miR-499通过Drp1介导线粒体自噬保护缺氧_复氧心肌细胞.pdf

实用医学杂志 2023年第39卷第17期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.17miR-499通过Drp1介导线粒体自噬保护缺氧/复氧心肌细胞吴静 聂祖琼 尹琬凌华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院老年病科（武汉 430000）【摘要】目的探究miR-499对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用，并从线粒体自噬方面探究其可能机制。方法缺血/再灌注（I/R）诱导心肌细胞H9c2（2-1），建立缺氧/复氧（H/R）心肌细胞模型，使用miR-499 mimics和（或）P110处理细胞。将细胞分为BC组、I/R组、I/R+mi组、I/R+NC组、I/R+mi+P110组、I/R+NC+P110组。使用CCK8法检测细胞增殖，流式细胞术检测ROS、线粒体膜电位和细胞凋亡，试剂盒检测MDA、SOD、ATP 含量，qRT-PCR 和 Western blot 检测线粒体融合、分裂、自噬相关基因 Fis1、Mfn1、Parkin、LC3-、p62 和 Drp1 的 mRNA 和蛋白表达水平，透射电镜观察线粒体自噬。结果miR-499 mimics 和/或P110可使I/R诱导的心肌细胞增殖抑制率和凋亡率下降；线粒体膜电位下降、线粒体自噬减少、ATP含量上升；Fis1、Parkin、LC3-和Drp1的基因和蛋白表达水平下降，Mfn1和p62的基因和蛋白表达水平上升；细胞内ROS和MDA含量减少，SOD含量增加。结论miR-499可通过降低Drp1介导的线粒体自噬减少氧化应激的发生，从而保护I/R诱导的心肌细胞。【关键词】miR-499；线粒体分裂蛋白1；线粒体自噬；氧化应激；心肌缺血/再灌注【中图分类号】R54MiR499 protects hypoxia/reoxygenation（H/R）cardiomyocytes through Drp1mediated mitochondrial autophagy WU Jing，NIE Zuqiong，YIN Wanling.Department of Senile Disease，The Central Hospital of Wuhan，Affiliated to Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430000，China 【Abstract】Objective To explore the protective effect of miR499 on myocardial ischemiareperfusion injury and its possible mechanism from the aspect of mitochondrial autophagy.Methods Myocardial cell H9c2（21）was induced by ischemia/reperfusion（I/R），and hypoxia/reoxygenation（H/R）myocardial cell model was established.The cells were treated with miR499 mimics and/or P110.The cells were divided into BC group，I/R group，I/R+mi group，I/R+NC group，I/R+mi+P110 group and I/R+NC+P110 group.Cell proliferation was detected by CCK8 method.ROS，mitochondrial membrane potential and apoptosis were detected by flow cytometry.MDA，SOD and ATP contents were detected by their kit.The mRNA and protein expression levels of mitochondrial fusion，division and autophagy related genes Fis1，Mfn1，Parkin，LC3，p62 and Drp1 were detected by qRTPCR and Western blot.Mitochondrial autophagy was observed by transmission electron microscope.Results miR499 mimics and/or P110 can reduce the proliferation inhibition rate and apoptosis rate of myocardial cells induced by I/R.The mitochondrial membrane potential decreased.The mitochondrial autophagy decreased and the ATP content increased.The gene and protein expression levels of Fis1，Parkin，LC3 and Drp1 decreased，while those of Mfn1 and p62 increased.The content of ROS and MDA in cells decreased，but the content of SOD increased.Conclusions miR499 can reduce the occurrence of oxidative stress by reducing mitochondrial autophagy mediated by Drp1，thus protecting I/Rinduced cardiomyocytes。【Key words】microRNA499；Drp1；mitochondrial autophagy；oxidative stress；myocardial ischemia/reperfusion近年来，我国人民的饮食结构随着经济水平的提高而发生变化，导致心血管疾病的发生率也逐年升高，已成为中老年人生命安全的重大威胁。而缺血性心脏病在心血管疾病中是病死率较高的疾病之一1。心肌缺血主要是由于冠状动脉阻塞或狭窄引起供血不足导致心脏血流量减少、供氧不足，从而出现心肌损伤，严重时危及患者生命。治疗缺血性心脏病的主要措施是恢复心脏的供基 础 研 究doi：10.3969/j.issn.1006-5725.2023.17.008基金项目：武汉市卫生计生委科研计划资助项目（编号：WX21C17）2196实用医学杂志 2023年第39卷第17期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.17血，临床上主要采用药物治疗、冠状动脉介入治疗和旁路移植等方法2-3。但是再灌注会导致一系列不良后果，这一过程称为心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI）4。心肌细胞内含大量线粒体以供其能量需求5。在心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）时会导致线粒体受损以致最终细胞死亡6。线粒体分裂蛋白 1（dynamin-related protein 1，Drp1）是线粒体重要的分裂蛋白，其缺失可能导致线粒体功能障碍，并增加MIRI的易感性7。在正常生理状态下，心肌细胞内富含 miR-499，当心肌缺血时 miR-499含量显著降低8。因此，本研究通过建立心肌细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型，使用 miR-499 mimics 及 Drp1 抑制剂 P110 处理，探究miR-499 在 MIRI 中的作用，并从线粒体自噬方面探究其可能机制，为其在治疗MIRI方面提供理论支持。1材料与方法1.1主要试剂与仪器H9c2（2-1）细胞来源中国科学院上海细胞库。DMEM（Hyclone公司）；胎牛血清、Opti-MEM（Gibco公司）；PBS、0.25%胰蛋白酶、CCK8、10 mmol/L dNTP Mix、RIPA（强）组织细胞快速裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（solarbio）；Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen 公 司）；P110（Selleck）；活性氧（ROS）检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒（beyotime）；AnnexinV-FITC/PI 凋亡检测试剂盒（BD）；总超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、ATP 含量测试盒（南京建成）；Trizol（ambion）；SYBR FAST qPCR Master Mix（KAPA Biosystems）；Oligo（dT）18 Primer、PrimeScript RTase、Recombinant Rnase Inhibitor（TAKARA）；兔抗Fis1、Mfn1、DNM1L（Drp1）、Parkin、LC3-、p62、GAPDH 抗体、羊抗兔 IgG 抗体（bioswamp）。DMIL LED 倒置荧光显微镜、S6E 切片机（Leica 公司）；AMR-100酶标仪、Icen-24R高速冷冻离心机、超微量分光光度计（杭州奥盛）；NovoCyte 流式细胞仪（艾森）；GE48527PCR仪（杭州柏恒）；CFX-Connect 96荧光定量PCR仪（Bio-Rad）；Tanon-5200全自动化学发光分析仪（上海天能）；HT7700透射电镜（日立）。1.2方法1.2.1细胞培养将冻存的细胞复苏后于37，5%CO2的培养箱内培养。将细胞分为（1）对照组（BC）：不做处理；（2）I/R组（I/R）：放置于3.3 mmol/L H2O2培养 10 min，然后在 DMEM 培养基中恢复30 min；（3）I/R+miR-499 mimics组（I/R+mi）：miR-499 mimics转染H9C2细胞，细胞经过10 min缺氧和30 min 复氧处理；（4）I/R+miR-499 NC 组（I/R+NC）：miR-499 NC转染H9C2细胞，细胞经过10 min缺氧和30 min复氧处理；（5）I/R+miR-499 mimics+P110 组（I/R+mi+P110）：miR-499 mimics 转染后1 mol/L P1109处理H9C2心肌细胞3 h并进行10 min 缺氧和 30 min 复氧处理；（6）I/R+miR-499 NC+P110组（I/R+NC+P110）：miR-499 NC转染后 1 mol/L P110 处理 H9C2 心肌细胞 3 h 并进行10 min缺氧和30 min复氧处理。1.2.2细胞转染转染前 24 h 接种于 6 孔板，转染时细胞融合度为 70%。转染步骤如下：（1）在250 L Opti-MEM中加入100 pmol miRNA，吹吸混匀；（2）在250 L Opti-MEM中加入5 L Lipofectamine RNAiMAX，吹吸混匀，室温下静置5 min；（3）将（1）、（2）步骤液体混合、吹吸混匀，室温孵育 20 min；（4）将（3）中液体加入换有新鲜培养基的培养板细胞中，轻轻摇晃培养板；（5）将培养板置于 37，5%CO2的培养箱内，转染 4 h 后换新鲜培养基继续培养48 h；（6）检测转入基因表达水平。1.2.3CCK8 检测细胞增殖抑制率将细胞于96孔中培养过夜，按1.2.1中分组处理细胞，继续培养 30 min 后，每孔加入 10 L CCK8 溶液培养 4 h后在酶联免疫检测仪450 nm处测量各孔吸光值。1.2.4流式细胞术检测细胞ROS、线粒体膜电位和细胞凋亡按照ROS、线粒体膜电位和AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书处理后，在流式细胞仪上检测。ROS和线粒体膜电位使用NovoCyte分析软件进行分析，细胞凋亡使用NovoExpress分析软件进行分析。1.2.5 生化检测 按照 SOD、MDA 和 ATP 测试盒说明书进行处理后，分别于450、532和636 nm处检测吸光度。1.2.6实时荧光定量 PCR（qRTPCR）检测基因表达水平Trizol 法提取细胞 RNA，反转录获得第一链cDNA。采用qRT-PCR检测miR-499、Fis1、Mfn1、Drp1、Parkin、LC3-、p62 基因表达水平，miR-499以U6作为内参，其余以GAPDH作内参基因，引物序列见表1。1.2.7Western blot 法检测蛋白表达水平使用RIPA（强）组织细胞快速裂解液获得细胞蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。经SDS-PAGE胶的制备、上样及电泳、转膜、膜的封闭及抗体孵育后将膜置于全自动化学发光分析仪中检测，通过TANON GIS软件读取相关条带灰度值。1.2.8透射电镜观察线粒体自噬将样本经固定、浸透和包埋、超薄切片、染色后于透射电镜下观察并拍照。2197实用医学杂志 2023年第39卷第17期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.171.3统计学方法本实验中的生物学重复均为3（n=3），数据以均值标准差表示，使用SPSS 23.0软件对数据进行单因素方差分析和DUNCAN多重比较，P 0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.1miR499 转染效率相比对照组/miR-499 mimics NC 组，miR-499 mimics 组 中 miR-499 的mRNA 表达水平显著增加，见图 1。表示 miR-499 mimics细胞H/R模型构建成功。2.2miR499 mimics 对缺氧/复氧（H/R）诱导的心肌细胞细胞增殖的影响相对 I/R 和I/R+NC组，I/R+mi和I/R+NC+P110组的细胞增殖抑制率均显著下降（P 0.05）；相对 I/R+mi 和 I/R+NC+P110 组，I/R+mi+P110 组的细胞增殖抑制率显著下降（P 0.05）。见图2。2.3miR499 mimics对H/R诱导的心肌细胞凋亡率的影响相比BC组，I/R与I/R+NC组的细胞凋亡率显著上升（P 0.05）；相比I/R与I/R+NC组，I/R+mi和I/R+NC+P110组的细胞凋亡率显著下降（P 0.05）；相比I/R+mi和I/R+NC+P110组，I/R+mi+P110组的细胞凋亡率显著下降（P 0.05）。见图3。2.4miR499 mimics对H/R诱导的心肌细胞氧化应激的影响相比BC组，I/R与I/R+NC组细胞中的ROS和MDA含量显著上升（P 0.05），SOD含量显著下降（P 0.05）；相比I/R与I/R+NC组，I/R+mi和I/R+NC+P110组细胞中的ROS和MDA含量显著下降（P 0.05），SOD含量显著上升（P 0.05）；相比I/R+mi和I/R+NC+P110组，I/R+mi+P110组ROS和MDA含量显著下降（P 0.05），SOD含量显著上升（P 0.05）。见图4。2.5miR499 mimics对H/R诱导的心肌细胞线粒体膜电位的影响相比 BC 组，I/R 与 I/R+NC组细胞的线粒体膜电位显著上升（P 0.05）；相比I/R与I/R+NC组，I/R+mi和I/R+NC+P110组细胞的线粒体膜电位显著下降（P 0.05）；相比I/R+mi和I/R+NC+P110组，I/R+mi+P110 组细胞的线粒表1qRT-PCR引物序列Tab.1qRT-PCR primer sequences引物名称GAPDH-FGAPDH-RU6-FU6-RmiR-499-FmiR-499-RFis1-FFis1-RMfn1-FMfn1-RDrp1-FDrp1-RParkin-FParkin-RLC3-II-FLC3-II-Rp62-Fp62-R序列CAAGTTCAACGGCACAGCCAGTAGACTCCACGACATCTCGCTTCGGCAGCACATATACTACGCTTCACGAATTTGCGTGTCCTGGTGTCGTGGAGTCGGGGGGTTAAGACTTGCAGTGTTTGAATACGCCTGGTGCACATAATCCCGCTGCTCCGAATAATCGTTGGGATGCTTAACTCCTGTAATCTTGCCTGAATTGACATCTTGACCGCCTCCTGTGTGCTGTAGTTGCTCGCTCAACTTGGCTACTCCCACTCCTCGGCACCATACTCTTCGCCGACCGCTGTAGCGTGGGGTTGAGTTGCGGGATGACGACTGGACGTCTGTAGGAGCCTGGTGAG扩增片段大小（bp）1389356116241191129194141miR499*对照组miR499 mimics组miR499 mimics NC组151050Relative expression注：与对照组/miR-499 mimics NC组相比，*P 0.05图1miR-499 mimics转染效率Fig.1Transfection efficiency of miR-499 mimicsI/R+NC+P110I/R+mi+P110I/R+NCI/R+miI/R*#*0.40.30.20.10.0Cell inhibiting rate注：与I/R及I/R+NC组相比，*P 0.05；与I/R+mi及I/R+NC+P110组相比，#P 0.05图2miR-499 mimics处理后的细胞增殖抑制率Fig.2The cell inhibiting rate after miR-499 mimics treatment2198实用医学杂志 2023年第39卷第17期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.17105.8105104103101.8PIHQ211.07%Q221.40%Q243.34%Q2394.18%Q213.20%Q2229.32%Q241.77%Q2365.71%Q213.20%Q2229.32%Q241.77%Q2365.71%Q212.90%Q2222.10%Q243.38%Q2371.63%102.9104105106106.6FITCH102.9104105106106.6FITCH102.9104105106106.6FITCHBCI/RI/R+mi105.8105104103101.8PIH105.8105104103101.8PIH105.8105104103101.8PIH105.8105104103101.8PIH105.8105104103101.8PIH102.9104105106106.6FITCH102.9104105106106.6FITCH102.9104105106106.6FITCHQ213.01%Q2229.51%Q241.73%Q2365.75%Q212.71%Q228.67%Q249.19%Q2379.43%Q212.05%Q2216.75%Q245.17%Q2376.03%I/R+NCI/R+mi+P110I/R+NC+P110I/R+NCI/R+mi+P110I/R+NC+P110BCI/RI/R+mi#&*#403020100Apoptosis rate（%）注：与BC组相比，*P 0.05；与I/R及I/R+NC组相比，#P 0.05；与I/R+mi及I/R+NC+P110组相比，&P 0.05图3miR-499 mimics处理后的细胞凋亡率Fig.3The apoptosis rate after miR-499 mimics treatment4213002001000CountM26.97%Q2371.63%103.3104105106107.3FITCHBCI/RI/R+miI/R+NCI/R+mi+P110I/R+NC+P110I/R+NCI/R+mi+P110I/R+NC+P110BCI/RI/R+mi#&*#403020100ROS（%）M237.23%M230.57%M227.62%M221.28%M236.74%103.3104105106107.3FITCH103.3104105106107.3FITCH21916012080400Count300240180120600Count20216012080400Count376320240160800Count345240160800Count103.3104105106107.3FITCH103.3104105106107.3FITCH103.3104105106107.3FITCH#&*#&*#50403020100MDA（nmol/mgprot）100806040200SOD（U/mgprot）ABCI/R+NCI/R+mi+P110I/R+NC+P110BCI/RI/R+miI/R+NCI/R+mi+P110I/R+NC+P110BCI/RI/R+mi注：与BC组相比，*P 0.05；与I/R及I/R+NC组相比，#P 0.05；与I/R+mi及I/R+NC+P110组相比，&P 0.05；A为ROS；B为MDA；C为SOD图4miR-499 mimics处理后细胞氧化应激相关因子指标的变化情况Fig.4Changes in cell oxidative stress-related factors after miR-499 mimics treatment2199实用医学杂志 2023年第39卷第17期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.17体膜电位显著下降（P 0.05）。见图5。2.6miR499 mimics对H/R诱导的心肌细胞线粒体自噬的影响相比BC组，I/R与I/R+NC组细胞的线粒体自噬增加；相比I/R与I/R+NC组，I/R+mi和I/R+NC+P110组细胞的线粒体自噬减少；相比I/R+mi和I/R+NC+P110组，I/R+mi+P110组细胞的线粒体自噬减少。见图6。2.7miR499 mimics 对 H/R 诱导的心肌细胞中ATP含量的影响相比BC组，I/R与I/R+NC组细胞中线粒体含量显著下降（P 0.05）；相比I/R与I/R+NC组，I/R+mi和I/R+NC+P110组细胞中线粒体含量显著上升（P 0.05）；相比I/R+mi和I/R+NC+P110 组，I/R+mi+P110 组细胞中线粒体含量显著上升（P 0.05）。见图7。BCI/RI/R+mi105.1106107107.5FITCH105.1106107107.5FITCH105.1106107107.5FITCH105.1106107107.5FITCH105.1106107107.5FITCH105.1106107107.5FITCHI/R+NCI/R+mi+P110I/R+NC+P110107.1106105104103101.6PEH107.1106105104103101.6PEH107.1106105104103101.6PEH107.1106105104103101.6PEH107.1106105104103101.6PEH107.1106105104103101.6PEHQ210.15%Q2295.19%Q244.64%Q230.02%Q210.08%Q2266.65%Q2433.25%Q230.02%Q210.11%Q2271.97%Q2427.90%Q230.02%Q210.14%Q2265.91%Q2433.94%Q230.02%Q210.18%Q2280.30%Q2419.47%Q230.04%Q210.09%Q2277.80%Q2422.03%Q230.09%I/R+NCI/R+mi+P110I/R+NC+P110BCI/R+miI/R#&*#403020100JC1（%）注：与BC组相比，*P 0.05；与I/R及I/R+NC组相比，#P 0.05；与I/R+mi及I/R+NC+P110组相比，&P 0.05图5miR-499 mimics处理后细胞的线粒体膜电位Fig.5Mitochondrial membrane potential in cells treated with miR-499 mimicsI/R+NCI/R+mi+P110I/R+NC+P110BCI/RI/R+mi图6miR-499 mimics处理后细胞的线粒体自噬Fig.6Mitochondrial autophagy in cells treated with miR-499 mimics2200实用医学杂志 2023年第39卷第17期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.172.8miR499 mimics对H/R诱导的心肌细胞中线粒体分裂、融合、自噬相关基因和蛋白表达水平的影响相比 BC 组，I/R 与 I/R+NC 组细胞中 Fis、Parkin、LC3-和 Drp1 的基因和蛋白表达水平显著上升（P0.05），Mfn1 和 p63 的基因和蛋白表达水平显著下降（P0.05）；相比 I/R 与 I/R+NC 组，I/R+mi 和 I/R+NC+P110 组细胞中 Fis、Parkin、LC3-和 Drp1 的基因和蛋白表达水平显著下降（P 0.05），Mfn1和p63的基因和蛋白表达水平显著上升（P 0.05）；相比I/R+mi和I/R+NC+P110组，细胞中 Fis、Parkin、LC3-和 Drp1 的基因和蛋白表达水平显著下降（P 0.05），Mfn1和p63的基因和蛋白表达水平显著上升（P 0.05）。见图8。3讨论miRNA 是一类小分子 RNA，广泛存在于真核生物细胞中，在心脏疾病的发生发展中发挥重要作用10。研究发现8，miR-499在心肌细胞中特异性表达，与心肌细胞的分化密切相关，且可以抑制心肌细胞的凋亡11。本研究中miR-499 mimics和（或）Drp1 抑制剂 P110 处理 I/R 诱导的心肌细胞后，细胞的增殖抑制率和凋亡率都显著下降，表示miR-499对心肌细胞具有保护作用。机体内许多生理过程都参与MIRI，包括内质网应激、炎症反应、线粒体损伤、细胞凋亡、自噬、ATP能量代谢障碍、钙超载、氧自由基爆发等12。其中，自噬发挥着重要作用，其依赖溶酶体将细胞内受损的细胞器降解以维持细胞稳态13。在 I/R发生时，突发的供血供氧会导致线粒体中发生大量活性氧的生成、氧化应激及炎症反应等，导致线粒体的受损，从而引起心肌细胞能量供应障碍、促凋亡因子的释放，最终导致细胞死亡6。因此，及时清除受损线粒体，维持细胞的正常功能，对治疗 MIRI 十分重要。线粒体自噬是一种特殊的自噬，能够将细胞内损伤的线粒体降解清除，对维持心肌细胞稳定具有重要意义14。当心肌缺血时，线粒体自噬被激活，清除细胞内受损的线粒体，减少氧化应激的发生以保护心肌细胞；当再灌注时，线粒体自噬被过度激活，正常的线粒体被清除，导致心肌功能损伤加重15。因此，在 MIRI 中调控线粒体自噬成为了治疗缺血性心脏病中的重要策略之一。在线粒体动力学中，由一组GTP酶来调节线粒体的融合和分裂，线粒体融合蛋白 Mfn1 在线粒体外膜的融合过程中发挥重要作用16。线粒体的分裂是将膜电位受损的子线粒体从健康的线粒体中分裂出来。正常膜电位的子线粒体可以与其他线粒体融合，膜电位降低的子线粒体不能与其他线粒体融合，而是被溶酶体吞噬降解17，从而形成线粒体自噬。Drp1是GTP酶超家族蛋白成员之一，主要存在于细胞质中。Drp1从细胞质向线粒体募集的过程是线粒体分裂的重要步骤18，这个过程由几个线粒体膜蛋白介导，其中包括 Fis119。线粒体自噬可依赖泛素途径与 LC3 结合介导，由假定激酶 PINK1 和Parkin 调控20。p62 是 LC3 的适配器蛋白21。本研究中，miR-499 mimics和（或）P110处理I/R诱导的心肌细胞后，细胞中 ATP 含量上升，线粒体膜电位下降，自噬发生减少，且Fis1、Parkin、LC3-、Drp1 基因的 mRNA 和蛋白表达水平均下降，而Mfn1和p62基因的mRNA和蛋白表达水平均上升，表明 miR-499 可以使细胞中线粒体膜电位去极化，线粒体融合上升，线粒体自噬下降，且与Drp1有密切关系。细胞自噬与氧化应激存在相互作用22。MIRI时心肌细胞中的线粒体发生功能障碍，产生过量自由基，激活氧化应激，产生大量MDA、ROS。机体存在许多防御过程对抗氧化应激，包括 GSH-Px、CAT 及 SOD 等23。本研究中，miR-499 mimics和（或）P110 处理 I/R 诱导的心肌细胞后，细胞中ROS、MDA含量下降，SOD含量上升，表明miR-499可以降低I/R诱导导致的心肌细胞中氧化应激的升高。综上所述，miR-499 可使 I/R 诱导的心肌细胞增殖抑制率降低、凋亡率降低，且通过 Drp1 介导降低细胞线粒体自噬、减少氧化应激从而保护细胞。本研究完善了 miR-499 减轻 MIRI 的机制研究，为靶向治疗MIRI提供了新思路。I/R+NC+P110I/R+NCI/R+miI/R+mi+P110I/RBC#&*#1 0008006004002000ATP（mol/g prot）注：与BC组相比，*P 0.05；与I/R及I/R+NC组相比，#P 0.05；与I/R+mi及I/R+NC+P110组相比，&P 0.05图7miR-499 mimics处理后细胞中ATP含量变化Fig.7Changes in ATP content in cells treated with miR-499 mimics2201实用医学杂志 2023年第39卷第17期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.17【Author contributions】WU Jing designed the study，performed the experiments and wrote the article.NIE Zuqiong performed the experiments YIN Wanling revised the article and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.参考文献1 ROTH G A，MENSAH G A，JOHNSON C O，et al.Global burden of cardiovascular diseases and risk factors，1990-2019：update from the GBD 2019 study J.J Am Coll Cardiol，2020，76（25）：2982-3021.2 WANG J，TOAN S，ZHOU H.New insights into the role of mitochondria in cardiac microvascular ischemia/reperfusion injuryJ.Angiogenesis，2020，23（3）：299-314.3 XIANG M，LUY，XIN L，et al.Role of oxidative stress in reperfusion following myocardial ischemia and its treatments J.Oxid Med Cell Longevity，2021，2021：6614009.4 TANAKA K.The PINK1-Parkin axis：an overview J.Neurosci Res.，2020，159：9-15.5 陈希妍，马彦娟，牛丽丹，等.缺糖缺氧心肌细胞中miRNA-#&*#I/R+NC+P110I/R+NCI/R+miI/R+mi+P110I/RBCRelative expression#&*#&*#Mfn1Parkin#&*#Drp1p62#&*#LC3#&*#&*#&*#&*#&*#&*#&*#3210#&*#Relative expression1.51.00.50.0Relative expression543210Relative expression43210Relative expression1.51.00.50.0Relative expression43210Parkin/GAPDH0.80.60.40.20.0Mfn1/GAPDH0.80.60.40.20.0Fis1/GAPDH0.80.60.40.20.0LC3/GAPDH0.60.40.20.0p62/GAPDH0.80.60.40.20.0Drp1/GAPDH0.80.60.40.20.0LC3p62Drp1GAPDHParkinMfn1Fis1ABFis1I/R+NC+P110I/R+NCI/R+miI/R+mi+P110I/RBCI/R+NC+P110I/R+NCI/R+miI/R+mi+P110I/RBCI/R+NC+P110I/R+NCI/R+miI/R+mi+P110I/RBCI/R+NC+P110I/R+NCI/R+miI/R+mi+P110I/RBCI/R+NC+P110I/R+NCI/R+miI/R+mi+P110I/RBCI/R+NC+P110I/R+NCI/R+miI/R+mi+P110I/RBCI/R+NC+P110I/R+NCI/R+miI/R+mi+P110I/RBCI/R+NC+P110I/R+NCI/R+miI/R+mi+P110I/RBCI/R+NC+P110I/R+NCI/R+miI/R+mi+P110I/RBCI/R+NC+P110I/R+NCI/R+miI/R+mi+P110I/RBCI/R+NC+P110I/R+NCI/R+miI/R+mi+P110I/RBCI/R+NC+P110I/R+NCI/R+miI/R+mi+P110I/RBC注：A为mRNA表达水平；B为蛋白表达水平。与BC组相比，*P 0.05；与I/R及I/R+NC组相比，#P 0.05；与I/R+mi及I/R+NC+P110组相比，&P 0.05图8miR-499 mimics处理后细胞中线粒体分裂、融合、自噬相关基因mRNA和蛋白表达水平Fig 8The mRNA and protein expression levels of mitochondrial division，fusion，and autophagy-related genes in cellstreated with miR-499 mimics2202实用医学杂志 2023年第39卷第17期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.17155对Notch信号通路及自噬和凋亡的影响 J.实用医学杂志，2021，37（3）：304-307.6 BUGGER H，PFEIL K.Mitochondrial ROS in myocardial ischemia reperfusion and remodeling J.Biochim Biophys Acta，Mol Basis Dis，2020，1866（7）：165768.