SN∕T 5360-2021 出口动物源食品中万古霉素和去甲万古霉素残留量的测定 液相色谱-质谱∕质谱法(出入境检验检疫).pdf

I C S6 7. 0 5 0C C SC5 3中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 3 6 02 0 2 1 出口动物源食品中万古霉素和去甲万古霉素残留量的测定 液相色谱-质谱 / 质谱法D e t e r m i n a t i o n o f v a n c o m y c i n a n d n o r v a n c o m y c i n r e s i d u e i n f o o d s t u f f s o f a n i m a l o r i g i n f o r e x p o r t L C - M S/M S m e t h o d2 0 2 1 - 1 1 - 2 2发布2 0 2 2 - 0 6 - 0 1实施中华人民共和国海关总署发 布前 言本文件按照G B/T 1. 12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分: 标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位: 中华人民共和国长春海关、 中华人民共和国厦门海关、 中华人民共和国西宁海关、中华人民共和国深圳海关、 中华人民共和国南京海关、 中华人民共和国天津海关。本文件主要起草人: 康明芹、 徐敦明、 苏姗姗、 赵凤娟、 陈明岩、 张代辉、 胡婷婷、 张勋。S N/T5 3 6 02 0 2 1出口动物源食品中万古霉素和去甲万古霉素残留量的测定 液相色谱-质谱/ 质谱法1 范围本文件规定了出口动物源性食品中万古霉素和去甲万古霉素的液相色谱-质谱/质谱测定方法。本文件适用于动物肌肉、 肝脏、 肾脏、 水产品、 蜂蜜、 鸡蛋、 乳及乳制品中万古霉素和去甲万古霉素的测定和确证。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中, 注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件; 不注日期的引用文件, 其最新版本( 包括所有的修改单) 适用于本文件。G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 方法提要样品中残留的万古霉素和去甲万古霉素以0. 1%甲酸水-乙腈提取, 经混合型强阳离子交换柱净化后, 用液相色谱-质谱/质谱仪测定, 外标法定量。5 试剂和材料除非另有说明, 所有试剂均为分析纯, 水为G B/T 6 6 8 2规定的一级水。5. 1 甲醇。5. 2 乙腈: 色谱纯。5. 3 甲酸。5. 4 二氯甲烷。5. 5 氨水。5. 6 0. 1%甲酸溶液: 准确移取1 mL甲酸, 用水定容至1 0 0 0 mL。5. 7 0. 1%甲酸-乙腈溶液(1+1, 体积比) : 量取5 0 0 mL乙腈与5 0 0 mL的0. 1 %甲酸溶液(5. 6) ,混匀。5. 8 2%甲酸甲醇: 准确移取2 mL甲酸, 用甲醇稀释并定容至1 0 0 mL。5. 9 2%甲酸溶液: 准确移取2 0 mL甲酸, 用水定容至1 0 0 0 mL。5. 1 0 1 0%氨水-甲醇溶液: 量取1 0 0 mL氨水, 用甲醇定容至1 0 0 0 mL。5. 1 1 0. 1%甲酸-乙腈溶液饱和的二氯甲烷: 量取1 0 0 mL二氯甲烷和5 0 mL 0. 1%甲酸-乙腈溶液1S N/T5 3 6 02 0 2 1(5. 7) 于分液漏斗中, 充分混合后静置, 取下层。5. 1 2 定容液: 量取9 5 0 mL 0. 1%甲酸溶液(5. 6) 和5 0 mL 乙腈, 混匀。5. 1 3 标准物质: 万古霉素标准物质(v a n c o m y c i n,C6 6H7 5C l2N9O2 4,C A S N o . 1 4 0 4 - 9 3 - 9) ; 去甲万古霉素标准物质(n o r v a n c o m y c i n ,C6 5H7 3C l2N9O2 4,C A S N o . 9 1 7 0 0 - 9 8 - 0) 。标准物质为可溯源至S I单位或国家基准的有证标准物质或标准溶液。5. 1 4 万古霉素标准储备液: 准确称取盐酸万古霉素标准物质适量( 精确至0. 1 m g) 于小烧杯中, 用0. 1%甲酸(5. 6) 溶解并全部转移至容量瓶中, 定容至刻度, 配成溶液浓度以万古霉素计为1 0 0 0 g/mL的标准储备液。0 4 避光保存, 有效期3个月。5. 1 5 去甲万古霉素标准储备液: 准确称取万古霉素标准物质适量( 精确至0. 1 m g) 于小烧杯中, 用0. 1%甲酸溶液(5. 6) 溶解并全部转移至容量瓶中, 定容至刻度, 配成以去甲万古霉素计为1 0 0 0 g/mL的标准储备液。0 -4 避光保存, 有效期3个月。5. 1 6 万古霉素和去甲万古霉素混合标准中间液: 准确吸取万古霉素标准储备液(5. 1 4) 和去甲万古霉素标准储备液(5. 1 5) 各1 mL至1 0 0 mL容量瓶中, 用0. 1%甲酸(5. 6) 定容至刻度, 配成1 0 g/mL的混合标准中间液。0 4 以下避光保存, 有效期1个月。5. 1 7 万古霉素和去甲万古霉素混合标准工作液: 吸取一定量的标准中间溶液, 用0. 1%甲酸溶液(5. 6) 稀释配制成不同浓度的系列标准工作溶液, 浓度分别为5. 0 g/L、1 0. 0 g/L、2 0. 0 g/L、5 0. 0 g/L、1 0 0. 0 g/L现用现配。5. 1 8 混合型强阳离子交换柱(S P E) :6 0 m g,3 mL, 或相当者, 使用前用3 mL 2%甲酸甲醇(5. 8) 和6 m L 2%甲酸溶液(5. 9) 活化。5. 1 9 微孔滤膜:0. 2 2 m, 聚四氟乙烯有机滤膜。5. 2 0 乙二胺- N -丙基硅烷(P S A) 。5. 2 1 十八烷基硅烷键合硅胶(C1 8) 。6 仪器和设备6. 1 液相色谱-质谱/质谱仪: 配有电喷雾离子源(E S I) 。6. 2 粉碎机。6. 3 固相萃取装置。6. 4 均质器。6. 5 电子天平: 感量分别为0. 1 m g和0. 0 1 g。6. 6 离心机:4 0 0 0 r/m i n。6. 7 高速离心机: 1 5 0 0 0 r/m i n。6. 8 涡旋混合器。6. 9 氮吹仪。7 试样制备与保存7. 1 猪肉、 牛肉、 鸡肉、 猪肾、 猪心、 猪肝、 鱼肉、 鸡蛋取样品中具有代表性的可食部分约 5 0 0 g, 用粉碎机捣碎, 装入洁净容器作为试样, 密封并做好标识, 于-1 8 以下保存。7. 2 蜂蜜取代表性样品约5 0 0 g。对于无结晶的样品将其搅拌均匀; 对于有结晶析出的样品, 在密闭情况下,2S N/T5 3 6 02 0 2 1将样品置于不超过6 0 的水浴中温热, 待样品全部融化后搅拌均匀, 迅速冷却至室温。在融化时必须注意防止水分挥发。装入洁净容器作为试样, 密封并做好标识, 于4 以下保存。7. 3 牛奶、 奶粉取代表性样品约5 0 0 g, 混合均匀后装入洁净容器作为试样, 密封并做好标识, 于4 下保存。8 测定步骤8. 1 提取8. 1. 1 猪肉、 牛肉、 鸡肉、 猪肾、 猪心、 鱼肉称取约5 g试样( 精确至0. 0 1 g) 于均质管中, 加入2 0 mL 0. 1%甲酸-乙腈溶液(5. 7) , 用均质器以1 0 0 0 0 r/m i n均质2 m i n, 以4 0 0 0 r/m i n离心5 m i n, 取出上清液, 残渣再用1 0 mL 0. 1%甲酸-乙腈溶液(5. 7) 重复提取一次, 合并上清液并定容至3 0 mL, 混匀后取1 0 mL于离心管中, 加入0. 5 g P S A吸附剂(5. 2 0) , 涡旋混合 2 m i n后以1 5 0 0 0 r/m i n离心1 0 m i n, 取出6 mL上清液待净化。8. 1. 2 蜂蜜、 鸡蛋、 牛奶称取约5 g试样( 精确至0. 0 1 g) 于均质管中, 加入1 5 mL 0. 1%甲酸-乙腈溶液(5. 7) , 用均质器以1 0 0 0 0 r/m i n均质2 m i n, 以4 0 0 0 r/m i n离心5 m i n, 取出上清液, 残渣再用1 0 mL 0. 1%甲酸-乙腈溶液(5. 7) 重复提取一次, 合并上清液并定容至3 0 mL, 混匀后取1 0 mL于离心管中, 加入0. 5 g P S A吸附剂(5. 2 0) , 涡旋混合 2 m i n后以1 5 0 0 0 r/m i n离心1 0 m i n, 取出6 mL上清液待净化。8. 1. 3 猪肝称取约5 g试样( 精确至0. 0 1 g) 于均质管中, 加入2 0 mL 0. 1%甲酸-乙腈溶液(5. 7) , 用均质器以1 0 0 0 0 r/m i n均质2 m i n, 以4 0 0 0 r/m i n离心5 m i n, 取出上清液, 残渣再用1 0 mL 0. 1%甲酸-乙腈溶液(5. 7) 重复提取一次, 合并上清液并定容至3 0 mL, 混匀后取1 0 mL于离心管中, 加入0. 5 g P S A吸附剂(5. 5) 和0. 5 g C1 8吸附剂(5. 2 1) , 涡旋混合 2 m i n后以1 5 0 0 0 r/m i n离心1 0 m i n, 取出6 mL上清液待净化。8. 1. 4 奶粉称取约2 g试样( 精确至0. 0 1 g) 于离心管中, 加入2 0 mL 0. 1%甲酸-乙腈溶液(5. 7) , 涡旋混合2 m i n, 以1 5 0 0 0 r/m i n离心1 0 m i n, 取出上清液, 残渣再用1 0 mL 0. 1%甲酸-乙腈溶液(5. 7) 重复提取一次, 合并上清液并定容至3 0 mL后转移至分液漏斗中, 加入 2 0 mL 0. 1%甲酸-乙腈溶液饱和的二氯甲烷(5. 1 1) , 混匀, 静置分层后, 取出1 5 mL上清液待净化。8. 2 净化取7. 1中待净化液全部转移至强阳离子交换柱(5. 1 8) , 分别用3 mL水和3 mL甲醇以小于1 mL/m i n的速度淋洗, 弃去, 用3 mL 1 0%氨水-甲醇溶液(5. 1 0) 以小于1 mL/m i n的流速洗脱于试管中, 于4 0 下氮吹至近干, 用1 mL 定容液(5. 1 2) 溶解, 过0. 2 2 m滤膜(5. 1 9) , 供液相色谱-质谱/质谱仪测定。3S N/T5 3 6 02 0 2 18. 3 测定8. 3. 1 液相色谱条件液相色谱条件如下:a) 色谱柱:C1 8柱, 1 5 0 mm2. 1 mm( 内径) , 粒度3. 5 m, 或相当者。b) 柱温:3 5 。c) 流动相:A: 0. 1%甲酸水溶液;B: 乙腈, 梯度洗脱程序见表1;d) 流速:0. 2 5 mL/m i n。e) 进样量:2 0 L。表1 液相色谱梯度洗脱条件时间/m i n流动相A/%流动相B/%0. 0 09 555. 0 08 02 07. 0 0559. 0 059 59. 0 19 551 5. 0 09 558. 3. 2 质谱条件质谱条件如下:a) 离子源: 电喷雾离子源(E S I) 。b) 扫描方式: 多反应监测(MRM) 。c) 其他质谱条件参见附录A。8. 3. 3 液相色谱-质谱/质谱测定8. 3. 3. 1 定性测定按照液相色谱-质谱/质谱条件测定样品和标准工作液, 如果试样中待测物质的保留时间与标准工作液一致, 保留时间偏差在2. 5%以内, 并且所监测的离子均出现( 信噪比3) , 而且定性离子对的相对丰度( 是用相对于最强离子丰度的强度百分比表示) 与浓度相当的标准工作溶液的相对丰度允许偏差不超过表2规定的范围, 则可判断样品中存在对应的被测物。表2 定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度5 0%2 0%至5 0%1 0%至2 0%1 0%允许的相对偏差2 0%2 5%3 0%5 0%8. 3. 3. 2 定量测定将混合标准工作液和试样溶液依次注入液相色谱-质谱/质谱仪中, 按外标曲线法, 以峰面积定量。标准溶液及试样溶液中万古霉素和去甲万古霉素的响应值均应在仪器检测的定量线性范围内, 如超出4S N/T5 3 6 02 0 2 1线性范围, 应采用流动相溶液稀释至适当浓度。在上述仪器条件下, 万古霉素和去甲万古霉素的提取离子色谱图参见附录B。8. 3. 4 空白试验除不加试样外, 均按上述步骤进行。9 结果计算和表述试样中万古霉素和去甲万古霉素的含量由色谱数据处理软件或按式(1) 计算获得, 计算结果需扣除空白值, 并保留两位有效数字:Xi=ciVm1 0 0 01 0 0 0( 1 )式中:Xi 试样中分析物的含量, 单位为微克每千克(g/k g) ;ci 从标准曲线得到试样溶液中万古霉素或去甲万古霉素的浓度, 单位为纳克每毫升(n g/m L) ;V 样液最终定容体积, 单位为毫升(mL) ;m 最终样液代表的试样质量, 单位为克(g) 。1 0 定量限和回收率1 0. 1 定量限本方法万古霉素和去甲万古霉素的定量限均为5. 0 g/k g。1 0. 2 回收率不同基质中万古霉素和去甲万古霉素在不同添加水平下的回收率试验数据参见附录C中表C. 1。5S N/T5 3 6 02 0 2 1附 录 A( 资料性)质谱参考参数A. 1 质谱参考参数如下:a) E S I正离子模式。b) 电喷雾电压(I S) :5 5 0 0 V;c) 离子源温度(T EM) :5 5 0 ;d) 雾化气压力(G S 1) :2 0 6. 8 5 k P a(3 0 P s i) ;e) 辅助气压力(G S 2) :2 0 6. 8 5 k P a(3 0 P s i) ;f) 气帘气压力(C UR) :2 0 6. 8 5 k P a(3 0 P s i) ;g) 分辨率: 单位分辨率;h) 定量离子对、 定性离子对、 去簇电压(V) 和碰撞能量(e V) 见表A. 1。表A. 1 定量离子对、 定性离子对、 去簇电压(V) 、 碰撞能量(e V)化合物名称母离子 m/z子离子m/z去簇电压V碰撞能量e V万古霉素7 2 5. 01 4 3. 9*6 02 01 3 0 5. 96 01 7去甲万古霉素7 1 8. 21 4 4. 2*6 02 21 2 9 2. 46 01 9 注: 带“*” 的为定量离子。 非商业性声明: 附录A所列参数是在A P I 4 5 0 0质谱仪上完成的, 此处列出试验用仪器型号仅是为了提供参考, 并不涉及商业目的, 鼓励标准使用者尝试采用不同厂家或型号的仪器。供参考, 并不涉及商业目的, 鼓励标准使用者尝试采用不同厂家或型号的仪器。6S N/T5 3 6 02 0 2 1附 录 B( 资料性)标准溶液多反应监测(MRM) 色谱图图B. 1 1 0. 0 g/L万古霉素标准溶液多反应监测色谱图(MRM)图B. 2 1 0. 0 g/L去甲万古霉素标准溶液多反应监测色谱图(MRM)7S N/T5 3 6 02 0 2 1附 录 C( 资料性)添加回收率 万古霉素和去甲万古霉素在猪肉、 牛肉、 鸡肉、 猪肾、 猪心、 猪肝、 鱼肉、 蜂蜜、 鸡蛋、 牛奶和奶粉中平均回收率试验数据, 见表C. 1。表C. 1 万古霉素和去甲万古霉素在不同基质中不同添加水平下的平均回收率样品名称添加浓度/ (g/k g)万古霉素平均回收率/%去甲万古霉素平均回收率/%猪肉5. 0 1 0 81 0 21 0. 01 0 59 2. 8 5 0. 08 0. 5 7 5. 1 牛肉5. 0 7 4. 9 1 0 2 1 0. 08 6. 0 7 9. 2 5 0. 07 9. 4 7 6. 9 鸡肉5. 0 9 9. 4 9 2. 9 1 0. 09 6. 5 9 4. 9 5 0. 07 7. 5 7 9. 5 猪肾5. 0 8 1. 3 7 6. 4 1 0. 08 5. 1 7 6. 15 0. 08 3. 9 8 2. 5 猪心5. 0 9 4. 5 7 5. 5 1 0. 08 6. 7 8 0. 8 5 0. 08 0. 8 7 5. 3猪肝5. 0 7 0. 8 6 6. 0 1 0. 06 9. 8 6 3. 8 5 0. 06 5. 1 6 6. 7 鱼肉5. 0 1 0 7 9 9. 2 1 0. 09 0. 7 7 6. 4 5 0. 07 6. 7 7 8. 2 蜂蜜5. 0 9 5. 9 9 5. 0 1 0. 09 5. 3 7 5. 6 5 0. 01 0 27 8. 5 鸡蛋5. 0 7 8. 4 7 0. 3 1 0. 06 9. 1 6 6. 5 5 0. 06 3. 8 6 7. 5 8S N/T5 3 6 02 0 2 1表C. 1 ( 续)样品名称添加浓度/ (g/k g)万古霉素平均回收率/%去甲万古霉素平均回收率/%牛奶5. 0 6 6. 3 7 2. 1 1 0. 01 0 39 5. 25 0. 01 0 9 1 0 5奶粉5. 0 1 0 99 1. 21 0. 09 5. 07 1. 3 5 0. 09 4. 87 9. 39S N/T5 3 6 02 0 2 112020635 T/NS中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准出口动物源食品中万古霉素和去甲万古霉素残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法S N/T 5 3 6 02 0 2 1*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(1 0 0 0 2 3)编辑部: (0 1 0)6 5 1 9 4 2 4 2 - 7 5 0 9网址 www. c u s t o m s k b . c o m/b o o k中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本8 8 01 2 3 0 1/1 6 印张1 字数2 6千字2 0 2 1年1 2月第一版 2 0 2 1年1 2月第一次印刷印数 15 0 0*书号: 1 5 5 1 7 57 2 0 定价1 8. 0 0元