外泌体治疗心血管疾病的研究现状.pdf

:/综述外泌体治疗心血管疾病的研究现状甄 珂 卫小娟 张红超(河北北方学院研究生院 河北 张家口 空军特色医学中心心脏血管外科 北京)基金项目:国家自然科学基金()作者简介:甄 珂 硕士研究生 从事外泌体与心室重塑研究:通信作者:张红超:网络首发:/()摘要 外泌体()是细胞外囊泡的一种主要亚型 具有双层磷脂膜结构的天然纳米颗粒 携带了多种复杂的内容物 包括核苷酸、蛋白质和脂质等 通过将多种生物活性分子转运到受体细胞和组织 对靶细胞产生有利或有害的影响 在心血管疾病()中 具有“双刃剑”的作用 一方面可以导致细胞凋亡、肥大、纤维化 另一方面可以促进血管再生、细胞增殖等 不同来源的 作用不同 本文就 作为治疗 的手段加以描述总结 指出其治疗优势及发展瓶颈 并探讨下一步研究方向关键词 细胞外囊泡 外泌体 心血管疾病中图分类号 文献标志码 ()()“”心血管疾病()是心脏疾病与心脏血管疾病的统称中国心血管健康与疾病报告 指出 我国 患病率处于持续上升阶段 其中 的死亡率一直居于首位 高于肿瘤及其他疾病 因此提高 的治疗效果仍然迫在眉睫 目前对于 有药物、介入或开放手术等治疗方式 虽然能明显改善患者的临床症状 但对发病机制的研究尚显不足 近年来 对于 机制治疗方面的研究 历经了干细胞治疗时代 大量研究证明了干细胞改善心功能的有效性 但对心肌细胞的再生能力基本予以否定 除此之外干细胞治疗存在免疫排斥反应、致瘤作用、可控性差、丢失率高等局限性 有研究认为供体细胞在移植入受体细胞中时 超过 的细胞在注射后 内丢失 实际上 干细胞治疗 的获益主要来自其旁分泌作用 通过分泌大量的细胞外囊泡()参与炎症反应、血管新生、组织修复、线粒体损伤、胶原沉积以及凋亡 从而减少心肌功能失调、阻止心肌重塑这标志着 的治疗已经从“干细胞时代”跨越至“干细胞后时代”:/概述 的发现至今约有 年 早在 年就已证实 与小鼠骨骺软骨之间存在相互作用的关系 大约在 年 可以执行专门的细胞信号传导功能得到证实 随着 等发现了 的存在 的研究重要性日益显著 的形成主要通过细胞内吞细胞外液及蛋白质、脂质、离子等物质 形成早期核内体 持续进行高尔基体和内质网之间的物质交换 后形成晚期核内体及多囊泡体 多囊泡体中存在许多腔内囊泡 即外泌体前体 多囊泡体一部分被溶酶体或自噬体降解 另一部分发生质膜融合 腔内囊泡释放 形成 根据粒径不同 主要分为 种亚型:外泌体()、膜微粒()、凋亡小体 是直径约为 的细胞磷脂双分子层囊泡状小体()和凋亡小体()是细胞在活化或凋亡时释放的脂质膜囊泡 但 的分类不应以简单的粒径来划分 更应该注重不同细胞的来源 目前对于 的研究已较为成熟 而 作为 的一种主要亚型 在 中具有重要作用 因此本文将 作为治疗 的主要研究对象 广泛存在于人体体液中 经体循环后遍及全身 运载多种核酸、蛋白质、脂质等 参与细胞间通讯、细胞信号途径调控等过程 从而起到重要作用 具有“双刃剑”功能 不同微环境下对 的进展产生不同作用 一方面 高表达 的间充质干细胞源性外泌体()在 新 生 大 鼠 心 肌 细 胞 中 使 迅速转移至心肌细胞 能够显著改善心肌缺血 且通过下调心肌细胞中 和 等靶蛋白的表达 激活 和 信号以提高心肌细胞存活率 另一方面 糖尿病心肌细胞来源 中的 通过功能性下调其靶基因、和 抑制内皮细胞增殖、迁移和管样形成 在大鼠型糖尿病模型中起到抑制血管生成作用目前 已 有 大 量 研 究 证 实 中 的、蛋白质、脂质等内含物作为 的诊断生物标志物具有很大潜力 等发现血浆中 和 可在心梗发作后 内迅速升高 其敏感度、特异度以及检测速度均高于肌钙蛋白 因此 中的 作为一种新型疾病生物标志物与传统生物标志物相比具有更高的特异性 相比干细胞 具有稳定性、特异性、靶向性、高生物相容性、低免疫原性等特点 具有天生的治疗潜力 可以用作传递小分子的手段 因此 使用 作为药物递送载体 可以克服低效率、特异性差、药物生物利用度低等问题 为许多疾病的治疗创造了新的机会 且有效减少副作用 介入手术是 腔内治疗的主要手段之一 术后的血管炎症反应与血管再狭窄是当前困扰临床医生的重要问题 国外报道已将 做成涂层支架以“欺骗”血管平滑肌细胞和人体免疫系统 促进血管愈合和组织修复 治疗外周动脉疾病 在组织修复中 也起着重要作用 功能化的纤维状聚酯材料支架可诱导先天和适应性免疫反应 促进损伤组织的修复 不同来源 治疗 在 发展的不同病理阶段 所起的作用不同 主要变化在内容物方面 此外 功能异质性受到多方面影响 如分离或纯化方式、受体细胞代谢状态、细胞来源等 最关键的是不同细胞或组织来源可以赋予 不同特性 以下归纳了不同来源 治疗 现状 是目前研究较多的干细胞 也取得了不错的临床进展 研究表明 旁分泌形成的/可以应用于 的治疗 向急性心肌梗死大鼠模型心肌内注射 可以显著帮助心脏血流恢复 改善心功能 即 可以通过促进血管形成的方式保护心脏组织免受化学损伤 在小鼠心肌梗死模型中 中的 抑制甲基 结合蛋白 发挥抗凋亡作用 心肌细胞凋亡与梗死后纤维化显著降低 新生大鼠心肌细胞可以快速内化高表达 中的 降低心肌细胞中的 和 激活 和 信号途径 增强心肌细胞对缺氧损伤的抵抗力 促进心功能恢复 减少梗死面积 此外 研究发现人脐带 源性膜微囊在缺氧刺激后 可在体内外促进血管生成以及人脐静脉内 皮细胞()增殖 心脏祖细胞源性外泌体()心肌缺血和缺血区域损伤产生大量活性氧是心肌细胞凋亡和死亡的主要原因 中的 在氧化应激状态下通过靶向下调程序性细胞死亡因子()在心肌细胞损伤后修复/轴 从而保护心肌细胞免受氧化应激相关凋亡 另外 氧化应激诱导后的 比正常 分泌更多的 但只有在经过氧化应激后的 中的 才高表达 即 旁分泌产生的 才具有抗氧化应激功能 实验证明 通过 下 调 和 抑 制 心 肌 细 胞 凋 亡 则是通过靶向下调内皮细胞中的 空军军医大学学报 年 月 第 卷第 期 :/增强 中的血管形成 即人 内含的 和 具有抑制凋亡和促血管生成作用 并可以改善大鼠心肌梗死后的心功能 心球衍生细胞源性外泌体()研究表明 通过减少细胞凋亡、促进心肌细胞增殖和血管生成保护心脏 其机制是在缺氧条件 下 中 的 包 括、显著表达 具有诱导血管生成和心脏保护活性 急性心肌梗死会引发强烈的先天性免疫反应 将大量的中性粒细胞和巨噬细胞动员到心肌加剧组织损伤 另一项研究证明 在急性心肌梗死大鼠和猪模型再灌注后心肌中注射 中的 可以抑制 巨噬细胞中的蛋白激酶 并改变巨噬细胞极化状态 减少心肌梗死面积 心肌成纤维细胞源性外泌体心肌成纤维细胞源性外泌体富含 可靶向沉默山梨糖和含有 结构域的蛋白 和 与 结构域结合蛋白 导致细胞肥大 相反 在 诱导的心肌肥大小鼠模型中抑制 可以减小心肌细胞大小 说明 具有作为治疗心力衰竭新靶点的潜力 脂肪细胞源性外泌体罗格列酮是脂肪细胞中特异性过氧化物酶体增殖因子激活剂的 型受体()的激动剂 其在治疗型糖尿病中的副作用是导致心力衰竭 在一项将脂肪细胞源性外泌体与心肌细胞共培养的实验中 脂肪组织中 的激活会导致 中的 高表达并释放到循环系统中 靶向心肌细胞 下调受体心肌细胞 的表达 促进 信号的激活 导致心肌细胞肥大 然而 抑制该信号途径是否可以减少心力衰竭的发生还有待进一步探索 工程化 相关实验证明利用分子克隆和慢病毒包装技术构建的工程化 比单纯 更有效、更特异地内化 等使用心脏归巢肽修饰 后 可靶向梗死心肌 扩大 的再生效果 实验证明该靶向性 能减少心肌纤维化、诱导心肌细胞增殖、促进血管生成、降低心肌梗死面积并改善梗死动物模型心功能 类器官源性 类器官的研究技术迅速进展 等在心脏类器官中揭示了人类心脏发生的自组织原理令人遗憾的是目前尚缺乏心脏类器官源性 领域的研究 其他来源 氧化低密度脂蛋白处理的巨噬细胞源性 可以促进巨噬细胞迁移和动脉粥样硬化的发展 血浆源性 可抑制心肌细胞增殖和血管生成 促进细胞程序化死亡 心肌细胞、内皮细胞、免疫细胞等各种细胞几乎均可以分泌 对 产生有利或不利的影响 此处不再一一列举 治疗 的瓶颈先前已述 治疗 的优势 但是作为一种新发现的细胞间信号传递物质 其研究仍存在一定局限性 同源性 表达不一致有研究表明 高水平表达 的 可以在体外抑制 /的激活 保护心肌细胞并抑制体内缺血 再灌注模型中的心肌细胞凋亡 但是 在相同细胞源性 治疗 的实验中实时荧光定量 并未发现该 明显表达 也许是由于 的表达通常是在一定特异度、敏感度条件下 纯度、刺激强度、刺激时间、受体细胞的代谢状态等实验条件不同 可能会导致相关实验中 表达出差异 其原因有待进一步研究 整体效应评估困难 的整体“打包作用”与“孤立作用”区别目前未描述清楚 大部分研究表明 对心肌细胞的影响是通过 来实现的 实际上 整体效应难以评估 在受体细胞中的作用成分是单一的还是 内的其他物质也共同参与 具体机制及其作用大小都有待进一步探索 比如 在 等研究中 中的 具有促进血管生成和心肌细胞存活的作用 当其耗尽后 仍然能够抑制心肌凋亡 只是比 存在时作用较弱而已 不排除其他 与 发挥同样或协同作用 另外 目前关于 作为生物标志物诊断疾病的研究 大多数只是简单地分析单个时间点的某一种细胞来源的选定数量的 或蛋白质 没有检测其长时期的变化以及覆盖所有差异表达的 内容物 缺乏高效提纯方法及其他内含物的研究目前 的纯化和分离方法有很多 如超速离心、密度梯度离心、免疫捕获、聚合物沉降、超滤、尺寸排阻色谱、非对称性场流以及微流控分析芯片等 但大多数方法操作复杂、通量有限、得率低、成本高 难以满足临床应用的需求 而且在提取 的过程中难免有白蛋白、细胞碎片等成分的污染 很多学者都在探索 的最佳分离方法 比如 一项研究分析了 种不同超速离心法对血浆 分离纯度的影:/响 指出超速离心结合 蔗糖垫可以提高 的纯度及效率 并对同源血浆 进行了多方面表征分析 治疗 具有稳定性、特异性、靶向性、高生物相容性、低免疫原性的优点 可以通过抗凋亡、促进血管生成、促进心肌细胞增殖等途径修复心肌细胞 因此 成本低、浓度纯、得率高、操作简便的外泌体分离方法有待进一步探索 如制造专门生产 的细胞株等生物学方法 以最大程度减少潜在的不当结论 为下一步应用于临床做准备 也有文献指出 当采用 高级纯化方法时 在提取的 中没 有先前报道过的 结合蛋白(如:、/、和)等利用超稳定同位素标记细胞培养中氨基酸的无偏和定量蛋白质组学方法 结合高分辨率质谱法 发现 蛋白普遍存在于不同方法分离的不同细胞/不同物种和生物流体的 中 可作为 的通用生物标志物由于实验技术上的困难 传统的策略通常难以去除与 共分离的游离蛋白复合体等成分 尤其是在血浆来源 的研究领域中 所以目前大量的 研究都聚焦在 携带的 上 携带的蛋白、脂质等研究则较少见 而且无论是 组学还是蛋白质组学分析 脂蛋白和 蛋白复合体的污染对结果的影响都是致命的 这也是很多研究发生争议的关键所在 移植途径及纳入机制移植途径主要有静脉注射、冠脉内注射、心肌内注射 由于后两者创伤性大 所以静脉注射 是当前实验中常用的移植途径 但如何将治疗性 高效地递送到受体细胞以及移植剂量、移植时间都必须考虑 同时 靶组织内的低保留率也是临床应用的一大难题 本课题组先前研究发现磷脂酰丝氨酸()/磷 脂 酰 丝 氨 酸 受 体()与 纳入靶细胞有重大关系 使用 阻断 上的 和 上的 不能完全阻止 进入内皮细胞即说明/可能不是 源性 进入靶细胞的惟一途径 有其他途径参与纳入的过程还需要进一步探索 除此之外 不同来源、不同内含物、不同剂量的 在不同环境(血液、组织液等)下 纳入机制是否有所差异 目前国内外并无报道 治疗用 的选择虽然 在人体中的安全性、有效性未探索完全 但国外 治疗已经达到人体临床试验阶段 例如治疗急性缺血性脑卒中、皮肤创面愈合、非小细胞肺癌等疾病 由于伦理问题 国内在使用 治疗 领域主要局限在细胞实验与动物实验阶段 缺乏临床试验 同时 的选择也是需要考虑的一个问题 同种异体、自身来源、自身同组织、自身异组织的 在治疗效果与免疫性之间如何正确做出取舍还需要大量的基础实验及临床试验来证明 虽然使用自身来源的 往往是 治疗的主要策略但蛋白质表达和生物信息学研究表明提取年轻的研究对象作为同种异体细胞的主要来源 因为年轻态的细胞可能具有更强的再生能力 的来源不同 作用途径不同 其内含物也不同 在 中的作用也不尽相同 形成与 分泌之间的相互作用等确切机制还需要进一步探索 且大多数心血管领域中关于 的研究是基于二维培养或体内模型 很少使用效果更好的三维体外培养系统 展望 提取方法很多 对于血液、尿液等复杂样本而言 密度、粒径与 相似的颗粒会共分离 而提取的 纯度可决定下游实验的准确性 但由于技术限制 在提取 过程中会有 存在 无法判断 对实验的影响 对于特定样本所适合的 提取方式还需要不断尝试 将 的各组分分开也是研究的重点 由于缺乏临床研究 难以复现 在人体中的真正作用 例如 房颤患者心脏外膜脂肪细胞来源的细胞外囊泡()本身具有较高的炎症因子水平 在体外可以促进房颤发生以及心肌纤维化 那 进入循环血液中 是否还会起到相同作用呢?等通过 测序在黏液瘤性二尖瓣病犬模型的循环血液中发现 上调 下调 但并未进行功能以及临床样本验证 因此 治疗 的分子途径及机制需要密切联系临床探索 以期为 提供新的诊治基础【参考文献】中国心血管健康与疾病报告 概要.中国循环杂志():.:.():.():.():.:空军军医大学学报 年 月 第 卷第 期 :/.:.:.():.():.():.():.()():.():.():.():.():.():.():.():.():.():.():.:.():.():.():/.():.():.():.():.():.():.():.():.:.():.():.:.():.():(收稿 修回)(编辑:崔 悦):/