SN∕T 5439.7-2022 出口食品中食源性致病菌快速检测方法 PCR-试纸条法 第7部分：单核细胞增生李斯特氏菌[商检].pdf

I C S6 7. 0 5 0C C SC 5 3中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 4 3 9. 72 0 2 2出口食品中食源性致病菌快速检测方法P C R -试纸条法 第7部分: 单核细胞增生李斯特氏菌R a p i d d e t e c t i o n o f f o o d b o r n e p a t h o g e n s f r o m e x p o r t e d f o o d b y P C R - L a t e r a l f l o w d i p s t i c k m e t h o dP a r t 7:L i s t e r i a m o n o c y t o g e n e s2 0 2 2 - 0 3 - 1 4发布2 0 2 2 - 1 0 - 0 1实施中华人民共和国海关总署发 布前 言 本文件按照G B/T 1. 12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分: 标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。 本文件是S N/T 5 4 3 9的第7部分。S N/T 5 4 3 9已经发布了以下部分: 第1部分: 沙门氏菌; 第2部分: 金黄色葡萄球菌; 第3部分: 副溶血性弧菌; 第4部分: 克罗诺杆菌; 第5部分: 产志贺毒素大肠埃希氏菌及大肠埃希氏菌O 1 5 7; 第6部分: 空肠弯曲菌; 第7部分: 单核细胞增生李斯特氏菌。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位: 中华人民共和国南京海关、 中华人民共和国上海海关、 南京农业大学、 苏州蝌蚪生物技术有限公司、 广东省科学院微生物研究所、 广东环凯生物科技有限公司、 杭州傲敏生物科技有限公司。 本文件主要起草人: 申进玲、 赵丽娜、 薛俊欣、 薛峰、 蒋原、 陈谋通、 丁郁、 蔡芷荷、 苏静、 陆寿祥、 曾静。S N/T5 4 3 9. 72 0 2 2出口食品中食源性致病菌快速检测方法P C R -试纸条法 第7部分: 单核细胞增生李斯特氏菌1 范围本文件规定了出口食品中食源性致病菌-单核细胞增生李斯特氏菌快速检测的P C R -试纸条方法。 本文件适用于出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定性检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中, 注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件; 不注日期的引用文件, 其最新版本( 包括所有的修改单) 适用于本文件。 G B 4 7 8 9. 3 02 0 1 6 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 G B/T 2 7 4 0 32 0 0 8 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。单核细胞增生李斯特氏菌 L i s t e r i a m o n o c y t o g e n e s其为革兰氏阳性短杆菌, 大小约为0. 5 m1. 0 m2. 0 m, 直或稍弯, 两端钝圆, 常呈V字型排列, 偶有球状、 双球状, 兼性厌氧、 无芽胞。其是一类重要的食源性致病菌, 可引起人类脑膜炎、 败血症及孕妇流产等严重疾病, 尤其是老人、 新生儿及孕妇等免疫力低下者对单核细胞增生李斯特菌更易感。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 D NA: 脱氧核糖核酸(d e o x y r i b o n u l e i c a c i d) d NT P: 脱氧核苷酸三磷酸(d e o x y r i b o n u l e o s i d e t r i p h o s p h a t e) E D T A: 乙二胺四乙酸(e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d) F I T C: 异硫氰酸盐(f l u o r e s c e i n 5 - i s o t h i o c y a n a t e) T r i s: 三羟甲基氨基甲烷t r i s(h y d r o x y m e t h y l)a m i n o m e t h a n e5 方法原理 对样品中单核细胞增生李斯特氏菌进行增菌培养后提取D NA, 采用上游和下游引物分别经地高辛和异硫氰酸盐标记的单核细胞增生李斯特氏菌的特异性检测引物进行P C R扩增。检测用试纸条上含1S N/T5 4 3 9. 72 0 2 2有金标记的抗异硫氰酸盐的抗体, 可与P C R产物上的异硫氰酸盐标记分子结合, 在检测线位置上有抗地高辛抗体, 可与P C R产物上的地高辛标记分子结合, 从而显色。如模板未扩增, 则无P C R产物与地高辛抗体及F I T C抗体结合, 从而不能在检测线(T线) 位置显示颜色。6 试剂和材料 除另有规定外, 试剂为分析纯或生化试剂, 实验用水符合G B/T 6 6 8 2的要求。6. 1 引物单核细胞增生李斯特氏菌扩增引物详见表1, 靶基因序列参见附录A。表1 试验用引物致病菌种类引物序列(5 3 )5 端标记物靶基因片段长度单核细胞增生李斯特氏菌F:5- AA C C TA T C C AG G T G C T C - 3地高辛R: 5- C G C C A C A C T T G A GA TA T - 3异硫氰酸盐h l y A5 2 0 b p6. 2 试剂6. 2. 1 D NA提取液:2 0 mm o L/L T r i s - HC l,2 mm o l/L E D T A,1. 2% T r i t o n X - 1 0 0(p H 8. 0) 。6. 2. 2 2 P C R预混液。6. 2. 3 P C R引物。6. 2. 4 试纸条: 通过采购的原料试剂自行组装( 参见附录B) , 或采用等效的商品化试纸条。6. 2. 5 展开液:1 0 mm o l/L T r i s、1% B S A、1%( 体积分数)T w e e n 2 0以及浓度为0. 0 5 m o l/L的N a OH; 或采用等效的商品化产品。7 仪器设备7. 1 离心机: 离心力1 2 0 0 0 g。7. 2 微量移液器:1 0 0 L1 0 0 0 L,2 0 L2 0 0 L,0. 5 L1 0 L。7. 3 P C R仪。7. 4 恒温水浴锅:1 0 0 1。7. 5 天平: 感量0. 0 1 g。7. 6 p H计。7. 7 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。8 检验步骤8. 1 样品制备和增菌 按照G B 4 7 8 9. 3 02 0 1 6的方法进行样品制备和增菌。8. 2 样品D N A提取2S N/T5 4 3 9. 72 0 2 28. 2. 1 增菌液模板D N A的制备 对于7. 1获得的增菌液, 采用如下方法制备模板D NA:a) 吸取1 m L菌液加入1. 5 m L离心管中,1 2 0 0 0 g离心3 m i n, 弃上清;b) 加入1 m L 0. 8 5%无菌生理盐水, 完全溶解沉淀,1 2 0 0 0 g离心3 m i n, 弃上清;c) 加入1 0 0 L D NA提取液混匀后沸水浴1 0 m i n, 置冰上冷却;d) 1 2 0 0 0 g离心2 m i n, 上清液即为模板D NA。也可采用等效的商品化核酸提取试剂盒并按其说明提取核酸。8. 2. 2 可疑菌落模板D N A的制备对于7. 1分离到的可疑菌落, 可直接挑取可疑菌落再按照7. 2. 1 c) 步骤制备模板D NA以待检测。也可采用等效的商品化核酸提取试剂盒并按其说明提取核酸。8. 3 D N A浓度和纯度的测定取5 L D NA溶液加双蒸水稀释至1 m L, 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测2 6 0 n m和2 8 0 n m处的吸光值A2 6 0和A2 8 0。D NA的浓度按公式(1) 计算:c=AN5 0/1 0 0 0( 1 )式中:c D NA浓度, 单位为纳克每微升(n g/L) ;A 2 6 0 n m处的吸光值;N 核酸稀释倍数。当A2 6 0/A2 8 0比值在1. 71. 9之间时, 适宜于P C R扩增。8. 4 P C R 扩增8. 4. 1 P C R反应体系见表2。表2 P C R反应体系组分总体积(2 5L)2 x P C R预混液1 2. 5 L上游引物 (1 0 m o l/L)0. 2 5 L下游引物 (1 0 m o l/L)0. 2 5 LD NA模板a5 L无菌水7 L aD NA模板的浓度限定在1 0 p g/L 1 0 n g/L之间。8. 4. 2 反应条件 9 4 预变性5 m i n;9 4 变性3 0 s,5 8 退火3 0 s,7 2 延伸1 m i n,3 5个循环后进入7 2 ,7 m i n;4 保存。 检测过程中分别设阳性对照、 阴性对照和空白对照。用单核细胞增生李斯特氏菌D NA模板作阳3S N/T5 4 3 9. 72 0 2 2性对照, 用非单核细胞增生李斯特氏菌D NA模板作阴性对照, 用等体积的无菌水代替模板D NA作空白对照。8. 4. 3 试纸条检测 取6 L P C R产物, 加入5 4 L上样稀释液, 混匀后垂直缓慢滴加于试条样品垫中,3 m i n观察结果。9 质量控制以下条件有一条不满足时, 实验视为无效:a) 空白对照: 质控线变红, 检测线未变红;b) 阴性对照: 质控线变红, 检测线未变红;c) 阳性对照: 质控线变红, 检测线变红。1 0 结果判断与表述1 0. 1 结果判定试纸条质控线变红色, 且检测线变红色,P C R扩增产物为可疑阳性。可疑阳性产物经测序进行确证。试纸条质控线变红色, 检测线不变色,P C R扩增产物为阴性。1 0. 2 表述P C R产物试纸条检测为可疑阳性, 同时测序结果正确者, 继续按照传统方法进行分离, 若确分离到该菌, 判为含单核细胞增生李斯特氏菌, 表述为检出单核细胞增生李斯特氏菌;P C R产物试纸条检测为阴性, 判为不含有单核细胞增生李斯特氏菌, 表述为未检出单核细胞增生李斯特氏菌。1 1 检测过程中防止交叉污染的措施 按照G B/T 2 7 4 0 3中附录D的规定执行。1 2 废弃物处理检测过程中的废弃物, 收集后在焚烧炉中焚烧处理。1 3 检出限 本文件所规定方法的最低检出限(L O D) 为1 03C F U/m L。4S N/T5 4 3 9. 72 0 2 2附 录 A( 资料性)P C R产物测序结果 单核细胞增生李斯特氏菌的基因扩增靶标参考序列 (g e n n b a n k号:N C_0 0 3 2 1 0. 1:2 0 5 8 1 9 - 2 0 7 4 0 8)如下所示。AA C C T AT C C AG G T G C T C T C G T AAAAG C GAAT T C G GAAT T AG T AGAAAAT C AA C C AGAT G TT C T C C C T G T AAAA C G T GAT T C AT T AA C A C T C AG C AT T GAT T T G C C AG G T AT GA C T AAT C AAGA C AAT AAAAT C G T T G T AAAAAAT G C C A C T AAAT C AAA C G T T AA C AA C G C AG T AAAT A CAT T AG T G GAAAGAT G GAAT GAAAAAT AT G C T C AAG C T T AT C C AAAT G T AAG T G C AAAAAT T GAT T AT GAT GA C GAAAT G G C T T A C AG T GAAT C A C AAT T AAT T G C GAAAT T T G G T A C AGC AT T T AAAG C T G T AAAT AAT AG C T T GAAT G T AAA C T T C G G C G C AAT C AG T GAAG G GAAAAT G C AAGAAGAAG T C AT T AG T T T T AAA C AAAT T T A C T AT AA C G T GAAT G T T AAT GAA C C TA C AAGA C C T T C C AGAT T T T T C G G C AAAG C T G T T A C T AAAGAG C AG T T G C AAG C G C T T G GAG T GAAT G C AGAAAAT C C T C C T G C AT AT AT C T C AAG T G T G G C G5S N/T5 4 3 9. 72 0 2 2附 录 B( 资料性)含有金标记的抗F I T C的单克隆抗体和固定有地高辛抗体的通用核酸检测试纸条B. 1 组成成分B. 1. 1 地高辛抗体。B. 1. 2 羊抗鼠二抗。B. 1. 3 F I T C抗体。B. 1. 4 1 m o l/L T r i s - HC l(p H=8. 0) 。B. 1. 5 1 0% 蔗糖溶液。B. 1. 6 0. 1 m o l/L碳酸钾(K2C O3) 溶液。B. 1. 7 1% 柠檬酸三钠溶液。B. 1. 8 0. 2 m o l/L 磷酸盐缓冲液(P B) 。B. 1. 9 1 0% 牛血清白蛋白(B S A) 溶液。B. 1. 1 0 金标垫处理液: 蔗糖、 吐温2 0、 海藻糖、P E G 2 0 0 0和0. 0 1 m o l/L P B(p H 7. 4) 。B. 1. 1 1 样品垫处理液: 曲拉通-1 0 0、N a C l、T r i s - HC l (P H 8. 0) 和0. 0 1 m o l/L P B(P H 7. 4) 。B. 1. 1 2 聚酯膜。B. 1. 1 3 硝酸纤维膜(N C膜) 。B. 1. 1 4 吸水纸。B. 1. 1 5 P V C底板。B. 2 试纸条结构见图B. 1。 标引序号说明:1 吸水滤纸垫; 2 结合物垫, 附有F I T C抗体与胶体金颗粒的交联体; 3 侧向层析基质( 硝酸纤维素膜) ; 4 检测带, 附有地高辛抗体; 5 质控带, 附有羊抗鼠二抗; 6 衬底; 7 吸水垫。图B. 1 试纸条结构B. 3 试纸条的制备B. 3. 1 试纸条材料准备B. 3. 1. 1 制金: 利用柠檬酸三钠作为还原剂把氯金酸还原为单质金的方法制备金纳米粒子。准备干净的锥形瓶和搅拌子, 向锥形瓶中加入双蒸水和氯金酸并置于磁力加热搅拌器上加热, 待瓶中液体沸腾6S N/T5 4 3 9. 72 0 2 2234567后, 加入柠檬酸三钠溶液( 最好现配现用) , 边加热边搅拌, 直到瓶内液体状态变为透明的酒红色, 即为制得的金纳米粒子( 需质控金纳米粒子粒径为1 5 n m4 0 n m) , 关闭热源后继续搅拌5 m i n至液体保持为透明酒红色不变后停止, 取下锥形瓶待冷却后取出搅拌子, 金纳米粒子置于2 8 保存备用。B. 3. 1. 2 金标垫制作: 聚酯膜裁切成(6 5 mm7 5 mm)3 0 0 mm( 宽长) 的预处理膜于金标处理液中浸泡2 h, 再取出烘干备用。B. 3. 1. 3 样品垫制作: 聚酯膜板裁切成1 7 mm3 0 0 mm( 宽长) 长条于样品垫处理液中浸泡2 h, 再取出放置烘箱中烘干备用。B. 3. 1. 4 吸水垫制作: 将纸板用定位裁切机裁切1 9 mm3 0 0 mm( 宽长) 长条备用。B. 3. 1. 5 胶体金标记F I T C抗体: 取上述制备的1 m L胶体金经K2C O3溶液调节p H后, 加入F I T C抗体工作液, 充分混匀后置于室温振荡反应1 h, 再向溶液中加入1 0%的B S A溶液继续振荡反应3 0 m i n,9 8 0 0 r p m 4 离心1 0 m i n, 沉淀重悬于B S A溶液中2 8 保存备用。B. 3. 1. 6 喷金: 利用喷金划膜仪将上述制备好的金标记抗体的重悬液喷至准备好的金标垫上( 最终每个金标垫上的金标抗体重悬液的量约为6 L7 L) , 再置于3 7 烘箱中烘干, 裁剪至(6 mm7 mm)3 0 0 mm( 宽长) 备用。B. 3. 1. 7 划膜: 制备羊抗鼠二抗(H+L) 和地高辛抗体工作液, 再将其通过喷金划膜仪喷至硝酸纤维膜上, 即制得印有分别代表质控线和检测线的两条隐形印迹线的N C膜, 再置于3 7烘箱中烘干备用。B. 3. 2 试纸条的组装 依次将上述制备好的样品垫、 金标垫、N C膜和吸水垫粘于底板上, 每部分衔接处多出2 mm, 于切条机上切成(6 mm7 mm)4 mm( 宽长) 即为所制的试纸条, 质控合格后置于恒温恒湿箱中密封保存备用。B. 4 试纸条检测原理 对样品中致病菌增菌培养提取D NA, 采用上游和下游引物分别经地高辛和异硫氰酸盐标记的致病菌特异性检测引物进行P C R扩增, 阳性扩增产物的两端会分别带有地高辛和F I T C。检测用试纸条上在吸水垫上含有金标记的F I T C单克隆抗体, 可与P C R产物一条链上的F I T C标记分子结合, 在T检测线位置上固定有抗地高辛抗体, 可与P C R产物另一条链上的地高辛标记分子结合。在展开液的作用下,P C R扩增产物首先与金标记的F I T C抗体结合, 通过毛细作用带动胶体金向前端移动, 在经过固定有地高辛抗体的检测线位置时, 因带有地高辛标记而被地高辛抗体捕获在该位置上, 显示棕红色, 过量的金偶联物继续向上移动至固定有羊抗鼠二抗的C质控线位置, 与二抗结合, 从而显示出两条色带。如模板未扩增, 则无P C R产物与地高辛抗体及F I T C抗体结合, 从而不能在检测线(T线) 位置显示颜色。未参与反应的胶体金偶联物, 向上一直扩散至质控线(C线) 被羊抗鼠二抗捕获而显色。7S N/T5 4 3 9. 72 0 2 2220279345 T/NS中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准出口食品中食源性致病菌快速检测方法P C R -试纸条法 第7部分: 单核细胞增生李斯特氏菌S N/T 5 4 3 9. 72 0 2 2*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(1 0 0 0 2 3)编辑部: (0 1 0)6 5 1 9 4 2 4 2 - 7 5 3 0网址 w ww. c u s t o m s k b . c o m/b o o k中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本8 8 01 2 3 0 1/1 6 印张0. 7 5 字数2 3千字2 0 2 2年9月第一版 2 0 2 2年9月第一次印刷印数 15 0 0*书号: 1 5 5 1 7 58 3 3 定价1 6. 0 0元SN/T5439.7-2022