：酶切3 3、下午：琼脂糖凝胶电泳鉴定、下午：琼脂糖凝胶电泳鉴定移液器移液器微量分析微量分析1 1、根据取样量，选择合适量程的加样器。、根据取样量，选择合适量程的加样器。2 2、如何调节？如何调节？顺时针调节顺时针调节-读数变小读数变小 逆时针调节逆时针调节-读数变大读数变大注注意意：调调节节前前，加加样样器器读读数数正正处处于于最最大大量量程程或或最最小小量量程程时时，如如果果向向错错误误方方向向调调节节，马马上上会会超超出出量量程程，将将会会损损害害加加样样器器的精度。的精度。（1 1）吸头的安装要紧密。）吸头的安装要紧密。（2 2）打到）打到第一挡第一挡，将吸头插入液面下适，将吸头插入液面下适当当 深度，缓慢松开拇指，吸取液体。拇深度，缓慢松开拇指，吸取液体。拇指完全放开后，吸头在液面下停留一下指完全放开后，吸头在液面下停留一下（约半秒钟）（约半秒钟）（3 3）将外壁液体用容器口引流回容器。）将外壁液体用容器口引流回容器。吸头内的体积应大致正确。（吸头内的体积应大致正确。（5 5）贴目的）贴目的容器内壁，容器内壁，加样器推到加样器推到第二挡第二挡。将液体匀将液体匀速打到目的容器内，速打到目的容器内，观察吸头内液体是否完全打出。观察吸头内液体是否完全打出。台式高速离心机台式高速离心机centrifugation离心离心1 1、打开电源。、打开电源。2 2、盖紧盖子、盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。防止离心机被腐蚀。3 3、标记，配平、标记，配平,对称放入离心机对称放入离心机(管管的连接处朝外的连接处朝外).).4 4、设定离心的转速和时间、设定离心的转速和时间5 5、统一离心。、统一离心。废液废液 废头废头污染废物污染废物污物处理污物处理 实验步骤实验步骤第一部分：裂解细胞膜、提取白细胞核第一部分：裂解细胞膜、提取白细胞核第二部分第二部分:裂解核膜，释放基因组。裂解核膜，释放基因组。第三部分：去蛋白第三部分：去蛋白第四部分：乙醇沉淀第四部分：乙醇沉淀DNADNA第五部分：酶切，第五部分：酶切，DNADNA电泳电泳(标管号标管号)1 抗凝血抗凝血-0.3ml。2 STMT-1ml，充分，充分颠倒混匀颠倒混匀（酒红色）。（酒红色）。3 10,000g 离心离心 2min，弃上清，倒置于滤纸。，弃上清，倒置于滤纸。4 生理盐水生理盐水-0.4ml,混匀混匀,10,000g离心离心2min,弃上清。弃上清。5 NE溶液溶液-450l 悬浮沉淀。悬浮沉淀。6 10%SDS-50l 迅速混匀，迅速混匀，蛋白酶蛋白酶K-50l，轻轻摇匀，轻轻摇匀，水浴水浴1h（50）。）。7 TE饱合酚饱合酚-500l，轻摇，轻摇 2min，10,000g离心离心 1min，上层水相移至另一上层水相移至另一Ep管（用管（用100l枪枪？次）全取。？次）全取。8 酚氯仿异戊醇酚氯仿异戊醇（25:24:1）500l，轻摇，轻摇 1min，10,000g离心离心 1min，上层水相移至另一上层水相移至另一Ep管（用管（用100l枪枪？次）全取。？次）全取。9 氯仿异戊醇氯仿异戊醇（24:1）500l，轻摇，轻摇 1min，10,000g离心离心 1min，上层水相移至另一上层水相移至另一Ep管内管内(用用100l枪枪？次？次)计量。计量。10 NaAc-v，混匀，混匀（离心机甩下）。（离心机甩下）。11 无水乙醇无水乙醇-2倍倍v，混匀，混匀，70 15min。10112 10,000g离心离心 5min，弃上清。，弃上清。13 滤纸条吸残液，室温干燥滤纸条吸残液，室温干燥 10min。15 DNA液液-8l，EcoR-1l(提供内切酶反应最适条件提供内切酶反应最适条件)10TE缓冲液缓冲液-1l37水浴水浴 60min14 加双蒸水加双蒸水-20l，溶解沉淀，溶解沉淀8l8l：酶切：酶切12l12l：电泳对照：电泳对照真核细胞真核细胞DNADNA的分离提取的分离提取及酶切电泳及酶切电泳第一部分第一部分 DNA的分离提取的分离提取第二部分第二部分 电泳检测电泳检测掌握人外周血基因组掌握人外周血基因组DNA的提取原则和方法的提取原则和方法实验目的实验目的掌握琼脂糖凝胶电泳分离掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法的原理和方法(Genome)样品：人外周血样品：人外周血白细胞核中白细胞核中DNA1步步 抗凝血抗凝血2步步 STMT溶液溶液3步步 离心，弃上清，倒置于滤纸离心，弃上清，倒置于滤纸4步步 生理盐水生理盐水 混匀混匀,离心离心 ,弃上清弃上清一、裂解细胞膜提取细胞核一、裂解细胞膜提取细胞核二、二、裂解细胞核膜释放基因组裂解细胞核膜释放基因组（准备保护（准备保护DNA）5步步 NE溶溶液液NaCl（高浓度（高浓度Na+）EDTA 抑制抑制DNase破坏核膜破坏核膜6步步 SDS溶液溶液三、三、DNADNA与蛋白质解离与蛋白质解离6步步 蛋白酶蛋白酶K K：消化组蛋白消化组蛋白（除去残存的酚及蛋白）（除去残存的酚及蛋白）离心离心，取上层水相移至另一，取上层水相移至另一Ep管；管；（用（用100l枪枪？次）全取计量。？次）全取计量。7步步 TE饱合重蒸酚饱合重蒸酚8步步 酚酚/氯仿氯仿/异戊醇异戊醇（25:24:1）9步步 氯仿异戊醇（氯仿异戊醇（24:1）四、四、DNA的纯化的纯化 去除蛋白等去除蛋白等乙醇乙醇 +盐盐五、五、DNA的浓缩的浓缩沉淀法沉淀法 10步步 NaAc-v，混匀，混匀（离心机甩下）（离心机甩下）10111步步 无水乙醇无水乙醇-2倍倍v，混匀，混匀，70 15min。（低温利于沉淀）（低温利于沉淀）12步步 离心，弃上清离心，弃上清13步步 滤纸条吸残液，室温干燥滤纸条吸残液，室温干燥降低降低DNA的溶解度，稳定的溶解度，稳定DNA分子分子1 简化操作步骤，缩短提取过程简化操作步骤，缩短提取过程2 减少化学因素对核酸的降解减少化学因素对核酸的降解（pH410）（减少破坏因素）（减少破坏因素）3 减少物理因素对核酸的降解减少物理因素对核酸的降解4 防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解机械剪切力：机械剪切力：高速震荡；快速狭长孔道；反复冻溶高速震荡；快速狭长孔道；反复冻溶高温：高温：常规操作温度为常规操作温度为0 1 其它生物大分子的污染应降到最低程度其它生物大分子的污染应降到最低程度2 排除其它核酸分子的污染排除其它核酸分子的污染3 不应存在对核酸有影响的有机溶剂和金属离子不应存在对核酸有影响的有机溶剂和金属离子（蛋白质，多糖和脂类等）（蛋白质，多糖和脂类等）（如提（如提DNA时，应去除时，应去除RNA分子，反之亦然）分子，反之亦然）第二部分第二部分 基因组基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测的琼脂糖凝胶电泳检测一、铺胶一、铺胶1.封口封口2.溶胶溶胶3.加入溴乙啶加入溴乙啶4.插入样品梳插入样品梳5.灌胶灌胶缓慢连续，不要形成气泡缓慢连续，不要形成气泡15 1琼脂糖凝胶电泳检测：琼脂糖凝胶电泳检测：（1）电泳装置及胶板电泳装置及胶板（一套）（一套）（2）样品样品 载样液载样液-2l+酶解液酶解液10l，混匀混匀 （统一加入，离心机甩下）（统一加入，离心机甩下）取样取样-10l （各组分别取样，依次加样，墙侧为（各组分别取样，依次加样，墙侧为1组）组）甘油：样品下沉甘油：样品下沉溴酚蓝：示踪指示剂溴酚蓝：示踪指示剂（3 3）电泳检测：）电泳检测：100V 30-40100V 30-40分钟分钟DNA液12ll载样液载样液3l3l线性线性DNA片段（片段（kb）琼脂糖浓度（琼脂糖浓度（%）5 60 0.4 0.8 10 0.7 0.4 6 1.0 0.2 4 1.5 0.2 3 1.75 0.1 3 2.0 第二部分第二部分 基因组基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测的琼脂糖凝胶电泳检测用荧光嵌入染料溴化乙啶染色用荧光嵌入染料溴化乙啶染色,紫外光下检出。紫外光下检出。不同浓度琼脂糖凝胶可分离不同长度的不同浓度琼脂糖凝胶可分离不同长度的DNA片段。片段。(agarose gel electrophoresis)线状双链线状双链DNA分子迁移率与碱基对数目分子迁移率与碱基对数目对数值成反比对数值成反比（1）琼脂糖浓度：）琼脂糖浓度：（2）DNA的分子大小：的分子大小：（3）DNA的构象的构象（4）电压：）电压：（5）碱基组成、温度、离子强度、嵌入染料的存在等）碱基组成、温度、离子强度、嵌入染料的存在等超螺旋超螺旋开环开环线状双链线状双链DNA分子筛作用分子筛作用低电压时，线性低电压时，线性DNA与所加电压成正比；与所加电压成正比；所加电压不得超过所加电压不得超过5v/cm。染色体染色体DNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳Smear 带带连续的、弥漫云雾状带连续的、弥漫云雾状带M87654321