小型间歇浸没式植物生物反应器的开发与教学应用.pdf

小型间歇浸没式植物生物反应器的开发与教学应用何磊1，2，蒋琴素1，2，徐程2（）1.浙江大学国家级生物实验教学示范中心，杭州，3100582.浙江大学生命科学学院，杭州，310058摘 要：本文介绍了一套基于植物组织培养快速繁殖技术的培养器的设计与教学应用。该培养器基于潮汐式浸没原理，通过微电脑蠕动泵控制浸没时间和频率，具有结构简单、操作方便、自动化程度高等特点。该实验系统由培养容器、营养液瓶、硅胶管和微电脑蠕动泵等组成。通过基于该实验系统的教学演示和实验课程，学生能够加深对小型间歇浸没式植物生物反应器的设计、组装及工作原理的认识，从而更好地理解植物组织培养快繁技术，有助于培养学生在面对植物组织培养应用问题时的创新意识和实践能力。关键词：间歇浸没式反应器，植物组织培养，教学应用Development and Application of Temporary Immersion Bioreactors HE Lei1，2，JIANG Qin-su，XU Cheng2（）1.National Biological Experimental Teaching Demonstration Center，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China2.College of Life Sciences，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China高校生物学教学研究（电子版）2023 年 4 月，13（2）：62-64ISSN 2095-1574 CN 11-9307/R DOI 10.3868/j.issn.2095-1574.2023.02.015专题资源之窗收稿日期：2022-09-02；修回日期：2022-12-07基金项目：浙江省级产学合作协同育人项目“通识课程的实践教学改革基础植物克隆技术与应用”（2021）；浙江大学第一批本科课程思政建设项目（2022）作者简介：徐程，E-mail：植物组织培养是指在无菌条件下将植物体的离体器官、组织和细胞在人工提供的条件下生长和发育的培养技术，也叫离体培养1-4。传统的植物组织培养技术是利用琼脂为支持物的固体培养，该培养方式对于培养基的配制要求较高，学生在配制过程中常常出现培养基不均匀、过硬或过软等问题，培养基的配制耗时、耗力且成本较高5-8，不利于后期的生产实践。植物组织培养反应器技术的出现较大程度地解决了这一难题，它具有自动化程度高、生产成本低、培养通量大等特点9-12。目前，植物组织培养器已用于部分农业生产实践13-15，而在植物组织培养教学上的应用则鲜有提及。本文所设计的植物培养器实验体系利用微电脑蠕动泵控制营养液流量、流速及浸没时间等从而满足不同植物的生长需求。使用该实验体系可以减少组织培养继代次数、降低污染概率等。1 小型间歇浸没式植物生物反应器工作原理间歇式浸没植物组织培养是通过一系列装置实现植物组织在营养液中的间歇式浸没来进行培养的方法。其结合了植物组织固体培养和液体培养的优点，既保证了植物组织能获得充分的营养，促使组织更好发育，又能使气体得到充分交换，避免植物生物（23年4月刊）-正文.indd 622023-6-12 15:21:41何磊等：小型间歇浸没式植物生物反应器的开发与教学应用 63组织玻璃化。间歇式浸没植物组织培养系统形式各样，主要由生物反应器、动力装置（蠕动泵、气泵等）、传输装置、控制装置等组成。目前应用较多的间歇式浸没植物组织培养系统主要有两种：一种是Alvard 等设计的 RTIA 系统，其以气泵为动力系统，以上下分隔的容器为培养容器，通过气压控制培养液对植物组织的浸没16；另一种是 Escalona 等设计的 BIT 系统，分开两个容器的气体驱动间歇式浸没生物反应器17，其同样以气泵为动力系统，通过控制培养液在左右两个分开容器中的转移来实现植物组织的间歇式浸没。研究显示浸没时间、浸没频率、营养液体积、容器体积、CO2浓度等因素都对植物组织的培养有较大影响18。2 小型间歇浸没式植物生物反应器设计本文设计的小型间歇浸没式植物生物反应器主要由培养容器、营养液瓶、微电脑控制蠕动泵、硅胶管四部分组成，组装后效果如图 1 所示。培养容器为大号 G1 玻璃砂漏斗，漏斗上口带有橡胶塞，橡胶塞上插有玻璃管，可以连接硅胶管。植物组织置于漏斗的玻璃砂隔板上培养，营养液可穿过玻璃砂隔板。营养液瓶为带有下出水口玻璃瓶，用于盛放营养液，与培养容器下部通过橡胶塞连接。硅胶管连接营养液瓶下出水口和培养容器上方玻璃管，嵌入微电脑控制的蠕动泵，用于营养液在两者间的转运。微电脑控制蠕动泵将营养液由营养液瓶输送至培养容器，并可通过内置程序调控营养液的浸没时长和间隔。该反应器的各部件参数如表 1 所示。该小型间歇浸没式植物生物反应器实验过程如下：在超净台内将植物组织接种于灭菌后的上述植物组织培养反应器中，置于光照培养箱或光照培养架上。根据培养条件设置微电脑控制蠕动泵程序，营养液瓶中营养液输送到培养容器中为植物组织提供生长所需，多余营养液通过漏斗重新回到营养液瓶中，如此循环形成潮汐式培养过程。表 1 小型间歇浸没式植物生物反应器部件参数组件名称参数培养容器玻璃砂漏斗带有玻璃砂隔板，容积 500mL营养液瓶带有下出水口玻璃瓶，容积 1000mL微电脑控制蠕动泵220V/50Hz，75W硅胶管内径 8mm，外径 10mm空气过滤除菌器孔径0.45m本文所设计的小型间歇浸没式植物生物反应器具有操作简单、使用范围广、扩展性强等特点。微电脑蠕动泵可控制培养液的浸没频率、流速、时间等；另外，可根据不同教学目标加装各种探头，方便对次级代谢产物进行研究。与国外同类反应器相比，该培养器结构简单，体积小巧，方便灭菌和超净台操作，反应器流动管道与液体推进系统分离，减少培养过程中污染概率。3 小型间歇浸没式植物生物反应器的教学应用目前，我校的组培室有 1 套该装置，主要用于基础植物克隆技术与应用、生命科学导论（竺可桢学院）这两门通识课的教学演示及部分同学的自主实验。课程学生来自医学、农生环、工科、理科和社会科学类等专业，每学期学生人数 100 余人。通过小型间歇浸没式植物生物反应器的课堂演示，学生可以直观地学习反应器的原理、设计和工作过程，在此基础上学生能够尝试设计小型间歇浸没式植物生物反应器，这锻炼了学生的实验设计能力和思维能力。通过该课程的学习，学生能直观了解植物组织培养的产业化发展趋势以及国内外植物组织培养图 1 小型间歇浸没式植物生物反应器（自制）生物（23年4月刊）-正文.indd 632023-6-12 15:21:4164 何磊等：小型间歇浸没式植物生物反应器的开发与教学应用产业化差距。部分学有余力的本科生在完成学习后，基于该课程申报浙江大学“大学生科研训练计划（SRTP）”项目。本次设计的小型间歇浸没式植物生物反应器除了用于植物组织培养的教学，还可以用于学生自主实验，如植物组织培养及次级代谢产物研究，通过加装各种探头，可对 pH、氧浓度、盐浓度等进行监测。基于分层次实验室课程体系构建和实现理念，后期可针对不同培养目标，设计连续性试验或者综合性试验。另外，该装置可在开设有植物组织培养课程的学校推广使用，但需要兄弟院校教学部门相关自制仪器经费的投入。4 结语植物生产的自动化和工厂化一直是植物组织培养的发展趋势。20 世纪后期以欧洲各国为代表纷纷启动植物优良种质的自动化培养的探索，并在此基础上发展出间歇式浸没植物组织培养方法。目前该方法在国外已经有较为丰富的应用，并探明了其作用原理和影响因子。在国内仅有少数科研单位尝试这种方法，并有部分进行产业化，但植物组织培养教材中提及较少，同时缺乏教学用的植物组织培养反应器。本文设计的小型间歇浸没式植物生物反应器通过微电脑对蠕动泵进行编程控制实现对植物组织的浸没培养，是一个良好的教学演示模型。相关课程的学习能够让学生更深层次掌握间歇式浸没植物组织培养反应系统的工作原理、设计理念，并对该技术在植物组织培养产业化中的应用和现状有深刻的了解。自主设计小型间歇浸没式植物生物反应器，有助于学生综合知识的应用。参考文献1农春仕，孟国忠，尹佟明，等.植物组培再生虚拟仿真实验的设计与应用J.实验技术与管理，2020，37（6）：5-9.2胡佳佳，康公平，付素静，等.应用型高校植物组织培养课程“金课”的构建研究J.高教学刊，2020（32）：61-64，68.3胡能兵，崔广荣，何克勤，等.植物组织培养技术实验课程的过程性改革与实践J.安徽科技学院学报，2020，34（4）：92-96.4白凤麟.植物组织培养开放性试验教学探索与实践J.现代园艺，2020，43（20）：212-213.5赵元增，杨靖，孙海燕.植物组培试验中“培养基不匀”问题分析与对策J.实验室科学，2020，23（3）：67-70.6张本厚.开合式间歇浸没植物生物反应器的开发及其应用D.杭州：浙江理工大学，2012.7张乔丽，邵微，高利梅，等.间歇浸没式生物反应器快繁草莓脱毒苗的参数J.北京农学院学报，2014，29（2）：20-24.8张杰，张本厚，贾明良，等.利用间歇浸没植物生物反应器进行半夏组培快繁的研究J.科技通报，2018，34（1）：95-100.9LATAWA J，SHUKLA M R，SAXENA P K.An efficient temporary immersion system for micropropagation of hybrid hazelnutJ.Botany，2016，94（1）：1-8.10成喜雨，何姗姗，倪文，等.植物组织培养生物反应器技术研究进展J.生物加工过程，2003，1（2）：18-22.11贾明良，张本厚，高伟平，等.三叶半夏（Pinellia ternate（Thunb.）Breit）的间歇浸没培养J.中国生物工程杂志，2012，32（11）：49-54.12申斓，周爱东，吴小芹.植物细胞培养生物反应器的种类特点及展望J.中国生物工程杂志，2015，35（8）：109-115.13张杰，胡燕花，张本厚，等.利用间歇浸没式植物生物反应器培养金钗石斛种苗J.中国农业科技导报，2020，22（10）：181-187.14宗树斌，王永平，田兴军，等.蓝莓组培苗在几种新型间歇浸没生物反应器中增殖培养效果的比较J.北方园艺，2020（13）：52-58.15杨柳，秦钢，杨丽涛，等.利用间歇浸没式生物反应器进行甘蔗组培快繁的研究J.华南农业大学学报，2011，32（1）：37-41.16ESCALONA M，LORENZO J C，GONZALEZ B，et al.New system for in vitro propagation of pineapple（Ananas comosus（L.）Merr）J.Tropical Fruits Newsletter，1998（29）：3-5.17ALVARD D，COTE F，TEISSON C.Comparison of methods of liquid medium culture for banana micropropagationJ.Plant Cell Tissue&Organ Culture，1993，32（1）：55-60.18许亚良，张家明.一种高效大规模组培方法间歇浸没培养法J.植物生理学报，2013，49（4）：392-399.（责编 张 磊）生物（23年4月刊）-正文.indd 642023-6-12 15:21:41