MiR-21-5p介导自噬异常在可溶性尿酸诱导肾小管上皮细胞炎症反应中的作用.pdf

中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 1 MiR-21-5p 介导自噬异常在可溶性尿酸诱导肾小管上皮细胞炎症反应中的作用 严 业 何文姬 谢恺庆（通讯作者）广西医科大学第二附属医院肾内科，广西 南宁 530008 摘要：摘要：目的 探讨可溶性尿酸（SUA）诱导肾小管上皮细胞（HK-2 细胞）炎症反应下 miR-21-5p 与自噬异常的关系。方法 建立 SUA 诱导 HK-2 细胞炎症模型，检测炎症因子 MCP-1、miR-21-5p 和自噬标志蛋白 Beclin 1、LC3-II 和 P62 的表达。将 miR-21-5p 转染至 HK-2 细胞，经 SUA 干预，检测 MCP-1、LC3-II 和 P62 的蛋白表达情况。结果 SUA 诱导 HK-2 细胞炎症发生，miR-21-5p 表达明显下降，自噬标志蛋白 Beclin-1、LC3-II 和 P62 的表达均增加。可溶性尿酸干预 miR-21-5p 转染的 HK-2 细胞，检测显示：相较于 NC 组，UA 组的炎症蛋白 MCP-1、自噬标志蛋白 LC3-II、P62 表达显著增加；且相较于 UA 组，UA+miR-21 mimics 组的 MCP-1 也表达增加，但 LC3-II 表达下降，P62 表达增加；而 UA+miR-21 inhibitor 组 LC3-II 和 P62 的表达增加。结论 在可溶性尿酸诱导的 HK-2 细胞炎症反应中，miR-21-5p 与炎症密切相关，可能通过介导自噬异常进行调控；其或可能成为可溶性尿酸诱导的肾小管上皮细胞炎症的一种新型的生物学标志物。关键词：关键词：可溶性尿酸；炎症；miR-21-5p；自噬；CKD 中图分类号：中图分类号：R589 0 引言 慢性肾脏病（CKD）是一种全球流行性疾病，第六次中国慢性病及危险因素监测报告，我国 CKD 患病率约为 8.2，老龄、吸烟、肥胖、高血压、糖尿病等人群患病率增加1。大量证据表明，miR-21-5p（以下简称 miR-21）与肾脏疾病联系紧密2，通过介导自噬3、细胞凋亡4/焦亡5、TGF-1 诱导的纤维化6等进行调控。自噬对维持肾细胞稳态、肾脏结构和功能是必不可少的，自噬缺陷会增加肾损伤的风险，导致肾纤维化7。SUA 可诱导肾小管上皮细胞炎症，甚至导致肾纤维化，加重 CKD8，但其与 miR-21 的研究一直未得到阐明。据此，研究设计探讨 miR-21 在可溶性尿酸诱导肾小管上皮细胞炎症的作用及其成为生物学标志物的可能性。1 实验方法 1.1 细胞培养及干预 将 HK-2 细胞均匀接种于六孔板中培养，待其生长铺满孔板面积的 80时，去除旧培养基，PBS 缓冲液清洗后加入含 12 mg/dl 的 SUA 的完全培养基，作用12、24h。实验设立空白对照组（NC 组），SUA 干预 12、24h 的 UA(12h)组、UA(24h)组。1.2 细胞转染 细胞长满六孔板约 80，弃旧液后清洗细胞，加入混匀的转染复合物，余下一孔加入等量的无血清培养基。转染 24h 后，检测 miR-21 的表达，确定进行细胞转染的 miR-21 模拟物及其阴性对照物所需的 siRNA浓度为 20 nM，miR-21 抑制剂及其阴性对照物的浓度为 30 nM。1.3 转染后干预 重新于 60mm 细胞培养皿中均匀接种培养 HK-2 细胞，确定转染浓度后将铺满培养皿 80的细胞随机分为空白对照组（NC 组）、尿酸组（UA 组）、尿酸+miR-21模拟物阴性对照组（UA+miR-21 mimics NC 组）、尿酸+miR-21 模拟物组（UA+miR-21 mimics 组）、尿酸+miR-21 抑制剂阴性对照（UA+miR-21 inhibitor NC 组）和尿酸+miR-21 抑制剂组（UA+miR-21 inhibitor 组），按组别进行具体转染。转染完成后，除空白对照组，其余 5 组均用 12 mg/dl 的 SUA 刺激 HK-2 细胞 12h。1.4 统计学方法 所有数据均采用 SPSS 22.0 进行统计分析，以均数标准差(x s)表示。两组比较采用独立样本 t检验，多组间比较采用方差分析；P0.05，差异有统计学意义。中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 2 2 结果 2.1 SUA 诱导 HK-2 细胞炎症因子 MCP-1 产生 HK-2 细胞经可溶性尿酸干预 24h 内，RT-qPCR 检测炎症因子 MCP-1 的 mRNA 表达均显著上调（P0.05或 P0.01），见于下图 1A；Western blot 检测炎症蛋白 MCP-1 的表达也明显增加（在尿酸刺激 12h 时 P0.05，在尿酸刺激 24h 时 P0.01），见于下图 1B；并且 MCP-1 在 mRNA 和蛋白水平上的表达均随着时间的增加而增加，有一定的时间依懒性（P0.05）。图 1 SUA 诱导 HK-2 细胞后 MCP-1 的表达情况 2.2 SUA 诱导 HK-2 细胞对 miR-21 表达的影响 12mg/dl 的可溶性尿酸溶液干预 HK-2 细胞 12、24h后，RT-qPCR 检测炎症反应下 miR-21 表达水平，结果显示：miR-21在可溶性尿酸刺激作用12h（P0.0001）、24h（P0.01）后均可见表达明显下降；且可溶性尿酸溶液刺激 HK-2 细胞后，miR-21 在 12h 时表达下降达到低谷，随后表达增加（增加明显，P0.01，有统计学意义），但相较于对照组，其在 24h 时依旧表现为表达下降，具体可见下图 2。图 2 SUA 诱导对 miR-21 表达的影响 2.3 SUA 干预 HK-2 细胞后对自噬的影响 12mg/dl的可溶性尿酸溶液刺激HK-2细胞12h后，Western blot 检测自噬标志蛋白 Beclin-1、LC3-II 和P62 的表达水平，结果显示：与对照组相比，尿酸干预组的自噬标志蛋白 Beclin-1（P0.05）、LC3-II（P0.01）和 P62（P0.05）的表达均增加，且 LC3-II 与 LC3-I的比值也增加（P0.05），见下图 3。图 3 SUA 干预 HK-2 细胞对自噬的影响 2.4 转染后干预对 HK-2 细胞 MCP-1 表达的影响 miR-21 转染 HK-2 细胞 24h 后，SUA 干预 12h，Western blot 检测炎症蛋白 MCP-1 的表达情况。结果显示：与 NC 组相比，UA 组的 MCP-1 表达增加（P0.001）；UA 组、UA+miR-21 mimics NC 组、UA+miR-21 inhibitor NC 组与 UA+miR-21 inhibitor 组的 MCP-1表达结果无差别；相较于 UA 组，UA+miR-21 mimics 组的 MCP-1 表达增加（P0.05），见下图 4。图 4 SUA 干预对 miR-21 转染后 HK-2 细胞 MCP-1 表达的影响 2.5 转染后干预对自噬的影响 12mg/dl 的可溶性尿酸溶液干预 miR-21-5p 转染后的 HK-2 细胞 12h 后，Western blot 检测自噬标志蛋白 LC3-II 和 P62 的表达水平，结果显示：与 NC 组相比，UA 组的 LC3-II 表达增加（P0.001），P62 表达也增加（P0.05）；UA 组、UA+miR-21 mimics NC组和 UA+miR-21 inhibitor NC 组的 LC3-II 和 P62 表达结果均无差别；相较于 UA 组，UA+miR-21 mimics组的 LC3-II 表达下降，P62 表达增加（P0.05）；UA+miR-21 inhibitor 组 LC3-II 和 P62 均表达增加（P0.05），见下图 5。3 讨论 中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 3 图 5 SUA 干预 miR-21 转染后 HK-2 细胞对自噬的影响 肾脏疾病患者常可观察到无症状的高尿酸血症9-10。尿酸诱导内皮细胞减少，减少 NO 释放，增加与单核细胞的粘附性以及黏附分子的表达，血管平滑肌细胞增殖增加并迁移，释放高迁移率族蛋白 1 以及炎症趋化因子，包括 MCP-1；促进巨噬细胞黏附11。过往研究认为，尿酸促炎作用主要是尿酸盐晶体作用，如通过激活 NLRP3 炎症小体诱导炎症反应12。随着研究的开展，可溶性尿酸的促炎作用得到了很好的研究。无论缺氧与否，SUA 可激活 NLRP3 炎症小体，增加 IL-1 的表达，发挥促炎作用13-15。课题组前期研究也证实了SUA 的促炎作用，且炎症因子 MCP-1 在一定范围内与时间和剂量呈正相关16。本研究显示，可溶性尿酸干预后，MCP-1 表达具有时间依懒性，证实了可溶性尿酸的促炎作用，提示细胞炎症模型成功建立，且在 24h 内，随着时间的增加，炎症加重。在高尿酸血症中，miRNAs表达差异明显，并与MCP-1、CRP、血肌酐和 eGFR 水平密切相关17。在本次研究中，miR-21 在 SUA 刺激后表达下降，随着炎症的加重，miR-21 表达增加，但依旧低于正常水平，提示 miR-21可能与炎症反应密切相关；同时，可能有细胞保护程序参与了炎症反应调节。本研究似乎也肯定了这一点：在SUA 干预后，自噬标志蛋白 Beclin-1、LC3-II 和 P62的表达明显增加，LC3-II/LC3-I 也增加，提示 SUA 诱导自噬活化，自噬可能参与了炎症反应。研究发现，高糖可通过诱导 miR-21 抑制 RECK 表达，加重糖尿病肾病18。在肾病综合征患者血清中，miR-21 显著上调，且与 TGF-1、IL-18 表达水平呈正相关19。据此，实验设计用 SUA 干预 miR-21 转染后的HK-2 细胞，miR-21 模拟物加重了炎症反应；miR-21 抑制剂对炎症无明显影响，几乎与 miR-21 抑制剂阴性对照物的致炎水平一致，可能与 SUA 刺激 HK-2 细胞后，miR-21 表达显著下降相关，提示可能只有达到一定水平的 miR-21 才具有致炎作用。另外，LC3-II 和 P62 经SUA 诱导后表达增加，表明在炎症反应下自噬诱导激活；miR-21模拟物抑制了自噬，自噬小体形成减少；而miR-21 抑制剂逆转了这种诱导，活化自噬，自噬小体增加。此外，miR-21 可靶向抑制 TLR4，进一步抑制 NF-kB/NLRP3 通路，减轻炎症反应和细胞焦亡，促进肾小管上皮细胞的修复5。在肾缺血再灌注损伤中，miR-21表达增加，介导 NRK-52E 细胞自噬异常，并通过靶向Rab11a，降低细胞活力，诱导细胞凋亡3。课题组前期研究发现，自噬调控 SUA 诱导 HK-2 细胞炎症反应，且靶向 TLR4 介导自噬流异常20。本研究首次披露了 miR-21 介导自噬，影响可溶性尿酸诱导 HK-2 细胞炎症，但具体机制未知，或可能通过靶向 PTEN21、PDCD422和TLR423介导减轻炎症反应，实验有待进一步研究。综上所述，在 SUA 诱导的 HK-2 细胞的炎症反应中，miR-21 与炎症密切相关，并可能介导自噬异常，加重肾小管上皮细胞炎症，可能成为可溶性尿酸诱导肾小管上皮细胞炎症反应的一种生物学标志物。参考文献 1WANG L,XU X,ZHANG M,et al.Prevalence of Chronic Kidney Disease in China:Results From the Sixth China Chronic Disease and Risk Factor Surveillance J.JAMA Intern Med,2023,183(4):298-310.2FIERRO-FERNNDEZ M,MIGUEL V,LAMAS S.Role of redoximiRs in fibrogenesis J.Redox 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