Trib3基因在大鼠睾丸组织不同发育时期的表达研究.pdf

内蒙古医科大学学报2023 年 6 月第 45 卷第 3 期Trib3基因在大鼠睾丸组织不同发育时期的表达研究（1.内蒙古医科大学 医学神经生物学实验室，内蒙古呼和浩特010059；2.柳州市中医医院 检验科，广西柳州545001；3.内蒙古医科大学附属医院 甲乳外科，内蒙古呼和浩特010050）【摘要】目的 研究Trib3基因在大鼠睾丸组织不同发育时期的表达。方法 用RT-PCR、Western Blot、免疫组化等方法分别观察Trib3基因在大鼠精子生成过程中的表达情况。结果 mRNA表达量在野生型大鼠出生后2 12 d较高，4 d达到高峰；14 16日龄与212日龄间差异无统计学意义（P0.05）；20 35日龄与1416日龄比较，表达量显著降低，差异有统计学意义（P0.05）；40 65日龄与20 35日龄比较，表达量显著升高，差异有统计学意义（P0.05）。Trib3蛋白在 2 12日龄呈现较高表达；14 16日龄与2 12日龄比较，表达量显著降低，差异有统计学意义（P0.05）；40 65日龄与20 35日龄比较，表达量显著升高（P0.05）时，组间比较采用单因素方差分析，当不服从正态分布（sig0.05）时选择独立样本Kruskal-Wallis检验。根据大鼠睾丸组织发育情况将所取时间点分成四组，即212日龄、1416日龄、2035日龄、4065日龄，分别对应精子发生的有丝分裂、减数分裂、精子变形及精子成熟4个阶段。检验水准为0.05，以P 0.05为差异有统计学意义。2实验结果2.1Real-time qPCR 检测 Trib3 基因在大鼠精子生成过程中mRNA水平的表达实时荧光定量反应检出Trib3基因在三组不同窝别野生型大鼠出生后第265日龄21个时间点睾丸组织中的表达模式（见图1），数据用xs表示，*表示P 0.05）；2035日龄与1416日龄比较，Trib3 mRNA的表达量显著降低，差异有统计学意义（P 0.05）；4065 日龄与 2035 日龄比较，Trib3 mRNA的表达量显著升高，差异有统计学意义（P 0.05）。2.2Western Blot 检测三组不同窝别大鼠睾丸组织中Trib3的表达应用Western Blot反应检测Trib3在三组不同窝别的大鼠出生后第265日龄21个时间点睾丸组织中蛋白的表达（见图2），将条带放置于UVP凝胶成像仪中拍照测出灰度值，使用Microsoft Excel软件分析得到图3，数据用xs表示，*表示P 0.05。Trib3表达趋势在三组不同窝别的大鼠睾丸组织中基本一致，265 日龄 Trib3 蛋白均见表达，212 日龄Trib3呈现较高表达；1416日龄与212日龄比较，Trib3表达显著降低，差异有统计学意义（P 0.05）；4065日龄与2035日龄比较，Trib3的表达显著升高，差异有统计学意义（P 0.05）。图1Trib3基因在265日龄的大鼠睾丸组织中蛋白表达的RF PCR结果Fig.1RF PCR of Trib3 gene protein expression intesticular tissue of rats from 2 to 65 days of age图2Trib3基因在265日龄的大鼠睾丸组织中蛋白表达的Western Blot结果Fig.2Western Blot results of Trib3 gene proteinexpression in testicular tissue of 265 days rats图3在265日龄大鼠睾丸组织中Trib3蛋白的表达量Fig.3Trib3 protein expression in testicular tissue ofrats from 2 to 65 days2468 10 12 14 15 16 20 25 29 30 31 35 40 45 50 55 60 65野生型大鼠睾丸组织日龄2.521.510.50Trib3基因mRNA相对表达量2 468 10 12 14 15 16 20 25 29 30 31 35 40 45 50 55 60 65野生型大鼠睾丸组织日龄0.70.60.50.40.30.20.10Trib3基因蛋白表达量TRIB3GAPDHTRIB3GAPDH45kDa37kDa45kDa37kDa2d4d6d8d10d12d14d15d16d18d25d29dTRIB3GAPDH45kDa37kDa30d 31d 35d 40d 45d 50d55d 60d 65d 227Journal of Inner Mongolia Medical UniversityJune.2023Vol.45No.32.3免疫组织化学染色和HE染色观察野生大鼠睾丸Trib3表达定位情况固定取出的5、12、18、29及40日龄的大鼠睾丸组织，进行HE及免疫组织化学两种染色。5日龄睾丸处于精原干细胞增殖与生长时期之间。12日龄时已完成有丝分裂，将进入减数分裂。18日龄完成减数分裂，将进入精子变形。29日龄为圆形精子向长形精子变形后，精子成熟前的时期。40日龄位于成熟精子出现到大鼠性成熟之前的阶段。HE染色（见图4）镜下可见5、12、18、29及40日龄睾丸组织的结构。位于曲细精管外侧的肌样细胞围绕着基膜，内侧管壁由包含生精细胞及支持细胞的生精上皮构成，各级生精细胞随大鼠睾丸的生长发育逐渐显现，其中心为管腔，曲细精管之间可见睾丸间质。免疫组织化学染色及阴性对照（见图5），400倍镜下可见5日龄的睾丸组织精原干细胞胞质部分及部分睾丸间质呈现阳性结果，支持细胞、肌样细胞及睾丸间质细胞未见阳性结果。12、18、29及40日龄中睾丸间质的结缔组织纤维部分呈棕色阳性表达，曲细精管内各细胞及睾丸间质细胞均未见阳性结果。实验用PBS缓冲液作为阴性对照（见图5F），阴性对照图为40日龄的睾丸组织，对照组未见阳性表达。图45日龄、12日龄、18日龄、29日龄、40日龄大鼠睾丸组织HE染色Fig.4HE staining of testicular tissue from rats ageddays of 5,12,18,29,and 40A:5日龄大鼠睾丸组织HE染色（1040）各生精小管管腔切面较不规则，可见精原干细胞；B:12日龄大鼠睾丸组织HE染色（1040）管腔排列逐渐紧密，间质细胞增多；C:18日龄大鼠睾丸组织HE染色（1040）精母细胞较为明显；D:29日龄大鼠睾丸组织HE染色（1040）变形前，可见大量圆形精子细胞；E:40日龄大鼠睾丸组织HE染色（1040）长形精子产生，精子成熟前阶段A:HE staining（1040）of the testicular tissue of 5-day-old ratsshowed irregular luminal sections of each seminiferous tubule andvisible spermatogonial stem cells.B:HE staining（1040）of thetestis tissue of 12-day-old rats showed that the lumen becameclosely arranged and the Leydig cells increased.C:HE staining（1040）of the testis tissue of 18-day-old rats was more obviousin spermatocytes.D:On day 29,a large number of round spermatidswere observed before HE staining（1040）.E:HE staining（1040）of testicular tissue from 40-day-old rats for the production oflong-shapedsperm,prematurestageofspermABCDEA黑色箭头：精原干细胞阳性结果 蓝色箭头：支持细胞B黑色箭头：间质细胞C 黑色箭头：肌样细胞D黑色箭头：精母细胞E黑色箭头：精原细胞F阴性对照图55日龄、12日龄、18日龄、29日龄、40日龄大鼠睾丸组织免疫组化染色及阴性对照Fig.5Immunohistochemical staining of testiculartissue and negative control of rats aged days of 5,12,18,29,and 40A:5日龄大鼠睾丸组织免疫组化染色（1040）；B:12日龄大鼠睾丸组织免疫组化染色（1040）；C:18日龄大鼠睾丸组织免疫组化染色（1040）；D:29日龄大鼠睾丸组织免疫组化染色（1040）；E:40日龄大鼠睾丸组织免疫组化染色（1040）；F：野生型大鼠睾丸组织阴性对照染色40日龄（1040）A:Immunohistochemical staining of testicular tissue from 5-day-old rats（1040）;B:immunohistochemical staining of testiculartissue of 12-day-old rats（10 40）;C:immunohistochemicalstainingoftesticulartissueof 18-day-oldrats（1040）;D:Immu-nohistochemical staining of testicular tissue of 29-day-old rats（10 40）;E:immunohistochemical staining of testicular tissuefrom 40-day-old rats（1040）;F:negative control staining ofwild-typerattestistissueat40daysofage（1040）228内蒙古医科大学学报2023 年 6 月第 45 卷第 3 期3讨论大鼠的生长发育日龄对应着精子发生的三个阶段。大鼠出生至8日龄精原干细胞自我增殖7，15 日龄左右完成减数分裂，20日龄圆形精子产生，35 日龄后变形，55日龄左右大鼠性成熟，达到成年状态812。基因可通过上调和下调表达参与生物学功能13。通过对不同时期野生型大鼠睾丸组织的研究发现，有丝分裂及减数分裂时期Trib3基因的mRNA呈现高表达，精子变形阶段表达显著下降（P0.05），至精子成熟期表达升高（P0.05）。该基因蛋白在有丝分裂期呈现高表达，减数分裂及精子变形阶段表达降低（P0.05），精子成熟阶段表达升高（P0.05）。Trib3基因mRNA与蛋白水平的表达均呈现出先低表达再高表达的趋势，但两者表达趋势并非完全统一。生物体内普遍存在这种转录和翻译层面的差异，例如，在乳腺癌细胞系及人乳腺癌中，Trib3mRNA 的表达与蛋白表达就没有相关性14。当mRNA表达量下降，生物体会通过增长polyA，稳定mRNA减少自身降解，达到延长其半衰期的目的，从而使蛋白量表达升高15，16；或使蛋白降解水平下降，以此延长其半衰期，这时蛋白表达量也会增高17，18。当mRNA表达量高但不稳定，或翻译出的蛋白加速降解，都是导致蛋白量减少的因素。睾丸间质为疏松结缔组织，具有支持、连接、营养等作用。免疫组化结果显示Trib3表达于出生后第5日龄大鼠睾丸的精原干细胞胞质及部分睾丸间质；第12、18、29、40日龄及成年大鼠睾丸组织中，Trib3仅表达于间质的蜂窝状结缔组织纤维部分，间质细胞、支持细胞及各级生精细胞中均未见阳性表达。5日龄位于有丝分裂期间，提示该基因与精原干细胞的功能及睾丸间质内的纤维结构存在一定关系。综上所述，免疫组织化学染色显示有丝分裂时期Trib3 在精原干细胞呈阳性。与其他阶段相比，该时期 Trib3 基因 mRNA 及蛋白水平均呈现高表达。这提示Trib3基因可能参与了大鼠精原干细胞的增殖过程。大鼠睾丸组织中，12、18、29、40日龄大鼠Trib3 表达于睾丸间质的结缔组织纤维部分，提示该基因与睾丸间质结构存在一定关系。我们根据大鼠睾丸不同时间点发育规律及该基因在本实验中产生的实验结果进行分析研究，认为Trib3基因参与了大鼠睾丸的发育过程。4结论综上所述，得出结论：（1）Trib3基因可能参与了大鼠精原干细胞的增殖过程。（2）Trib3基因在睾丸间质中发挥一定作用。研究与精子发生过程有关的基因的分子机制，可以为探究男性不育的发病机理提供参考，为男性不育的诊治奠定基础。参考文献1孙祺，董昱辛，赵星科，等.内蒙古地区男性患者年龄、体质量指数与精液常规参数及DNA完整性的关系研究J.内蒙古医科大学学报，2023，45（S1）：14-172Hu CY，Lu DL，Wu T，et al.Glutathione-S-transferasesM1/T1 gene polymorphisms and male infertility risk in Chinesepopulations：a meta-analysisJ.Medicine，2019，98（6）：e141663Zhang Y，Luo F，Wu S，et al.Tribbles homolog 3 expressionin 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是将色谱的高效分离能力和质谱的特异、灵敏、多组分检测能力有机结合的定量分析方法。本研究建立了同时测定米氮平、舍曲林、帕罗西汀、度洛西汀、阿米替林、去甲阿米替林、艾司西酞普兰及劳拉西泮8种抗抑郁药物浓度的方法，参考 中华人民共和国药典13（2020年版）四部中“生物样品定量分析方法验证指导原则”对方法进行了验证，该方法操作简便，分析时间短，可以实现大量临床样本的快速分析。实验结果显示8个样品保留时间在1.912.81min，区分度好、专属性强；基质效应RSD小于15%；在最低有效浓度和警戒浓度范围内，准确度高、精密度好、线性关系良好；样品处理方法简单，且混合样品分析时间均不超过4 min，可以满足临床大样本快速处理分析的要求。采用本方法对临床患者血药浓度进行监测，根据患者血药浓度偏离有效浓度范围的实际情况，为医师用药的剂量调整提供了依据，有助于实现个体化给药。参考文献1王子惠，刘丽宏.医院门诊抗抑郁药处方点评与应用情况分析J.中国临床药理学杂志，2020，36（11）：1583-15852于莹，黄海量，张功，等.常用抗抑郁药的疗效与安全性的网状Meta分析J.中华中医药学刊，2020，38（10）：183-189+2953陈自悦，肖玲，王惠玲，等.新型抗抑郁药氯胺酮的研究进展J.临床精神医学杂志，2019，29（6）：426-4284王金亮，杨陈晨，杨琪，等.住院抑郁症患者抗抑郁药联合治疗的影响因素分析J.中国医院药学杂志，2019，39（20）：2081-20855Hiemke C，Bergemann N，Clement HW，et al.Consensusguidelines for therapeutic drug monitoring in neuropsychophar-macology 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