猪WTAP基因的生物信息学分析.pdf

遗传育种与繁殖106 2023.80 引言肾母细胞瘤1-相关蛋白（WTAP）是m6P甲基化转移酶复合物的核心组份之一，WTAP基因位于人的6q25-27染色体核小鼠17号染色体着丝粒附近1。WTAP基因的表达紊乱常使m6A甲基化调控失衡，从而在胃癌和胰腺癌等肿瘤的通路中起抑制或促进作用2-3；m6A甲基化修饰在动物的生长发育和疾病调控方面意义重要4。断奶仔猪腹泻病是仔猪死亡的重要诱因之一，其中细菌性影响的仔猪腹泻占70%左右5。肖叶懿等4研究发现，m6A甲基转移酶WTAP高表达可以提高仔猪抗大肠杆菌的能力。大肠杆菌源性腹泻病是仔猪死亡的重要诱因，仔猪腹泻病未得到正确的处理，造成仔收稿日期：2023-05-29基金项目：湘西自治州重点研发项目（2021NC2002）作者简介：漆亮（1984-），女，本科，兽医师，研究方向：畜牧兽医。*通信作者简介：杜海波（1984-），男，硕士，高级兽医师，研究方向：动物遗传育种与繁育。漆亮，彭英河，龙晓蓉，等猪WTAP基因的生物信息学分析J现代畜牧科技，2023，99（8）：106-109doi：10.19369/ki.2095-9737.2023.08.028QI Liang，Peng Yinghe，Long Xiaorong，et alBioinformatics Analysis of WTAP Gens in Sus Scrofa（pig）JModern Animal Husbandry Science&Technology，2023，99（8）：106-109猪WTAP基因的生物信息学分析漆亮1，彭英河2，龙晓蓉3，杜海波4*（1.湖南省长沙市动植物疫病预防控制中心，湖南 长沙 410000；2.湖南省湘西州农业综合行政执法局，湖南 湘西 416000；3.湖南省湘西州畜牧水产事务中心，湖南 湘西 416000；4.内蒙古阿拉善盟阿拉善孪井滩生态移民示范区综合执法局，内蒙古 阿拉善 750312）摘要：本试验通过生物信息学方法对猪WTAP基因进行分析，分析的内容包括开放阅读框、理化性质、亲水性/疏水性、蛋白质二级结构、磷酸化位点和N-糖基化位点等内容。结果表明，猪WTAP基因编码178个氨基酸，等电点5.54，不稳定指数59.85，为不稳定蛋白；亲疏水平均值-1.207，属于亲水蛋白；二级结构以无规则卷曲为主，含有25个螺旋、28个延伸链、125个无规则卷曲，49个潜在的磷酸化位点，2个N-糖基化位点。关键词：猪；WTAP基因；生物信息学中图分类号：S828.3文献标识码：Adoi：10.19369/ki.2095-9737.2023.08.028Bioinformatics Analysis of WTAP Gens in Sus Scrofa（pig）QI Liang1，PENG Yinghe2，LONG Xiaorong3，DU Haibo4*（1.Changsha Animal and Plant Disease Prevention and Control Center，Changsha Hunan 410000，China；2.Xiangxi Agricultural Comprehensive Administrative Law Enforcement Bureau，Xiangxi Hunan 416000，China；3.Affair Center of Animal Husbandry and Aquaculture in Xiangxi Autonomous Prefecture，Xiangxi Hunan 416000，China；4.Alagxa League Comprehensive Administrative Law Enforcement Bureau of Luanjingtan Economic and Technological Development Zone，Alxa Inner Mongolia 750312，China）Abstract：The experiment used bioinformatics methods to predict and analyze the open reading frame，physical and chemical properties，hydrophilicity/hydrophobicity，protein secondary structure，phosphorylation sites/N-glycosylation sites and transmembrane regions of Sus scrofa（pig）WTAP geneThe results showed that the whole length of Sus scrofa（pig）WTAP gene was 178 amino acids，isoelectric point was 5.54，instability index was 59.85，it was an unstable protein，the average value of hydrophobicity was-1.207，it was a hydrophilic protein;the secondary structure was mainly irregular curl，containing 25 helices，28 extension chains and 125 irregular curl,49 potential phosphorylation sites and 2 N-glycosylation siteKeywords：Sus scrufa（pig），WTAP genes，bioinformatics遗传育种与繁殖1072023.8猪死亡率升高，给养殖户造成重大损失。WTAP基因高表达在预防仔猪腹泻有重要的作用，通过对WTAP基因的生物信息学分析可以为仔猪腹泻病防治及育种选育提供参考。1 材料与方法1.1 猪WTAP基因序列猪WTAP基因的氨基酸序列通过NCBI网址进行查找获取，登录号为：NC_010443，其序列为MQSTILVLQQQLKETRQQLAQYQQQQSQAPGPSTSRTPSEPGGQ AEATGKDCSRLANGPSNGSSSRQRTSGSGFHREGDTTEDDFPPSPGSGNKASNSSEERTGRGGSSYVNQLSAGYESVDSPTGSENSLTRHSHDTDSNPDPQEEKTVSGKGSRTAGSRHVQNGLDSSVNVQGSVL。1.2 猪WTAP开放阅读框和理化性质分析猪WTAP基因的开放阅读框和理化性质分别通过ORFfinder和ProtParam在线工具进行分析。1.3 猪WTAP亲疏水性、跨膜区及蛋白结构预测与分析猪WTAP亲疏水性和跨膜区分析分别通过在线工具ProtScale和TMHMM软件；蛋白质二级结构分析：https:/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?Page=npsa_gor4.html。1.4 猪WTAP磷酸化位点/N-糖基化位点分析猪WTAP磷酸化位点和N-糖基化位点分别采用在线软件NetPhos-3.1和NetNGlyc-1.0。2 结果与分析2.1 猪WTAP基因开放阅读框分析预测由图1可知，猪WTAP基因开放阅读全长537 bp，起始密码子ATG，编码178个氨基酸。图1 WTAP基因开放阅读框分析结果2.2 猪WTAP基因的氨基酸组成猪WTAP基因的分子式是C763H1221N251O295S2，氨基酸个数是178个。由表1可知，猪WTAP基因的分子质量为18 694.71 u，等电点为5.54，带负电荷天冬氨酸和谷氨酸残基分别为9个和11个，带正电荷精氨酸和赖氨酸残基分别为11个和5个。在体外，WTAP在哺乳动物网织红细胞、酵母和大肠杆菌中的半衰期分别为30、20、10 h。猪WTAP蛋白的不稳定系数为59.85，为不稳定蛋白；亲水性总平均值（GRAVY）为-1.207，归亲水蛋白。2.3 猪WTAP蛋白亲水性/疏水性预测分析由图2可知，猪WTAP疏水性最强位点出现在第5位异亮氨酸，分值为1.078，猪WTAP亲水性最强位点出现在第144位脯氨酸，分值为-2.822。猪WTAP蛋白的平均疏水性为-1.207，亲水肽链在整个氨基酸序列中明显多于疏水肽链，预测结果表明，猪WTAP蛋白是一种亲水蛋白质。表1 猪WTAP基因的氨基酸组成项目个数含量（%）项目个数含量（%）丙氨酸（Ala）84.5亮氨酸（Leu）95.1精氨酸（Arg）116.2赖氨酸（Lys）52.8天冬酰胺（Asn）95.1甲硫氨酸（Met）10.6天冬氨酸（Asp）95.1苯丙氨酸（Phe）21.1半胱氨酸（Cys）10.6脯氨酸（Pro）116.2谷氨酰胺（Gln）1810.1丝氨酸（Ser）3218谷氨酸（Glu）116.2苏氨酸（Thr）147.9甘氨酸（Gly）2111.8色氨酸（Trp）00.0组氨酸（His）42.2酪氨酸（Tyr）31.7异亮氨酸（Ile）10.6缬氨酸（Val）84.5图2 猪WTAP蛋白质的亲水性/疏水性预测与分析2.4 猪WTAP跨膜区分析使用在线蛋白质跨膜区分析工具，TMHMM软件对猪WTAP进行跨膜区分析，见图3。结果表明，猪WTAP不含跨膜区，不是跨膜蛋白。图3 猪WTAP蛋白质跨膜结构2.5 猪WTAP蛋白质二级结构预测由图4可知，猪WTAP蛋白主要以无规则卷曲为主，其中螺旋有25个氨基酸残基参与，占14.04%；延伸链有28个氨基酸残基参与，占15.73%；无规则卷曲有马尔科夫模型-最可能拓扑类型马尔科夫模型-后验概率0 25 50 75 100 125 150 1750 25 50 75 100 125 150 1751.00.80.60.40.20.0Inside外细胞膜内打分序列1.510.50-0.5-1-1.5-2-2.5-320 40 60 80 100 120 140 160位置打分遗传育种与繁殖108 2023.8125个氨基酸参与，占70.22%。2.6 猪WTAP蛋白质的磷酸化位点/N-糖基化位点分析由图5、图6可知，猪WTAP蛋白有32个Ser（Ser3、Ser27、Ser33、Ser35、Ser39、Ser53、Ser60、Ser63、Ser64、Ser65、Ser70、Ser72、Ser88、Ser91、Ser96、Ser98、Ser99、Ser108、Ser109、Ser115、Ser120、Ser123、Ser127、Ser130、Ser135、Ser140、Ser151、Ser155、Ser160、Ser169、Ser170、Ser176）位点，14个Thr（Thr4、Thr15、Thr34、Thr37、Thr48、Thr69、Thr80、Thr81、Thr103、Thr125、Thr132、Thr138、Thr149、Thr157）位点，3个Tyr（Tyr22、Tyr110、Tyr118）位点，总计49个潜在的磷酸化位点，2个N-糖基化位点。图4 猪WTAP蛋白质二级结构预测图5 猪WTAP蛋白质的磷酸化位点图6 猪WTAP蛋白质的N-糖基化位点分析3 讨论WTAP是RNA m6A甲基化转移酶的调节亚基6；通常与甲基化转移蛋白样3（METTL3）和甲基蛋白样14（METTL14）组成复合物发挥催化作用，催化m6A甲基化产生7。Little N A等8研究发现，甲基蛋白样3、甲基蛋白样14和WTAP定位于核斑点。Ping L X等6研究发现敲低WTAP，甲基蛋白样3、甲基蛋白样14的表达量下降，然而敲低甲基蛋白样3、甲基蛋白样14，WTAP的表达没有明显变化。WTAP基因不具有甲基化活性，而是通过调节m6A修饰的起作用，沉默WTAP基因从而使m6A修饰降低6。Liu J9在体外的试验研究表明，WTAP基因不具备催化活性，在催化甲基化转移酶METLL3和METTL14活性作用微乎其微。然而Ping L X等6在体内的试验中发现WTAP的表达量下降，mRNA m6A的表达量减少。在人类肿瘤的研究中，肝细胞癌患者生存率与WTAP的表达水平呈负相关10。Li Q等11的研究表明，在子宫内膜癌中，降低WTAP的表达，甲基化转移蛋白样3表达量同步降低，从而通过NF-kB信号通路，抑制子宫内膜癌的发展。WTAP基因在养殖业方面的研究较少，在水产动物中，Huang L G等12通过敲低斑马鱼WTAP基因的试验表明，敲低后的斑马鱼头部和脑室小于未敲除WTAP的个体，同时敲低斑马鱼WTAP基因的个体眼睛出现畸形，生长发育也受到影响。在家畜中，WTAP基因与仔猪腹泻病、水肿病4和牛脂肪前体细胞的生成13关联。WTAP基因主要通过调节mRNA的表达在家畜细胞周期和机体生长等方面发生作用。肖叶懿等4研究发现，RNA甲基化酶WTAP的高表达有利于提高仔猪大肠杆菌抗性。Horiuchi K等14研究发现，WTAP基因可与WT1信号通路中的转录靶DNA结合，从而在细胞的增殖、迁移和凋亡中起作用。WTAP基因主要通过调控m6A甲基化修饰酶基因，稳定mRNA的表达来实现。本研究通过对猪WTAP基因研究表明，WTAP基因含178个氨基酸残基，属于亲水蛋白，二级结构主要以无规则卷曲结构为主，有49个潜在的磷酸化位点，这些位点可能通过调节mRNA的表达作用于m6A甲基化修饰酶相关基因或者通过与NF-kB信号通路中的转录靶基因结合起作用。4 结论猪WTAP含178个氨基酸残基无跨膜区的亲水蛋白，磷酸化位点和N-糖基化位点分别为49个和2个，猪WTAP基因与仔猪腹泻病、水肿病等相关，研究结果可为仔猪腹泻病的防治及猪抗病育种提供参考。参考文献1杨露露，赵冉冉，蒋若雨，等WTAP基因在初诊急性髓系白血病中的mRNA表达及其临床意义J中国实验血液学杂志，2021，29（3）：653-6602汪毅，张杰，皮静楠，等WTAP基因在胃癌组织中低表达J基础医学与临床，2016，36（11）：1 548-1 5533陶然，王策，殷婷婷，等敲低WTAP基因对肺腺癌A549细胞恶性生物学行为的影响J中国肿瘤生物治疗杂志，2019，26（5）：512-5174肖叶懿，郜重丞，包文斌，等猪m6A甲基化酶WTAP基因与F18大肠杆菌感染的关系J畜牧兽医学报，2021，52序列位置20 40 60 80 100 120 140 16020 40 60 80 100 120 140 160HelixSheetCoil0 20 40 60 80 100 120 140 160磷酸化潜能01丝氨酸苏氨酸酪氨酸临界值0 20 40 60 80 100 120 140 16010.750.50.250N-糖基化位点潜能序列位置临界值阀值遗传育种与繁殖1092023.8（6）：1 709-1 7165宋庆华仔猪大肠杆菌腹泻病诊断及不同病型的治疗方法J特种经济动植物，2022，25（8）：68-706Ping X L，Sun B F，Wang L，et alMammalian WTAP is a regulatory subunit of the RNA N6-methyladenosine methyltransferaseJCell Res，2014，24（2）：177-1897林旭阳，韩笑，张成婉，等WTAP在肿瘤中作用的研究进展J口腔医学，2022，42（11）：1 036-1 0418Little N A，Hastie N D，Davies R CIdentification of WTAP，a novel Wilms tumour 1-associating proteinJHum Mol Genet，2000，9（15）：2 231-2 2399Liu J，Yue Y，Han D，et alA METTL3-METTL14 complex mediates mammalian nuclear RNA N6-adenosine methylationJNat Chem Biol，2014，10（2）：93-9510 Jiang H，Ning G，Wang Y，et alIdentification of an m6A-Related Signature as Biomarker for Hepatocellular Carcinoma Prognosis and Correlates with Sorafenib and Anti-PD-1 Immunotherapy Treatment ResponseJDis Markers，2021，2021：5 576 68311 Li Q，Wang C，Dong W，et alWTAP facilitates progression of endometrial cancer via CAV-1/NF-kappaB axisJCell Biol Int，2021，45（6）：1 269-1 27712 Huang L G，Zhou W，Rong X，et alEffects of glycomacropeptide on damage to intestinal tissue and apoptosis of intestinal epithelial cells in neonatal rats with necrotizing enterocolitisJChinese Journal of Pediatrics，2012，50（7）：536-54213 杨昕冉，王建芳，马鑫浩，等m6A甲基化修饰相关酶基因在牛脂肪生成中的表达分析J生物技术通报，2022，38（7）：70-7914 Horiuchi K，Kawamura T，Iwanari H，et alIdentification of Wilms tumor 1-associating protein complex and its role in alternative splicing and the cell cycleJJ Biol Chem，2013，288（46）：33 292-33 302编辑：方雅琪2023年7月1718日，记者从在京召开的第三届畜禽种业科技创新大会暨AROH创刊大会上获悉，近年来，国家畜牧科技创新联盟（简称联盟）聚焦种业创新，育成了“华西牛”“广明2号”白羽肉鸡、“中畜草原白羽肉鸭”和“中新白羽肉鸭”等系列新品种，助力我国核心种源自主可控，创建了肉鸡、肉牛、生猪的基因组选择育种技术及其芯片，助推种业科技自立自强。据了解，2017年12月16日，在国家农业科技创新联盟框架下，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牵头成立了国家畜牧科技创新联盟，其中一个重要使命就是探索机制创新，解决我国畜禽联合育种难题。通过5年的探索，联盟已建立了3种行之有效的联合育种模式，成立了全国第一个肉牛联合育种实体公司，解决了大动物联合育种的机制问题，在关键核心技术攻关等重大项目中担任重要角色；建立白羽肉鸡种业创新联合体，成立中国农业科学院白羽肉鸡研究中心，形成“管理、研究、支撑”三驾马车的联合攻关队伍；构建肉鸭“科企”联合育种模式，形成以市场需求为导向的院企联合育种模式。中国农业科学院北京畜牧兽医研究所所长、国家畜牧科技创新联盟理事长秦玉昌在会上表示，下一步，联盟将继续把推动畜禽种业发展、落实畜禽种业振兴行动作为工作重点。一是组织建立开放的联合攻关团队，聚焦主责主业，以畜牧产业发展问题为导向，以目标任务为牵引，组建国家战略科技力量核心专家团队，形成协同攻关。二是开展机制创新，做好顶层设计、系统设计、形成上下游结合，中央各地方单位的错位发展，通过协同创新，实现资源共享，优势互补。三是加强技术成果集成、示范和推广宣传，充分利用联盟的平台优势，加强联盟成员间的信息交流，助推新品种、新技术、新装备、新模式转化应用，为乡村产业振兴贡献联盟力量。联合育种模式促畜禽种业自主自强（来源：农民日报http:/