Nrf2-ARE信号通路影响糖尿病心肌梗死氧化应激的机制研究.pdf

基础研究Nrf2-ARE 信号通路影响糖尿病心肌梗死氧化应激的机制研究刘平方,蔡承哲,冯小倩,叶贤区,许卓帆(广州市第十二人民医院,广东 广州 510620)摘 要 目的:对糖尿病心肌梗死大鼠氧化应激进行研究,探讨 Nrf2-ARE 信号通路在其中的作用机制。方法:取清洁级别 SD 雄性大鼠共 60 只,对 40 只行 2 型糖尿病模型制备,取 20 只进入糖尿病组(DM 组),20 只进行前降支结扎制备成糖尿病合并心肌梗死模型进入糖尿病合并心肌梗死组(DMI 组),余 20 只健康大鼠作为空白组。喂养 1 w 后,对三组大鼠的心肌组织活性氧(ROS)、活性氮(RON)及过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、血红素氧化酶 1(HO-1)、核因子 E2 相关因子 2(Nrf2)表达情况进行比较,对 Nrf2-ARE 信号通路与糖尿病心肌梗死大鼠氧化应激的相关性应用 Pearson 法进行分析。结果:DM 组和 DMI 组大鼠心肌组织 HO-1、Nrf 表达水平与空白组相比较呈逐渐降低,且 DMI 组降低更为显著(F=28.432、20.501,均 P0.001);DM 组和 DMI 组大鼠心肌组织 ROS、RON、CAT、SOD 表达水平与空白组相比较呈逐渐升高,且 DMI 组升高更为显著(F=25.922、41.336、75.895、27.423,均 P0.001);Pearson 法分析结果表明,糖尿病心肌梗死大鼠心肌组织 ROS、RON 表达水平与 HO-1、Nrf 表达水平均呈负相关(r=-0.457、-0.658、-0.752、-0.512,均 P0.001)。结论:糖尿病心肌梗死大鼠Nrf2-ARE 信号通路可能通过 CAT、SOD 分子影响、调控其氧化应激反应,从而使细胞及组织避免受损,极具临床应用价值。关键词 Nrf2-ARE 信号通路;糖尿病心肌梗死;大鼠;氧化应激;作用机制基金项目:广东省医学科学技术研究基金项目项目编号:A2021141通讯作者:蔡承哲The Mechanism of Nrf2-ARE Signal Pathway Affecting Oxidative Stress in diabetes Patients with Myocar-dial Infarction LIU Ping-fang,CAI Cheng-zhe,FENG Xiao-qian,et al(Guangzhou 12th Peoples Hospital,Guangzhou 510620,China)Abstract:Objective To study oxidative stress in rats with myocardial infarction in diabetes and explore the mechanism of Nrf2-ARE signaling pathway.Method In this study,animal experiments were carried out.A total of 60 male SD rats of clean grade were taken,40 of them were made into type 2 diabetes models,20 of them were taken into the diabetes group(DM group),20 of them were made into the diabetes with myocardial infarction model by ligating the anterior descending branch,and the remaining 20 healthy rats were taken into the diabetes with myocardial infarction group(DMI group)as the blank group.After feeding for 1 week,the myocardi-al tissue reactive oxygen species(ROS),reactive nitrogen(RON),catalase(CAT),superoxide dismutase(SOD),heme oxygenase-1(HO-1),and nuclear factor E2 related factor 2 of three groups of rats were measured.Results Compared with the blank group,the expression levels of HO-1 and Nrf in the myocardial tissue of DM group and DMI group gradually decreased,while the expression levels of ROS、RON、CAT and SOD gradually increased,and the improvement was more significant in DMI group(F=28.432,20.501,25.922,41.336,75.895,27.423,all P0.001).The expression levels of ROS and RON in myocardial tissue of diabetes rats with myo-cardial infarction were negatively correlated with the expression levels of HO-1 and Nrf(r=-0.457,-0.658,-0.752,-0.512,all P0.001).Conclusion The Nrf2-ARE signaling pathway in diabetic myocardial infarction rats may regulate their oxidative stress re-sponse through CAT and SOD molecules,thereby avoiding cell and tissue damage,which has certain clinical application value.Key Words:Nrf2-ARE signaling pathway;Diabetic myocardial infarction;Rats;Oxidative stress;Mechanism of action 冠心病(CHD)病发的重要危险因素之一即为糖尿病(DM),其在心血管疾病的整个发生发展过程中起着重要的作用1。近年调查显示,CHD 的发病率已呈现下降趋势,但合并 DM 者却日益增多2。而 DM 合并 CHD 患者死亡风险相对更高,可促使心肌发生恶化,对患者预后生活质量产生严重的影响3。有研究显示,氧化应激损伤可加重 DM 患者心肌梗死的程度,而 Nrf2-ARE 信号通路是一种内源性抗氧化应答的机制,在氧化应激调控领域地位显著4。一方面,氧化应激可致使 Keap1-Nrf2 复合体发生解离,增加游离 Nrf2 的比例,而细胞质中的Nrf2 可以通过核膜进入细胞核中,对下游的二相解毒酶基因和抗氧化蛋白具有上调作用,进而产生氧化应激抑制作用5-6。氧化应激还可促进 Nrf2 蛋白的合成。相关研究显示,HO-1 等对 Nrf2-ARE 信号通路产生保护作用的内源性基因7。故本文探讨1203吉林医学 2023 年 11 月第 44 卷第 11 期Nrf2-ARE 信号通路对糖尿病心肌梗死大鼠氧化应激的影响,并对其作用机制进行研究,为糖尿病心肌梗死患者的临床诊治提供参考。1 材料与方法1.1实验动物:60 只清洁级别 SD 雄性大鼠,体重(156.8712.28)kg,均购于南京斯科瑞生物科技有限公司。链脲佐菌素(STZ)上海金畔生物科技有限公司。本次试验经过本院医学伦理委员会同意。1.2 造模与分组8-9:采用高热量饮食+STZ 注射方法制备 2 型糖尿病模型 40 只,随机分为糖尿病组(DM 组)和糖尿病合并心肌梗死组(DMI 组)两组,各 20 只。其中 DMI 组再通过结扎前降支的方式制备心肌梗死模型,另取 20 只健康大鼠作为空白组。其中糖尿病大鼠建模方法:采用 STA 注射+高热量饮食的方式制备糖尿病大鼠模型,高脂饲料喂养 6 w 以后,按照 30 mg/kg STZ 的量一次性腹腔注射,之后对尾血血糖水平采用血糖仪(G086 型;湖南达优医疗科技有限公司)进行测定,明显多尿且血糖值不小于 16.7 mmol/L 即为建模成功。心肌梗死建模方法:在呼吸机辅助下,左侧 23 肋骨间进行开胸手术,于肺动脉圆锥和左心耳交界位置下方2 mm 处进行前降支结扎处理。当近心尖的左室前壁变为暗灰色,收缩力消失或者降低时;心电图出现Q 波以及 ST 段弓背向上抬高,即为建模成功。1.3 活性氧(ROS)、活性氮(RON):各组大鼠均喂养 1 w 后,取心肌组织,采用连续缓冲液进行洗涤处理,取出适量心肌组织,再向其中加入适量的磷酸钾缓冲液以配成 10%匀浆液,离心分离,取上清。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对心肌组织 ROS、RON 水平进行测定,试剂盒购于艾美捷科技有限公司。1.4 Nrf2-ARE 信号通路相关因子的表达10-11:通过 Western 印迹法对 HO-1、Nrf 蛋白进行检测,取0.1 mg 保存的心肌组织,采用裂解液 500 l 进行裂解处理,冰浴后离心 10 min,取部分上清,心肌组织HO-1、Nrf 蛋白采用 BCA 蛋白测试试剂盒进行测定。采用上样缓冲液对剩余上清进行封闭处理,10 min 沸水浴后,-70 保存。各个样品进行凝胶电泳上样,之后转移至聚偏氟乙烯微孔膜,脱脂奶粉进行 60 min 的封存,在 4条件下进行一抗封闭处理,PBST 进行 3 次洗膜,15 min/次,二抗(1 4 000)处理,常温条件下进行 60 min 孵育,PBST 漂洗,采用凝胶系统对上述进行成像,目的条带灰度值通过Labwork4.6 进行分析,其中 HO-1 采用-actin 校正,Nrf2 采用 H1 校正。1.5 相解毒酶表达:取 1.3 中所述心肌组织上清液,通过氧化酶活性,采用分光光度法对心肌组织过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)水平进行测定,试剂盒购于上海研谨生物科技有限公司。1.6 统计学分析:采用统计学专用软件 SPSS20.0对上述资料进行整理分析,其中计量资料采用均数标准差(xs)表示,行 t 检验,多组间比较,行单因素方差分析,采用 Pearson 法对糖尿病心肌梗死大鼠氧化应激与 Nrf2-ARE 信号通路的相关性进行分析,并以 P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 各组大鼠心肌组织 Nrf2-ARE 信号通路相关因子的表达:与空白组相比,DM 组和 DMI 组大鼠心肌组织 HO-1、Nrf 表达水平逐渐降低,且 DMI 组降低更为显著,差异有统计学意义(P0.05)。见表 1 和图 1。表 1 各组大鼠心肌组织 Nrf2-ARE 信号通路相关因子的表达(xs,n=20)组别HO-1Nrf空白组1.340.120.610.08DM 组0.990.110.490.04DMI 组0.780.090.380.03F 值28.43220.501P 值0.0010.001 注:与空白组比较,P0.05;与 DM 组比较,P0.05a、b、c 分别表示 DMI 组、DM 组、空白组图 1 三组大鼠心肌组织 HO-1、Nrf 蛋白表达2.2 各组大鼠心肌组织 ROS、RON 水平表达:与空白组相比,DM 组和 DMI 组大鼠心肌组织 ROS、RON表达水平逐渐升高,且 DMI 组升高更为显著,差异有统计学意义(P0.05)。见表 2。2.3 糖尿病心肌梗死大鼠氧化应激与 Nrf2-ARE 信号通路的相关性:经 Pearson 相关性分析显示,糖尿病心肌梗死大鼠心肌组织 ROS 表达水平与 HO-1、Nrf 表达水平呈负相关,心肌组织 RON 表达水平与HO-1、Nrf 表达水平呈负相关,差异有统计学意2203吉林医学 2023 年 11 月第 44 卷第 11 期义(P0.05)。见表 3。表 2 各组大鼠心肌组织 ROS、RON 水平表达(xs,mol/L,n=20)组别ROSRON空白组21.433.037.652.09DM 组37.642.0119.081.56DMI 组42.185.2928.763.28F 值25.92241.336P 值0.0010.001 注:与空白组比较,P0.05;与 DM 组比较,P0.05表 3 糖尿病心肌梗死大鼠氧化应激与 Nrf2-ARE 信号通路的相关性项目ROSr 值P 值RONr 值P 值HO-1-0.4570.001-0.6580.001Nrf-0.7520.001-0.5120.0012.4各组大鼠心肌组织 CAT、SOD 的表达水平比较:与空白组相比,DM 组和 DMI 组大鼠心肌组织CAT、SOD 表达水平逐渐升高,且 DMI 组升高更为显著,差异有统计学意义(P0.05)。见表 4。表 4 各组心肌组织大鼠 CAT、SOD 的表达水平比较(xs,n=20)组别CAT(U/L)SOD(mol/L)空白组0.150.0232.833.20DM 组0.410.0552.195.03DMI 组0.630.0289.738.71F 值75.89527.423P 值0.0010.001 注:与空白组比较,P0.05;与 DM 组比较,P0.053 讨论 研究显示,DM 的病发与内分泌失调、氧化应激、环境、感染等因素关系密切,其中 MI 是重要的一种并发症12。氧化应激是机体在受到相关外界刺激时,体内产生的 ROS 和 RON 高活性分子过多,超出机体清除能力,会致使机体氧化还原系统失调,进而引发细胞内蛋白质等氧化性损伤,最终造成组织器官损伤和细胞凋亡13。为维持机体氧化还原平衡,机体会对多余的自由基进行清除。而 Nrf2-ARE 信号通路是近年抗氧化研究的热点,其介导的多种基因表达被认为是抗氧化的重要机制14。Nrf2-ARE 信号通路的激活可以有效降低 ROS 和RON 的产生,同时还可改善机体胰岛素抵抗状况,纠正患者生化功能紊乱,从而发挥抗氧化应激的功能,在 DM 合并心肌梗死的发生发展过程中起着重要的作用15。Nrf2-ARE 通路的核心分子是 Nrf2-和 HO-1。有研究显示,其在解毒、免疫调节、抗组织损伤抗炎、抗氧化等过程均具有重要作用,通过调节此通路可以发挥抗心脏、抗动脉粥样硬化等作用16。而氧化应激产生的 ROS 和 RON 会对细胞内大分子生物的生理功能产生间接或直接的影响,是引发糖尿病心肌梗死患者的重要病理基础17。文中相关性分析显示,糖尿病心肌梗死大鼠 Nrf2-ARE通路与氧化应激反应呈现负相关,这可能是由于机体在受到氧化应激损伤时,会形成一种复杂的抗氧化应激系统。近年研究显示,Nrf2-ARE 通路在抵抗外源性有毒物质和氧化应激损伤中作用显著,是目前最重要的一种内源性抗氧化通路18。有研究显示,对敲除 Nrf2 基因的小鼠,诱导性和基础性基因的表达显著降低,而小鼠 ROS 和 RON 生成量大大增加,氧化应激损伤程度增加,这也说明了 Nrf2-ARE 通路在小鼠氧化应激调控过程中作用显著19。本文结果显示,糖尿病心肌梗死组大鼠心肌组织 CAT、SOD 表达水平更高,故 Nrf2-ARE通路可能是通过对 CAT、SOD 的表达进行调控,进而实现抗氧化应激的作用。这主要是由于 CAT、SOD 是相解毒酶和抗氧化酶的代表物质,可以有效地对机体系统内的自由基进行有效清除,从而对 ROS 和 RON 的产生具有较好的预防作用。SOD 是以超氧化物阴离子自由基为主要底物,可以对体内歧化作用生成过氧化氢产生催化作用,是机体氧自由基重要的清除剂20。另外,在外界化学物质或者自由基的刺激下,Nrf2 可以被快速磷酸化,从而解离 Keap1,两者均被活化,被活化的Nrf2 在进入细胞核以后,会与 ARE 相互结合,进而对下游的蛋白酶体/分子伴侣、相解毒酶、抗氧化酶等基因表达和转录基因产生启动作用,促使CAT、SOD 等分子的大量表达,起抵抗外界有害刺激的功效21。而 HO-1 等氧化还原基因还是一种重要的内源性保护基因。上述蛋白相互之间会产生一种抗氧化的协同作用,对过量的 ROS 和 RON等分子产生清除效果,具有较好的细胞氧化应激对抗和氧化还原状态维持作用22。综上所述,糖尿病心肌梗死大鼠 Nrf2-ARE 信号通路可能通过 CAT、SOD 分子对其氧化应激反应进行调控,进而避免细胞和组织免受损伤,具有一定的临床应用价值。3203吉林医学 2023 年 11 月第 44 卷第 11 期4 参考文献1 Gueniat-Ratheau E,Mouhat B,Vergs B,et al.Prognostic value of HbA1c and plasma glucose on one-year mortality in non-diabetic patients after acute myocardial infarctionJ.Arch Cardiovasc Dis Suppl,2020,12(1):10-18.2Tsujimoto T,Kajio H.Optimal cardiac strategy based on the history of myocardial infarction in type 2 diabetic patients with coronary artery diseaseJ.Scientific Rep,2019,9(1):3502-3510.3 Martins A,Silva J,Gutierrez PS.Case 5/2019-55-year-old diabetic man with heart failure after non-st segment elevation myocardial infarctionJ.Arquivos Brasileiros de Cardiologia,2019,113(4):775-782.4 Guo X,Hong S,He H,et al.NFB promotes oxidative stress-induced necrosis and ischemia/reperfusion injury by in-hibiting Nrf2-ARE pathway-ScienceDirectJ.Free Radical Biol 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