组织特异性基因敲除小鼠生产的动物遗传学综合实验设计.pdf

第卷 第期 年月：组 织 特 异 性 基 因 敲 除 小 鼠 生 产 的 动 物 遗 传 学综 合 实 验 设 计熊燕，熊 显 荣，李 志 雄，付伟，王利，林 亚 秋（西 南 民 族 大 学 畜 牧 兽 医 学 院，成 都）摘要：设 计 了 脂 肪 组 织基 因 特 异 敲 除 小 鼠 生 产 及 基 因 型 鉴 定 的 综 合 实验。该 实 验 采 用 线 上 线 下 混 合 的 形 式，以 科 研 成 果 组 蛋 白 赖 氨 酸 去 甲 基 化 酶 基 因 编 辑 杂 合 小 鼠 和 脂 联 素（）介 导 的 环 化 重 组 酶（，）工 具 小 鼠 为 材 料，通 过 设 计 小 鼠 的 杂 交 实 验方 案，获 得代 小 鼠。采 用 聚 合 酶 链 式 反 应（，）技术 对代 小 鼠和的 基 因 型 进 行 鉴 定，筛 选 脂 肪 组 织 特 异基 因 敲 除 小 鼠（）。该 实 验 设 计 涵 盖 经 典 遗 传 学 孟德 尔 分 离 定 律 和 自 由 组 合 定 律、分 子 遗 传 学 的 基 本 理 论、分 子 生 物 学 检 测 技 术、基因 编 辑 技 术、介 导 组 织 特 异 性 基 因 敲 除 等 知 识 与 技 能。具 有 综 合 性、设 计性 及 研 究 性 的 特 点。关 键 词：基 因 敲 除 动 物；基 因 型 鉴 定；线 上 线 下 混 合 模 式；动 物 遗 传 学 实 验中 图 分 类 号：文 献 标 志 码：文 章 编 号：（），（，）：“”，：；收 稿 日 期：基 金 项 目：四 川 省 高 等 教 育 人 才 培 养 质 量 和 教 学 改 革 项 目（）；西 南 民 族 大 学 教 育 教 学 研 究 与 改 革 重 点 项 目（）作 者 简 介：熊燕（），女，羌 族，四 川 茂 县 人，博 士，副 教 授，主 要 研 究 方 向 为 动 物 遗 传 育 种 与 繁 殖。：；：通 信 作 者：林 亚 秋（），女，内 蒙 古 阿 荣 旗 人，博 士，教 授，副 院长，主 要 研 究 方 向 为 动 物 遗 传 育 种 与 繁 殖、实 验 室 管 理。：；：引言在“双 一 流”高 等 教 育 背 景 下，学 生 对 课 程 知 识 的掌 握 程 度 只 是 评 价 教 学 质 量 好 坏 的 标 准 之 一，学 生 的应 用 能 力 和 创 新 思 维 培 养 才 是 关 键。实 验 教 学 是理 工 农 医 等 学 科 专 业 课 教 学 必 不 可 少 的 实 践 环 节。高 质 量 的 实 验 教 学 不 仅 要 实 现 对 理 论 教 学 内 容 的 内化，而 且 更 要 注 重 学 生 实 践 能 力、创 新 能 力 及 解 决 复 杂第期熊燕，等：组 织 特 异 性 基 因 敲 除 小 鼠 生 产 的 动 物 遗 传 学 综 合 实 验 设 计问 题 综 合 能 力 的 培 养。目 前 动 物 遗 传 学 课 程 实 验教 学 主 要 以“教 师 演 示学 生 照 做”的 教 学 模 式 进 行授 课。教 师 提 前 准 备 好 实 验 相 关 试 剂 耗 材；按 照实 验 指 导 书 给 学 生 进 行 讲 解 和 指 导，缺 乏 多 元 化 和 现代 化 教 学 手 段，学 生 的 参 与 度 有 限，较 难 提 高 学 生 对 实验 的 兴 趣 和 主 动 性。随 着 信 息 技 术 的 快 速 发 展，针 对上 述 实 验 教 学 中 的 普 遍 存 在 的 问 题，融 合 线 上 线 下 的教 学 平 台，教 学 设 计 体 现 学 生 的 主 体 地 位，采 用 混合 式 教 学 模 式 将 极 大 提 高 学 生 的 参 与 度 和 积 极 性。高 等 教 育 教 学 活 动 和 科 学 研 究 相 辅 相 成，年教 育 部 发 布 关 于 深 化 本 科 教 育 教 学 改 革 全 面 提 升 人才 培 养 质 量 的 意 见 ，鼓 励 教 师 将 最 新 科 研 成 果 转 化为 教 学 内 容。可 见 高 校 科 研 与 教 学 相 结 合 进 行 创新 人 才 培 养 是 时 代 的 需 要，也 是 高 校 坚 持“以 本 为 本”的 体 现，同 时 亦 是 提 高 实 验 教 学 水 平 的 有 效 途 径。本 教 学 团 队 成 员 长 期 围 绕 组 蛋 白 去 甲 基 化 酶基 因 探 索 其 在 胚 胎 发 育、骨 骼 肌 生 长 和 脂 肪 沉 积 中 的生 物 学 功 能，构 建 了 基 因 编 辑 小 鼠，保存 有 卵 母 细 胞、骨 骼 肌（）和 脂 肪 组 织（）特 异 表 达 基 因 启 动 子 介 导表 达 的 工 具鼠。以 教 研 团 队 的 基 因 编 辑 小 鼠（）和工 具 鼠 科 为 材 料，通 过 设 计代 杂 交 实 验方 案，提 取 小 鼠 基 因 组，采 用技 术 检 测和的 基 因 型，旨 在 获 得 脂 肪 组 织 特 异 的基 因 敲 除 小 鼠。该 实 验 教 学 设 计 采 用 线 上 线下 混 合 的 模 式，融 入 经 典 遗 传 学 与 本 学 科 前 沿 知 识 与技 能，具 有 综 合 性、设 计 性、研 究 性 及 趣 味 性 的 特 点；教学 设 计 以 学 生 为 中 心，充 分 提 高 学 生 的 参 与 度 及 主 动性，真 正 培 养 了 学 生 实 践 能 力、创 新 能 力 及 解 决 复 杂 问题 的 综 合 能 力。实 验 教 学 设 计随 着 基 因 编 辑 技 术 的 快 速 发 展 及 应 用 优 势 的 不 断突 显，该 技 术 已 加 入 最 新 版 动 物 遗 传 学 教 材 中，在生 物 技 术 其 他 相 关 课 程 作 为 独 立 章 节 进 行 介 绍。在 动物 生 产 中，研 究 者 利 用 该 技 术 制 备 了 基 因 编 辑 猪、羊 等家 畜 动 物，在 生 物 医 学 和 动 物 分 子 育 种 领 域 取 得 了 重大 突 破。因 此 紧 密 结 合 学 科 发 展 前 沿 及 产 业 需 求，本 实 验 教 学 设 计 了 基 于 基 因 编 辑 技 术 及 检 测 手 段 的 综合 实 验（见 图），实 验 内 容 丰 富、新 颖 有 趣；在 教 学 方式 上，融 合 线 上 和 线 下 实 践 平 台，在 课 前、实 践 课 堂 和课 后 多 个 维 度 调 动 学 生 的 积 极 性 及 参 与 度。课 前 学 习通 过 小 规 模 专 有 在 线 课 程（，）平 台 学 习 基 因 编 辑、等 实 验 相关 前 沿 技 术 原 理、熟 悉 实 验 操 作 手 册、发 布 获 得 脂 肪 组织 特 异敲 除 小 鼠 的 任 务，引 导 学 生 利 用图 基 因 脂 肪 组 织 特 异 敲 除 小 鼠 获 得 及基 因 型 鉴 定 实 验 教 学 设 计 和小 鼠 设 计 杂 交 原 理 获 得 小 鼠 的 实 验 方 案，满 足 学 生 的个 性 化 学 习 的 需 求；小 鼠 杂 交 实 验 操 作 相 对 简 单，但 整 个 周 期 较 长，鉴 于 本 教 学 团 队 在 科 研 项 目 实 施 过程 中 已 获 得代 的 小 鼠，教 师 仅 需 课 前 准 备代 小鼠 即 可。课 堂 学 习首 先 实 验 小 组 以形 式 汇 报 小 鼠 杂 交 方 案，学生 互 动，教 师 给 予 点 评 指 导，优 化 实 验 方 案，以 期 快 速高 效、最 低 成 本 获 得 脂 肪 组 织 特 异基 因 敲 除小 鼠；然 后 教 师 解 析 小 鼠纯 化 及 基 因 型 分 型 关 键步 骤，并 强 调 注 意 事 项；学 生 正 式 开 始 实 验，教 师 及 时指 导 学 生 的 实 验 过 程，并 做 好 学 生 实 践 情 况 的 详 细 记录，作 为 实 验 成 绩 的 评 价 指 标 之 一。课 后 学 习学 生 完 成 实 验 后，分 析 实 验 数 据 并 按 要 求 撰 写 实验 报 告；将 实 验 报 告 上 传 至的 作 业 模 块，每 份 实验 报 告 至 少 由位 同 学 进 行 互 评，系 统 自 动 去 掉 最 高分 与 最 低 分，获 得 平 均 分；教 师 根 据 实 验 课 的 过 程 记录、结 果 讨 论 及 分 析，对 实 验 成 绩 进 行 确 认；最 后 反 思整 个 教 学 设 计 及 实 施 过 程，线 上 补 充 薄 弱 知 识 点，进 行线 上 互 动 和 讨 论。实 验 部 分 实 验 目 的（）深 入 理 解 基 因 编 辑 技 术 的 原 理 及 在 动 物 生 产中 的 应 用；（）正 确 设 计 动 物 杂 交 实 验 方 案，获 得 基 因 敲 除动 物；（）熟 练 运 用技 术 对 动 物 进 行 基 因 分 型 及第卷个 体 鉴 定。实 验 动 物、仪 器 及 试 剂实 验 动 物基 因 编 辑 杂 合 小 鼠（）和小 鼠。试 剂组 织提 取 试 剂 盒（天 根 生 化 科 技 有限 公 司）、引 物、琼 脂 糖、核 酸 染 料、等。仪 器组 织 超 声 破 碎 仪、离 心 机、水 平 电 泳 仪、凝胶 成 像 系 统、仪、超 微 量 紫 外 分 光 光 度 计（）。基 因 编 辑 纯 合 小 鼠 杂 交 方 案 设 计根 据 现 有 两 个 品 系 小 鼠 基 因 型 分 别 为 和小 鼠，利 用 孟 德 尔 的 基 因 分 离 定 律 和 自由 组 合 定 律 原 理，通 过 设 计代 的 杂 交 实 验，最 后 获 得基 因 型 为，并 画 出 遗 传 图 谱。小 鼠 耳 组 织 基 因 组纯 化小 鼠 耳 组 织 的纯 化 按 照 天 根 生 化 科 技 有 限公 司（货 号：）的 操 作 手 册 进 行 实 验，关 键 步 骤如 下：（）小 鼠 耳 组 织 超 声 打 碎 为 细 胞 悬 液，然 后 离 心，去 上 清，加 入 的缓 冲 液，振 荡 至 彻 底 悬 浮。（）加 入 混 匀 后，在 放 置，直 至组 织 溶 解。（）加 入 缓 冲 液，充 分 颠 倒 混 匀，放 置，溶 液 应 变 清 亮。（）加 入 无 水 乙 醇，充 分 振 荡 混 匀，此 时 可 能 会 出 现 絮 状 沉 淀。（）将 上 一 步 所 得 溶 液 和 絮 状 沉 淀 都 加 入 一 个 吸附 柱中，离 心，弃 废 液。（）向 吸 附 柱中 加 入 缓 冲 液，离 心，弃 废 液。（）向 吸 附 柱中 加 入 漂 洗 液，离 心；并 重 复 洗 涤 一 次；弃 废 液 后，吸 附 柱 室 温 放 置 数 分 钟 晾 干。（）将 吸 附 柱转 入 一 个 干 净 的 离 心 管 中，向吸 附 膜 的 中 间 部 位 悬 空 滴 加 洗 脱 缓 冲 液，室 温 放 置 ，离 心，将 溶液 收 集 到 离 心 管 中。基 因 组的 质 量 检 测以 洗 脱 缓 冲 液为 空 白，用分光 光 度 计 测 纯 化溶 液 的 浓 度 和 吸 光 度 值，比 值 应 该 在 。超 过 该 范 围 意 味 着样 品 中 可 能 存 在 蛋 白 质 或污 染。将质 量 符合 要 求 的 样 品，稀 释 到 浓 度 为 。和基 因 型检 测以 提 取 的 基 因 组为 模 板，采 用 和的 检 测 引 物（见 表）进 行扩 增，对、和的 基 因 型 进 行 鉴 定。扩 增 体 系：，上 下 游 引物 各，反 应 程 序 见表。表基 因 分 型 检 测 的 引 物 序 列名 称引 物 序 列（）产 物 长 度 表 和的反 应 程 序的反 应 程 序的反 应 程 序循 环 温 度 时 间 循 环 温 度 时 间 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测取 反 应 的 扩 增 溶 液，加 入的 琼 脂糖 凝 胶（含 核 酸 染 料）的 点 样 孔，设 置（点样）孔，用 缓 冲 液 进 行 电 泳，下 电泳，电 泳 结 束 后 利 用 凝 胶 成 像 系 统 观 察 并 照 相。结 果 与 分 析 杂 交 方 案 及 遗 传 图 谱利 用系 统 获 得 脂 肪 组 织 特 异 敲 除 小 鼠，即重 组 酶 特 异 识 别基 因 两 侧 的位点，切 除基 因 序 列 见 图（）。现 有 和小 鼠 品 系，设 计 可 行 的 杂 交方 案，获 得 脂 肪 组 织 特 异 的敲 除 小 鼠，即 基 因型 为（见 图）。如 图（）所示，首 先 选 择 的 公 母 小 鼠 交 配 获 得 纯 合 小 鼠（代）；然 后 将 纯合 小 鼠 与杂 交 筛 选 小 鼠（代）；最 后 将 小 鼠 与 纯 合 小 鼠 交 配，筛 选 小 鼠（代）。第期熊燕，等：组 织 特 异 性 基 因 敲 除 小 鼠 生 产 的 动 物 遗 传 学 综 合 实 验 设 计（）切 除基 因 序 列（）小 鼠 杂 交 方 案图获 得 小 鼠 的 杂 交 方 案图 为脂 肪 组 织 特 异 敲 除 小 鼠 纯 化 质 量 检 测提 供只代 小 鼠 的 耳 组 织 样 品，按 照 试 剂 盒操 作 手 册 纯 化，采 用 微 量 分 光 光 度 计 测 定 其 浓 度及 纯 度。首 先 用 洗 脱 缓 冲 液校 正 仪 器，吸 取 样 品 进 行 测 定。如 表所 示的 浓 度 在 左 右，比 值 均 在 之 间，测 定 峰 值为 单 峰（见 图），说 明 提 取 的质 量 满 足 后 续实 验 的 需 求。表 样 品 浓 度 及 纯 度 检 测样 品编 号浓 度（）样 品编 号浓 度（）琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 图 谱根 据 设 计 引 物 目 的 条 带 大 小，判 断 小 鼠 基 因 型。针 对小 鼠 的 基 因 型，扩 增 片 段 大 小 仅 为，出 现 和 两 条 带 为 杂 合小 鼠（），扩 增 片 段 大 小 仅 为 野 生 型图纯 化浓 度 测 定 结 果小 鼠（）。针 对小 鼠 的 基 因 型，出现 的 条 带，即 为小 鼠，否 则 为小 鼠。如 图所 示，、号 是 小 鼠，也 是 本 实 验 所 需 要 获（）（）图琼 脂 糖 凝 胶 检 测 小 鼠 基 因 分 型 的 结 果第卷得 的 脂 肪 组 织基 因 特 异 敲 除 的 小 鼠。、号 是 小 鼠；、号 为杂 合 小 鼠（），、为纯 合 小 鼠（）。表 明 通过代 的 杂 交 实 验 可 获 得 组 织 组 织基 因 特 异敲 除 小 鼠，其 比 例 为。实 验 教 学 效 果“基 因 脂 肪 组 织 特 异 敲 除 小 鼠 生 产 及 基因 型 鉴 定”实 验 教 学 设 计 及 教 学 过 程 具 有 高 阶 性、创新 性 和 挑 战 度，充 分 调 动 学 生 的 积 极 性 与 参 与 度，提 高学 生 解 决 复 杂 问 题 的 综 合 能 力，培 养 学 生 实 践 和 创 新能 力。“三 个 维 度”调 动 学 生 的 积 极 性 与 参 与 度该 实 验 教 学 设 计 在 课 前、实 践 课 堂 及 课 后 体 现 了“以 学 生 为 中 心”的 教 学 理 念。课 前 学 习 内 容 紧 扣 学科 发 展 前 沿 及 行 业 需 求，小 鼠 杂 交 方 案 设 计 的 任 务 驱动 环 节 具 有 探 究 性，提 高 了 学 生 的 主 动 性 及 课 程 的 趣味 性。实 践 课 堂 教 学，小 组 成 员 全 程 参 与 杂 交 方 案 汇报、方 案 优 化 研 讨 及 实 验 操 作，教 师 加 强 每 个 小 组 的 过程 记 录，及 时 给 予 反 馈；此 外，所 提 供 小 鼠 的 基 因 型 教师 亦 未 知，实 验 具 有 挑 战 性 与 研 究 性，实 验 结 果 使 学 生更 有 获 得 感。课 后，学 生 积 极 参 与 同 学 实 验 报 告 的 互评 及 讨 论 交 流。以 上 教 学 设 计 与 实 施 充 分 利 用 线 上 线下 平 台 融 合，从 多 个 维 度 让 学 生 忙 起 来，提 高 学 生 的 参与 度。提 高 学 生 解 决 复 杂 问 题 的 综 合 能 力该 实 验 涉 及 遗 传 学 的 多 个 经 典 与 前 沿 知 识，包 括孟 德 尔 分 离 定 律 和 自 由 组 合 定 律、分 子 遗 传 学 的 基 本理 论、分 子 生 物 学 检 测 技 术、基 因 编 辑 技 术、组 织 特 异 性 基 因 敲 除 技 术 等。实 验 本 身 具 有 很 强 的 综合 性 与 设 计 性，加 上 检 测 小 鼠 的 基 因 型 事 先 未 知，提 高实 验 的 挑 战 度 与 探 究 性。在 整 个 杂 交 实 验 设 计 及 操 作过 程 中，需 要 学 生 有 理 论 联 系 实 际、化 繁 为 简、有 机 整合 的 工 作 与 学 习 思 路，锻 炼 了 学 生 解 决 复 杂 问 题 的 综合 能 力。培 养 学 生 实 践 与 创 新 能 力该 实 验 内 容 源 于 本 教 学 团 队 的 科 研 成 果，基 因 编 辑 小 鼠 由 团 队 首 次 构 建，实 验 内容 具 有 前 沿 性；在 杂 交 实 验 设 计 环 节，每 组 的 设 计 方 案不 拘 一 格，锻 炼 了 学 生 的 创 新 思 维；课 前、课 中 和 课 后都 有 不 同 形 式 的 讨 论 环 节 及 作 业 互 评，极 大 地 锻 炼 学生 的 辩 证 与 批 判 思 维。结语“脂 肪 组 织基 因 特 异 敲 除 小 鼠 获 得 及 基因 型 鉴 定”的 综 合 实 验 设 计，已 在 动 物 遗 传 学 的 实 验教 学 取 得 较 好 的 教 学 效 果。鉴 于 该 实 验 动 物 为 小 鼠、实 验 内 容 前 沿，实 验 具 有 综 合 性、挑 战 性 及 创 新 性，同样 可 作 为 生 物 技 术、生 物 工 程、医 学 等 专 业 遗 传 学 课 程的 实 验 教 学 内 容 进 行 推 广。此 外，本 实 验 教 学 设 计 基于 线 上 线 下 混 合 的 教 学 模 式，融 合 线 上 线 下 平 台 资 源，体 现 学 生 的 主 体 地 位，极 大 提 高 学 生 的 主 动 性 及 参 与度，这 种 模 式 为 其 他 实 验 课 教 学 提 供 了 借 鉴。参 考 文 献（）：王颖基 于 双 一 流 专 业 建 设 的 大 学 课 堂 实 践 教 学 规 范 化 研 究湖 北 经 济 学 院 学 报（人 文 社 会 科 学 版），（）：鲁 黎 明，余 国 武，罗慎，等面 向“新 农 科”的 实 验 教 学 示 范中 心 建 设 及 人 才 培 养 模 式 创 新 高 教 学 刊，（）：龚 淑 玲，黄驰，侯 安 新以 学 生 为 中 心，激 发 学 习 兴 趣，提 高化 学 实 验 教 学 效 果 实 验 技 术 与 管 理，（）：殷文，柴强，李 玲 玲，等“新 农 科 建 设”背 景 下 农 学 专 业实 践 教 学 的 改 革 与 创 新 高 教 学 刊，（）：毕 瑜 林，江勇，白皓，等动 物 生 产 类 专 业 实 践 教 育 教 学 模式 改 革 的 路 径 分 析 中 国 家 禽，（）：熊 宏 齐基 于 虚 拟 仿 真 的 线 上 线 下 融 合 专 业 实 验 教 学 体 系 构 建实 验 技 术 与 管 理，（）：王 圣 程，姜慧，黄 兰 英，等科 教 融 合 下 高 分 子 材 料 阻 燃 性 能提 升 实 验 教 学 拓 展 探 索 实 验 室 研 究 与 探 索，（）：周 一 恒，程 德 强，吴 新 忠，等融 合 科 研 思 维 训 练 的 电 类 基 础 实验 教 学 实 践 实 验 技 术 与 管 理，（）：牛 庆 玮，刘 永 红，黄保以 科 教 融 合 育 人 观 为 指 导 培 养 大 学生 科 技 创 新 能 力 实 验 技 术 与 管 理，（）：杨 显 英，熊 显 荣，蔡 雯 ，等牦 牛基 因 克 隆 及 其 在 不同 组 织 和 减 数 分 裂 进 程 的 表 达 农 业 生 物 技 术 学 报，（）：，（）：，（）：，（）：马 宇 浩，高爽，董 向 会，等基 因 编 辑 在 农 业 动 物 中 的 应 用 进展 农 业 生 物 技 术 学 报，（）：葛 亚 明，苗 志 怀，薛睿，等满 足 学 生 个 性 化 发 展 需 求 的 实 验教 学 研 究 与 课 程 建 设 实 验 室 研 究 与 探 索，（）：黄 向 月特 异 性基 因 敲 除 小 鼠 模 型 的 建 立 及 其 对 雄 性生 殖 的 影 响 成 都：西 南 民 族 大 学，