Calpain_Calpastatin 在离体心脏中的表达分析.pdf

中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 9 Calpain/Calpastatin 在离体心脏中的表达分析 宋俊杰1 滕小梅2 叶文学1 1.苏州大学附属第一医院心脏大血管外科，江苏 苏州 215006 2.苏州大学心研所，江苏 苏州 215006 摘要：摘要：目的 研究 Calpain/Calpastatin 系统在离体心脏中表达变化规律并探索 Calpastatin 过表达的方法，为离体心脏保护机制研究提供方法。方法（1）获取小鼠心脏后用微量灌注泵灌注 HTK 液 2 h，置于 4 HTK 心脏保存液中，模拟离体心脏冷缺血 2 h、3 h、4 h、5 h、6 h 的状态，测量心肌组织中 Calpain-1、Calpain-2、SBDPs 及 Calpastatin 蛋白的表达；（2）经小鼠左心室腔内注射含有 Calpastatin 基因腺病毒载体（Ad-CAST），48 h 后提取心肌组织，检测 Calpastatin 的蛋白表达。结果（1）离体心肌组织中的 Calpain-1 在 3 h、4 h、5 h、6 h 的蛋白表达量均较 2 h 升高，且第 5 h 达最高；Calpain-2 在 3 h、4 h、5 h、6 h 的蛋白表达量均较 2 h升高，且在第 5、6 h 达最高；SBDPs 在 3 h、4 h、5 h、6 h 的蛋白表达量均较 2 h 组织升高，且第 6 h 达最高值；Calpastatin 在 4 h、6 h 的蛋白表达较 2 h 升高，在 3 h、5 h 的蛋白表达无明显差异。（2）经小鼠左心室注射含有 Ad-CAST 基因腺病毒载体 48 h 后，心肌组织中的 Calpastatin 蛋白表达量明显提高。结论（1）HTK液保存下随着时间延长离体小鼠心脏 Calpain-1 和 Calpain-2 表达量增加，Calpain 活性增加，Calpain/Calpastatin 平衡打破。（2）通过小鼠左心室注射含有 Ad-CAST 基因腺病毒载体，可提高心肌组织中Calpastatin 蛋白表达量。关键词：关键词：离体心脏；Calpain；Calpastatin；Spectrin；腺病毒 中图分类号：中图分类号：R4 心脏移植已成为心脏终末期心脏病的有效治疗手段，但是仍然面临器官供需严重不成正比、器官保存时间较短等问题1。目前静态冷保存是心脏保存最常用方法2，但经此种方法保存下心脏保存时间被限制于 4-6小时内3。因此如何延长器官的保存时间、减轻供心损伤等对心脏移植具有重要的意义，本文拟针对延长供心保存时间和降低心肌损伤进行初步研究。钙蛋白酶（Calpain）是一类依赖钙离子激活的蛋白酶，在细胞周期、收缩、细胞凋亡、细胞迁移、细胞分化和细胞信号转导等过程中起重要作用4，其中 Calpain-1 和 Calpain-2 为两种经典、普遍存在的钙蛋白酶。在心肌损伤过程中，Calpain 是作为一种促进剂存在的。血影蛋白(Spectrin)是一种内源性钙蛋白酶底物，可作为 Calpain 活化的标志，在细胞坏死过程中，Calpain可剪切 Spectrin 产生大小为 150 kDa 和 145 kDa 的分解产物(Spectrin Break Down Products,SBDPs)5,6。Calpastatin 是一种内源性抑制蛋白，可与Calpain-1 和 Calpain-2 发生特异性结合，从而抑制 Calpain-1 和 Calpain-2 酶解活性7，研究表明过表达 Calpastatin 通过抑制内质网应激减轻心肌梗死后心肌损伤8。基于上述研究结果猜想随着心脏离体时间延长 Calpain 酶活性增加，Calpain/Calpastatin 平衡打破，导致心肌损害加重，通过 Calpastatin 过表达抑制 Calpain 激活进而保护离体心脏。本研究旨在分析 Calpain/Calpastatin 系统在离体心脏中表达变化规律并探索 Calpastatin 过表达的方法，为离体心脏保护机制研究提供方法。1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物 实验使用健康成年的 8-10 周龄雄性 C 57 小鼠，体重 20-25 g，由苏州大学动物中心提供，动物的使用均通过苏州大学动物伦理委员会的批准，按照实验动物管理规范执行所有动物相关实验操作。1.1.2 主要实验试剂 HTK 心肌保护液；Anti-Calpain-1 Large Subunit 抗体、Anti-Calpain-2 Large Subunit 抗体、Anti-Calpastatin 抗体、Anti-Spectrin 抗体；Anti-GAPDH 中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 10 抗体；Goat anti-rabbit Ig G、Goat anti-mouse Ig G、RIPA 裂解液、第二抗体稀释液。1.2 实验方法 1.2.1 获取离体心脏供体 小鼠麻醉满意后固定于手术操作台上，分别游离、结扎并剪断无名动脉及左颈总动脉。游离出左锁骨下动脉与左颈总动脉之间的主动脉弓部，于其中间将主动脉弓部横断。游离升主动脉与肺动脉，在左右肺动脉分岔处剪断并游离肺动脉，最后一次性结扎肺静脉及左上腔静脉并于结扎远端剪断。供体心脏摘取完成并浸泡于 4 的 HTK 心肌保护液中。1.2.2 离体小鼠心脏体外灌注 HTK 将离体心脏连接静脉留置针并接注射器，缓慢匀速以 4 预冷 HTK 心肌保护液冲洗冠状动脉，然后将注射器固定于微量输液泵上。灌注 HTK 90 min，灌注共计 1.5 mL。继续 4 HTK 液保存 0 h、1 h、2 h、3 h、4 h，模拟离体心脏冷缺血 2 h、3 h、4 h、5 h、6 h 的状态，后将心肌组织剪碎经液氮快速降温后冻存于-80 冰箱。1.2.3 小鼠左心室注射 小鼠成功麻醉后固定于试验台，触及小鼠心脏波动最强处，以胰岛素针刺入心室，回抽可见回血，分别注入 100 L Ad-Gal、100 L Ad-Calpastatin（Ad-Cast）腺病毒，48 h 后提取心肌组织，经液氮快速降温后冻存于-80 冰箱。1.2.4 检测 Calpain-1、Calpain-2、SBDPs 及Calpastatin 的蛋白表达 使用 RIPA 裂解液裂解贴壁细胞及组织样品，使用匀浆器充分裂解组织，并利用超声仪破碎细胞/组织。4 离心 15 min，收集上清，BCA 法测量蛋白质浓度，经 10%SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白质后，200 mA 恒流转膜 120 min，将含有蛋白质的 NC 膜在 5%脱脂奶粉中室温封闭 60 min，第一抗体 4 C 摇床上孵育过夜，PBST 洗涤 3 次，每次 10 min，第二抗体室温摇床孵育 60 min，回收第二抗体，加入洗涤液，在摇床上洗涤 5-10 min，共洗涤 3 次，用显影定影试剂盒配置显影液和定影液进行手工洗片、显影。1.2.5 统计学方法 本实验数据均采用 Mean SD 表示，使用SPSS19.0 软件进行统计学分析，单因素方差分析，两组间比较采用 LSD 法，P0.05 有统计学意义。2 结果 2.1 Calpain/Calpastatin 在离体心脏中的表达变化 结果可见离体心肌组织中的 Calpain-1 在 3 h、4 h、5 h、6 h 的蛋白表达量均较 2 h 升高，且第 5 h 达最高（图 1 A）；Calpain-2 在 3 h、4 h、5 h、6 h 的蛋白表达量均较 2 h 升高，且在第 5、6 h 达最高(图1 B)，离体心肌组织中的 SBDPs 在 3 h、4 h、5 h、6 h 的蛋白表达量均较 2 h 组织升高，且第 6 h 达最高值（图 1 C）；Calpastatin 4 h、6 h 蛋白表达较 2 h升高，3 h、5 h 无明显差异（图 1 D）。（A）（B）（C）(D)分别表示 Calpain-1、Calpain-2、Calpastatin、SBDPs 在心肌组织中的表达特征图及定量图；其中 Calpain-1 与 Calpain-2 在 5 h、6 h 的蛋白相对含量与 2 h 相比增加*p0.05，n3；SBDPs 在 6 h 的蛋白相对含量与 2 h 相比增加*p0.05，n3；Calpastatin 在 4 h、6 h 的蛋白相对含量与 2 h 相比相对含量升高，但p0.05，n3 图 1 离体 C 57 小鼠心肌组织中的蛋白检测 2.2 心肌组织中高表达 Calpastatin 蛋白 选取转染内皮细胞中高表达Calpastatin蛋白（图2 A）的腺病毒。取 100 L 注射入小鼠左心室腔内，48小时后提取心肌组织，可见心肌组织中Calpastatin蛋白表达明显增加（图 2 B）。（A)Western Blot 检测内皮细胞中的 Calpastatin 蛋白表达；（B）Western Blot 检测小鼠心肌组织中 Calpastatin蛋白表达 图 2 内皮细胞及小鼠心肌组织蛋白检测 中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 11 3 讨论 自 1967 年 Christiaan Barnard 在南非开普敦完成世界首例人心脏移植手术已 50 余年 9,10。虽然有主动脉球囊反搏、体外膜肺氧合、左心室辅助及成熟的外科技术用于治疗心脏功能衰竭，但心脏移植仍是心脏疾病晚期、心力衰竭的标准治疗方法。但这一治疗方式面临器官供需严重不成正比、保存时间较短等问题，延长离体心脏的保存时间、减轻供心损伤在临床治疗中显得尤为重要。本研究发现 HTK 液保存下离体小鼠心脏，在离体5h、6h 时 Calpain-1 和 Calpain-2 蛋白表达明显量增加，其底物蛋白 Spectrin 的分解也明显增加，两者均表明 Calpain 酶活性增高，其抑制剂 Calpastatin蛋白虽有微幅升高但无统计学意义，因此可推断随着时间延长 Calpain/Calpastatin 平衡系统被打破，Calpain 将损伤心肌组织，限制心脏保存时间。腺病毒具有转基因效率高、侵染率高且灭活等优势被应用于基础研究，在心血管病的基因治疗中其应用范围也很广泛11,12，本实验通过用腺病毒搭载 Calpastatin 基因过表达载体，于小鼠左心室进行注射，结 果 显 示 心 肌 组 织 中 Calpastatin 大 量 表 达，Calpastatin 是一种内源性抑制蛋白，有望通过Calpastatin 过表达抑制 Calpain 活性，保护离体心脏。本实验阐述 Calpain/Calpastatin 在离体心脏中的表达变化，以此为起点，可针对心肌的功能影响、移植后心肌功能的恢复、免疫排斥反应、过表达Calpastatin 对离体心脏的保护效果及超出 6 h 的保护效果等方面研究。综上所述，本次实验研究证明了离体小鼠心脏在离体 5 h 后出现 Calpain-1 和 Calpain-2 高表达，Calpain/Calpastatin 平衡打破，Calpain 酶活性增高，损伤心肌组织，限制心脏保存时间；通过小鼠左心室注射含有 Calpastatin 基因腺病毒载体，可高表达Calpastatin，为离体心脏保护研究提供有效的方法。参考文献 1Potena,L.Unraveling the Process of the Dying Heart:Do Not Leave Science Alone for the Heart to Live AgainJ.Transplantation,2016,100(12):2521-2523.2Jing,L.Organ preservation:from the past to the futureJ.Acta Pharmacol Sin,2018,39(5):845-857.3Da Silveira Cavalcante,L.and S.N.Tessier,Zebrafish as a New Tool in Heart Preservation ResearchJ.J Cardiovasc Dev Dis,2021,8(4).4Masoumeh Hosseini,M.H.N.,;Kimia Kahrizi,Calpains Diverse Functions but EnigmaticJ.Arch Iran Med,2018,21(4):10.5Rolius,R.Inhibition of calpain but not caspase activity by spectrin fragmentsJ.Cell Mol Biol Lett,2010,15(3):395-405.6Lambert,M.W.,Nuclear alpha spectrin:Critical roles in DNA interstrand cross-link repair and genomic stabilityJ.Exp Biol Med(Maywood),2016,241(15):1621-38.7Averna,M.Age-dependent degradation of calpastatin in kidney of hypertensive rats.J Biol Chem,2001,276(42):38426-32.8Li,S.Over-expression of calpastatin attenuates myocardial injury following myocardial infarction by inhibiting endoplasmic reticulum stressJ.J Thorac Dis,2018,10(9):5283-5297.9MS,B.,Heart transplantation an experimental.S.A.MEDICAL JOUR AL,1967:2.10Cooper,D.K.C.,Lifes defining moment:Christiaan Barnard and the first human heart transplantJ.J Heart Lung Transplant,2017,36(12):1273-1275.11Greenberg,B.,Gene therapy for heart failure.Trends Cardiovasc Med,2017,27(3):216-222.12Yla-Herttuala,S.and A.H.Baker,Cardiovascular Gene Therapy:Past,Present,and FutureJ.Mol Ther,2017,25(5):1095-1106.作者简介：作者简介：宋俊杰（1992），男，汉族，河南开封人，住院医师，硕士研究生，研究方向为移植免疫。