三叶青超微粉对酒精性肝损伤大鼠肠道菌群的调节作用.pdf

Vol.44 No.18Sep.2023第44卷第18期2023年9月食品工业科技Science and Technology of Food Industry程晓阳，廖明，何全光，等.三叶青超微粉对酒精性肝损伤大鼠肠道菌群的调节作用J.食品工业科技,2023,44(18)：415-424.doi:10.13386/j.issnl002-0306.2022090022CHENG Xiaoyang,LIAO Ming,HE Quanguang,et al.Effects of Tetrastigma hemsleyanum Superfine Powder on Intestinal Microflora in Rats with Alcohol-Induced Liver Injury J.Science and Technology of Food Industry,2023,44(18):415-424.(in Chinese with English abstract),doi:10.13386/j.issnl002-0306.2022090022营养与保健三叶青超微粉对酒精性肝损伤大鼠肠道菌群的调节作用程晓阳伍,廖 明I,何全光3,莫财锋4,黄茂康冷黄梅华，（1.广西医科大学，广西南宁530021;2.肇庆市鼎湖区人民医院,广东肇庆526070;3.广西壮族自治区农业科学院农产品加工研究所，广西南宁530007;4.广西华银医学检验所有限公司，广西南宁530000）摘要：目的：研究三叶青超微粉能否缓解酒精引起的肝损伤，并探讨其保护作用机制，为开发酒精性肝损伤辅助 治疗产品提供新的研究思路。方法：连续给予大鼠8周酒精制备肝损伤模型，同时给予大鼠灌胃不同剂量的三叶 青超微粉，观察其对酒精性肝损伤的保护作用。检测大鼠血清中ALT、AST、ALP和肝组织中GSH、SOD,MDA的变化，观察肝组织病理切片损伤情况，并釆集粪便提取基因组DNA,进行16S rDNA全长测序分析。结 果：与模型组比较，三叶青中、高剂量（0.5和1.0 gkgT）可显著降低大鼠ALT、AST和ALP水平及MDA含量（P0.05）,提高SOD和GSH活性，减轻肝组织病变。肝组织切片证实，三叶青超微粉明显改善酒精所引起的 肝细胞肿胀和脂肪变性，治疗效果类似于阳性药联苯双酯。肠道菌群分析表明，酒精性肝损伤大鼠肠道菌群结构 发生显著变化；三叶青、阳性药干预对肠道菌群在门、属、种水平上较模型组均有一定程度的改善；三叶青能有 效恢复因酒精增加的普雷沃菌属，降低的约氏乳杆菌、毛杆菌丰度，效果优于阳性药对照组（P0.05）.结论：首次验证了三叶青超微粉对大鼠酒精性肝损伤有明显的保护作用，其机制可能与其抗氧化应激作用及肠道菌群的 调节有关。关键词:三叶青,超微粉,酒精性肝损伤，氧化应激，肠道菌群中图分类号:TS201.4 文献标识码:A 文章编号：1002-0306（2023）18-0415-10DOI:10.13386/j.issnl002-0306.2022090022Effects of Tetrastigma hemsleyanum Superfine Powder on Intestinal Microflora in Rats with Alcohol-Induced Liver InjuryCHENG Xiaoyang1-2,LIAO Ming1,HE Quanguang3,MOCaifeng4,HUANG Maokang3,HUANG Meihua3*收稿日期：2022-09-05基金项目：广西农业科学院团队项目(2021YT110)；T西高校中青年教师科研能力提升项目(2019KY0127)o作者简介：程晓阳(1994-)，女，硕士研究生，研究方向:天然药物药理学,E-mail：。*通信作者：黄梅华(1988-)，女，硕士，高级工程师，研究方向:食药两用植物资源开发利用,E-mail：。(l.Guangxi Medical University,Nanning 530021,China；2.Dinghu Peoples Hospital,Zhaoqing 526070,China；3.Institute of Agro-products Processing and Technology,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007,China;4.Guangxi Huayin Medical Laboratory Center,Nanning 530000,China)Abstract：Objective:To investigate and reveal protective mechanism which the Tetrastigma hemsleyanum(SYQ)ultramicro powder alleviate alcohol-induced liver injury,and to provide a new research idea for clinical treatment of alcohol-induced liver injury.Methods:The rat model of alcoholic liver injury was established by continuous administration of alcohol for 8 weeks.At the same time,rats were given different doses SYQ ultramicro powder by intragastric to observe 416 食品工业科技2023年9月its protective effect on liver injury.Changes of ALT,AST,ALP and GSH,SOD,MDA were detected in serum and liver tissue,respectively.Pathological sections of liver tissue were used to observe the damage.Genomic DNA was extracted from feces and analyzed by 16S rDNA full-length sequencing.Results:Compared with the model group,medium and high doses of SYQ(0.5 and 1.0 g-kg_1)significantly(P0.05)reduced the levels of ALT,AST ALP and MDA,increased the activities of SOD and GSH,and alleviated the liver lesions in rats.The pathological sections revealed that SYQ ultramicro powder dramatically alleviated liver cells swelling and steatosis,and these effectiveness were similar to the group of bifendate.Intestinal microflora analysis showed that the intestinal microflora structure significantly changed in rats with alcoholic liver injury.Compared with the model group,both SYQ and bifendate intervention improved the intestinal flora to a certain extent at phylum,genus and species level.SYQ eflectively recovered the abundance of Prevotella,Lactobacillusjohnsonii9 Raoultibacterjnassiliensis altered by alcohol,and the effect of medium doses of SYQ was better than positive control group(P0.05).Conclusion:The SYQ superfine powder had a significant protective effect on alcoholic-induced liver injury in rats,the mechanism may be related to its antioxidant stress and intestinal flora regulation.Key words：Tetrastigma hemsleyanum;superfine powder;alcohol-induced liver injury;oxidative stress;intestinal microflora有害饮酒被列为全球死亡和残疾的前五大危险 因素之一，据报道每年约造成250万人死亡，约 6940万人残疾。酒精仍然是肝病发生和死亡的主 要原因，过度饮酒导致肝损伤已成为全球令人担忧的 健康问题。酒精性肝病(肛。)与_系列肝脏疾病有 关，从脂肪变性到脂肪性肝炎、纤维化、肝硬化和肝 细胞癌卩勺。有研究表明，饮酒可引起肠道菌群失调，从而导致有益微生物代谢产物的减少和有害微生物 代谢产物的产生,进而导致肠道通透性增加和细菌易 位，引发各种酒精性肝病。因此,肠道菌群被认为是 ALD潜在的治疗靶点叫三叶青(SYQ)是我国特有珍稀植物三叶崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg,葡萄科崖爬 藤属)的块根，形状似红薯,富含淀粉、黄酮、花青素 等成分,是一种民间极具盛名的食药两用植物,具有 护肝防癌等多种功效込对小鼠免疫性肝损伤以及由 四氯化碳或者a-异硫氤酸蔡昨导的肝损伤治 疗和保护作用叫原料经过初步粉碎,再采用特殊机械进一步粉 碎直至粒径达到175 pm的超细粉末被称为超微 粉丽o超微粉碎可增加原料的比表面积和孔隙率、提高溶出速率和生物利用度，特别是非水溶性成分的 生物利用度，进而提高有效成分在体内的吸收速率，提高功效。如党参超微粉对溃疡的抑制率比普通粉 高54%；菊苣根超微粉可改善免疫抑制导致的肠道 菌群紊乱，用量仅约为普通粗粉的50%口1列。目前 国内外对三叶青超微粉的研究较少,特别是对肠道菌 群的调节功能鲜见报道口現因此，本文以酒精性肝损伤大鼠为研究对象，考 察三叶青超微粉对酒精性肝损伤大鼠的改善作用及 其对肠道菌群的影响，为以三叶青超微粉作为主要原 料的保肝护肝及肠道菌群调节产品的开发提供更多 的理论依据。1材料与方法1.1材料与仪器SPF级SD大鼠 6周龄,60只，雌、雄各半，体 重180-210 g左右，由广西医科大学实验动物中心提 供,实验动物许可证号SYXK(桂)2014-0003,饲养 于广西医科大学实验动物中心，恒温21-23七，恒湿(45%65%),各12 h明暗周期的饲养室，普通饲料 喂养，自由进食和饮水,动物实验经广西医科大学动 物伦理委员会批准;三叶青采集于百色兴业县三叶 青种植基地,挑选出无虫孔，颜色形状正常的块根，洗 净表面泥沙等杂质，自然晒干,用中药粉碎机预粉碎 后，用CJM-SY-A KC-701型超微粉碎机粉碎至中位 粒径达到30-40 pm;56度白酒 北京红星股份有限 公司;联苯双酯滴丸 北京协和药厂;过氧化物歧化 酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)测定试 剂盒南京建成生物工程研究所;其它试剂均为 分彌。CJM-SY-A KC-701型超微粉碎机 北京开创 同和科技发展有限公司;BS-2000型全自动化学分析 仪 深圳迈瑞科技股份有限公司；5810R型高速低 温离心机 德国Eppendorf公司；CX31+DP73型倒 置显微镜 奥林巴斯有限公司；MK3-EL800光吸收 酶标仪美国BioTek公司。1.2实验方法1.2.1造模与给药将动物随机分为6组，每组 10只，分别为正常对照组、模型组、阳性对照组(联苯双酯LBSZ 150 mgkg7)和三叶青超微粉低(0.25 gkgT)、中(0.5 gkgT)、高(1.0 g kg1)剂量 组。除正常对照组给同剂量的生理盐水外，其余各组 大鼠均用白酒灌胃造模,参照刘明等的造模方法，30。白酒1 mL/(200 gd)灌胃1周后，改为56。白酒 1 mL/(200 gd)灌胃1周，最后增至56。白酒2 mL/(200 g-d)灌胃至造模成功，即连续灌胃8周。每天 给酒4 h后，阳性对照组和3个三叶青剂量组各大 鼠mL/200 g灌胃给药8周直至实验结束,正常对 照组和模型组灌胃同mH的生SkzK。1.2.2样品采集 参照刘泽鑫、朱诗雅等迁问的方 法,末次给药后,无菌条件下采集各组大彌鲜粪便，第44卷第18期程晓阳，等：三叶青超微粉对酒精性肝损伤大鼠肠道菌群的调节作用 417-80弋备用。动物禁食不禁水,24 h后经麻醉心脏 取血,测定血清生化指标。另外取肝组织固定于多聚 甲醛固定液，用于做病理切片。其余肝组织用预冷生 理盐水清洗后，冻存于-80弋 冰箱,备用。1.2.3血清生化指标的检测参照刘泽鑫、朱诗雅 等15-16的方法，使用全自动生化分析仪测定各种动 物的血液生化指标:谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)O1.2.4肝组织生化指标的检测参照刘泽鑫、朱诗 雅等15-16的方法，称取适量的肝组织,按重量体积比(组织：生理盐水=1：9)加入冰冷的生理盐水，剪碎,冰上匀浆,3000 r min1离心10 min,制成10%肝组 织匀浆，过氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、丙Zl(malonic-dialdehyde,MDA)及蛋白定量按照试剂盒说明书操 作。1.2.5组织病理检査参照刘泽鑫、朱诗雅等MT 的方法,将固定于多聚甲醛的部分肝大叶先用石蜡包 埋,然后进行切片，通过常规苏木素-伊红(hematox-ylin-eosin,HE)染色后，在光学显微镜下观察组织病 理变化。1.2.6大鼠肠道菌群分析 参照Shin等I的方法,称取200 mg粪便样品，按照DNA提取试剂盒说明 书上的操作步骤对各样本DNA进行提取，利用 1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提基因组DNA的完整 性。取质量合格的基因组DNA样品30 ng及对应 的融合引物(全长16S扩增引物：27F-AGRGTTYG ATYMTGGCTCAG 和 1492R-RGYTACCTTGTTA CGACTT)配制PCR反应体系，设置PCR反应参数 进行PCR扩增。使用 Agencourt AMPure XP磁珠 对PCR扩增产物进行纯化并溶于Elution Buffer,贴 上标签，完成建库。使用 Agilent 2100 Bioanalyzer 对文库的片段范围及浓度进行检测。检测合格的文 库根据插入片段大小，选择pacbio平台进行16S全 长测序。1.3数据处理数据均以平均值土标准偏差表示，因实验过程中 有个别组的小鼠会有死亡12只的情况，所以n=810。生理指标数据统计分析采用统计软件SPSS 18.0,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),组内两两比较采用LSD法。菌群数据分 析使用USEARCH(vl 1.0.667)进行OTU聚类结果 统计，R(V3.2.1)的 mixOmics 包用于 OTU PLS-DA分析,R(v3.1.1)的Venn Diagram包用于绘制韦 恩图，RDP classifier贝叶斯算法对OTU代表序列进 行分类学分析。软件mother(v.l.31.2)用于统计 Alpha多样性。LEfSe软件进行物种差异分析，Picru就软件进行菌群功能预测。以上软件均使用默 认参数运行。2结果与分析2.1大鼠一般情况造模过程中，正常对照组大鼠饮食及大便规律,皮毛色泽光亮,行动灵活,体重增长较快;模型组大鼠 在每日给予酒精灌胃后出现反应慢,步态不稳,精神 萎靡且部分呈现嗜睡状态，持续约2 h,而2周后该 组大鼠皮毛色泽变暗,粗糙,精神状态不佳,进食量减 少,体重增加变缓;三叶青给药组和阳性对照组大鼠 一般情况优于模型组。2.2三叶青超微粉对慢性酒精性肝损伤大鼠血清 ALT、AST和ALP的影H向如图1所示,与正常对照组相比,模型组大鼠血 清中ALT、AST、ALP浓度均明显升高约1.5倍。与模型组相比，阳性对照组大鼠血清的ALT、AST 和ALP浓度明显降低；中、高剂量实验组大鼠血清 中的ALT、AST和ALP浓度均有所降低,其中，在中 齐I量组大鼠中，ALT浓度降低至(36.333.79)U L1(PV0.05),AST 浓度降低至(135.1121.24)U L-1(PvO.Ol),ALP 浓度 降低至(85.0041.21)U L1(FV0.05)；在高剂量组大鼠中,ALT、AST和ALP浓 度均降低，但无显著性差异;低剂量组大鼠血清中的 ALT、AST、ALP浓度均无显著性变化。上述结果提示,酒精连续灌胃8周后，可引起大 鼠肝脏转氨酶升高，显示出肝脏毒性，联苯双酯、中ALT*.!Jk*(L.fl)I H VK-KaKaaaKaaA 60-*418 食品工业科技2023年9月c(uoa U I.I O U I U)VGW.0.8.64.2.0.8.64.2l.l.MDA图三叶青超微粉对慢性酒精性肝损伤大鼠血清ALT、AST和ALP的影响Fig.l Effects of SYQ on the activity of ALT,AST and ALP induced by ethanol in rat serum注:A血清ALT浓度,B血清AST浓度,C血清ALP浓度;数 据均以平均值士标准偏差表示;n=810,*P0.05,*P0.01o剂量三叶青对酒精导致的大鼠肝损伤具有保护作用,高剂量三叶青对酒精导致的大鼠肝损伤可能具有保 护作用，低剂量三叶青对酒精导致的大鼠肝损伤未显 示出保护作用。2.3三叶青超微粉对慢性酒精性肝损伤大鼠肝组织氧 化应激指标的影响如图2所示,与正常对照组相比,模型组大鼠肝 脏中GSH、SOD浓度均降低，而MDA浓度升高。与模型组相比，阳性药组和低、中、高剂量组大鼠肝A(U 电 old Lln.boTi)H s ei.SOD10000-5000-B 15000-I工0.0丄图2三叶青超微粉对慢性酒精性肝损伤大鼠肝组织GSH、SOD和MDA的影响Fig.2 Effects of SYQ on GSH,SOD and MDA in liver tissue of rat caused by ethanol注：A肝组织GSH活性，B肝组织SOD活性，C肝组织 MDA活性；数据均以平均值士标准偏差表示；n=810,*P 0.05,*P0.01o脏中GSH、SOD浓度均有所升高，MDA浓度下 降。其中，在中剂量组实验大鼠中,GSH浓度升高至(4.180.45)RgmgTCPv0.01),SOD 浓度升高但无显 著性差异，MDA浓度降低至(0.540.14)nmol mg-1 CPV0.05);在低剂量组实验大鼠中，GSH、SOD浓度 升高但无显著性差异，MDA浓度降低至(0.55土 0.22)nmolmgT(Fv0.05);在高剂量组实验大鼠中，SOD 浓度升高至(9505.511252.47)U mg_1(P低剂量组。2.5三叶青超微粉对慢性酒精性肝损伤大鼠肠道菌群 的影响2.5.1 OTU聚类分析以97%的一致性将序列聚第44卷第18期程晓阳，等：三叶青超微粉对酒精性肝损伤大鼠肠道菌群的调节作用 419 血 wlHo0 T I|0 5 10 15样品数目图5 OTU累积曲线图Fig.5 OTU diagram of integration图3各组大鼠肝脏组织病理学表现(HE,200 x)Fig.3 Histopathological changes of each group(HE,200 x)注:A正常对照组,B模型组,C阳性对照组,D SYQ低剂量 组,E SYQ中剂量组,F SYQ高剂量组;图中蓝色剪头所指为 脂滴。类成为OTUs,OTU表示一组来源于某一相同分类 单元的序列，OTU数量越大说明微生物群落的多 样性越大。如图4所示，共产生795个OTU,其中 CK:674,M:566,Y:592,ST:644,所有样品共有的 OTU 数目为393个，约占总OTU数的49%,其余各组独 有的OTU 数目分别为CK:42,M:2,Y:23,ST:19O酒 精处理会降低大鼠肠道菌群多样性，三叶青和阳性药 均可使物种多样性得到改善。如图5所示，OTU累 积曲线图末端上升趋势趋于平缓，表明采样量足够,继续增加测序深度只会产生少量新的OUTo注:CK：正常对照组;M：模型组;Y：阳性对照组;ST：三叶青 中剂量组;图6同。2.5.2 OTU PLS-DA分析 为了更好地分析各组间 差异，进行了 PLS-DA分析。如图6所示，模型组(M)、阳性对照组(Y)、三叶青中剂量组(ST)均与正ahswiho.a-10 0 10 20 X.CK-M-ST-Y图 6 OTU PLS-DAFig.6 OTU PLS-DA常对照组(CK)明显区分开来,说明酒精处理可对大 鼠肠道微生物物种多样性造成显著差异,三叶青中剂 量组(ST)与模型组(M)之间差异较小。2.5.3 Alpha多样性 Alpha多样性是反映物种丰富 度和均匀度的综合指标。选择observed Species指 数、Chao指数、ACE指数，Shannon指数以及 Simpson指数评价其Alpha多样性。前4个指数越 大，最后一个指数越小，说明样品中的物种越丰富。其中，observed Species指数、Chao指数和 ACE指 数反映样品中群落的丰度，只与群落中物种的数量有 关,与群落中每个物种的丰度无关;Shannon指数和 Simpson指数反映群落的多样性，与样品群落中物种 丰度和物种均匀度有关。如表1所示,前三项指标 指示各样品的物种丰度规律较一致，由高到低依次 为:正常对照组(CK)三叶青中剂量组(ST)u阳性对 照组(Y)模型组(M),说明灌胃酒精会显著降低大 鼠肠道菌群物种丰度,三叶青或阳性药组大鼠肠道菌 群物种丰度有所升高，效果相近，但未见统计学差 异。后两项指标指示样品的物种多样性和均匀度变 化与丰度变化一致。2.5.4三叶青超微粉诱导酒精性肝损伤大鼠肠道菌 群结构变化 通过与数据库比对,将OTU在不同的 分类等级进行分类并注释，得到物种注释柱状图。如 图7所示,在门水平上，厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆 菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)在所 有样品中占绝对优势，其相对丰度之和均在80%以 420 食品工业科技2023年9月注:同列中*表示差异显著N0.05。表1 Alpha多样性指数 Table 1 Alpha diversity index分组sobsChaoACEShannonSimpsoncoverage正常对照组425.2537.23*529.60558*509.5758.90*4.750.08*0.020.00*0.980.003模型组351.5040.44450.4856.42453.5955.334.0H0.640.080.050.980.004阳性对照组364.0031.86472.8935.95474.8242.314.400.370.050.030.980.007三叶青中剂量组364.7518.77478.5545.97472.1745.794.420.110.040.020.980.005TenericutesSpirochaetes Others Actinobacteria Proteobacteria Cyanobacteria Kiritimatiellaeota PlanctomycetesI Deferribacteres BacteroidetesFirmicutes Not_Available Verrucomicrobia Elusimicrobia图7基于门（phylum）分类水平的分析上。与正常对照组相比，模型组厚壁菌门丰度极显著 降低（PV0.01）,拟杆菌门、变形菌门丰度显著升高（PV0.05）,三叶青中剂量组、阳性对照组均可使其得 到恢复，且三叶青中剂量组效果更优。如图8所示,在属水平上,与正常对照组相比,模型组普雷沃菌属（Prevotella）、厌氧螺菌属 Anaerobiospirillum）显著 增力口（FV0.05）,三叶青中剂量组、阳性药对照组均得 到恢复，普雷沃菌属三叶青效果更优,厌氧螺菌属阳 性药更优;模型组、三叶青中剂量组、阳性药对照组 较正常对照组Lachnoclostridium乳杆菌属（。少0-baclllus）、Muribaculum 瘤胃球菌属a?%7nZzzococss）、支原体属 Allobaculum）、真杆菌属（Eubacterium）、罗姆布茨菌（2?o加加“岱加）减少，三叶青中剂量组乳杆 菌属、Muribaculum罗姆布茨菌可得到有效“灰复。如图9所示，在种水平上，模型组、阳性药对照 组较正常对照组产粪銜醇真细菌（Eubacterium coprostanoligenes）、肠道粘液杆菌（MuribaculumFig.7 Analysis of intestinal microbial flora among groups in phylum levelCK M ST Y样品名称 RoseburiaLachnoclostridium Prevotellamassilia Lactobacillus Others ParabacteroidesMuribaculumTidjanibacter Mailhella Collinsella Porphyromonas SporobacterOscillibacterButyrivibrioRomboutsia PrevotellaRuminiclostridium SchwartziaPhascolarctobacterium Eisenbergiella Barnesiella Anaerobiospirillum Halomicronema Neglecta Alistipes Ruminococcus Allobaculum Paraprevotella Eubacterium Anaerocella Bacteroides图8基于属（genus）分类水平的分析Fig.8 Analysis of intestinal microbial flora among groups in genus level0100 80-604020CK M ST Y样品名称Prevotella_copriRoseburia_hominisAnaerocella_delicata Schwartzia_succinivorans Ruminococcus_callidus Prevotellamassilia_timonensis Lactobacillusjnurinus RuminococcusJlavefaciens Butyrivibrio _crossotus Clostridium_straminisolvens Paraprevotella_clara Romboutsia_ilealis Ruminococcusjbromii Halomicronema_excentricum OthersTidjanibacterjnassiliensisSporobacterJermitidis Anaerobiospirillum_succiniciproducens Oscillibacter_yalericigenes MuribaculumJ,ntestinale Phascolarctobacterium _succinatutens Mailhellajnassiliensis Parabacteroides_distasonis Eisenbergiellajnassiliensis Allobaculum tercoricanis Eubacterium_coprostanoligenesEubacterium_siraeum Porphyromonas_pogonae Neglecta_timonensis图9基于种（species）分类水平的分析Fig.9 Analysis of intestinal microbial flora among groups in species level第44卷第18期程晓阳，等：三叶青超微粉对酒精性肝损伤大鼠肠道菌群的调节作用 421 intestinale)减少,三叶青中剂量组得到恢复;模型组、三叶青中剂量组较正常对照组产琥珀酸厌氧螺杆菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)增力口，阳，性 对照组得到有效恢复;模型组麻常对照组人体普氏 菌c%动显著增加，三叶青中剂量组、阳 性对照组均得到有效恢复。在种水平上对具有显著性差异(PV0.05)的菌种 进行分析,绘制差异菌种热图。如图10所示,模型 组(M)约氏(Lactobacillus_Johnsonii)、毛杆菌(,Raoultibacter_massiliensis)丰度较正常对照组(CK)显著降低，三叶青中剂量组(ST)能有效恢复酒精降 低的约氏乳杆菌、毛杆菌丰度，效果优于阳性药对照 组(Y)；同时三叶青中剂量组Gabonia_massiliensis Collinsella_stercoris 普雷沃氏菌(Prevotella_ster-corea)、Turicibacter_sanguinis 副腐化梭状芽胞杆(Clostridium_paraputrificum)丰度增加,与其它三 组差异显著。相关研究表明约氏乳杆菌具有抗炎、缓解抑郁、提升肠道代谢率、改善过敏等多种益生作 用18-20；过敏、多发性硬化症等的发生均与普雷沃氏 菌丰度减少有关，普雷沃氏菌可参与治疗肥胖、代谢 综合征、炎性肠病等，但作用及机制等还需进一步探 究验证；Turicibacter_sanguinis在肠道中表达一种神 经递质钠转运相关蛋白OH；Gabonia_massiliensis等 其他几个菌种可査证的资料较少,对人体的利弊等还 有待进一步研究。照组(Y)中以拟杆菌门中拟杆菌科(Bacteroidaceae),拟杆菌纲(Bacteroidia)拟杆菌目(Bactcroidales)，以 及草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)为代表，三叶青中 剂量组(ST)中则以厚壁菌门中的氨基酸球菌目(Acidaminococcales)氨基酸球菌科(Acidamino-coccaceae)为代表。因此，酒精造成大鼠肠道菌群严 重失调,采用阳性药和三叶青干预在一定程度上促进 了肠道菌群多样性及组成结构的恢复。Cladogram ST=M二 Y=CK吕a:Eggerthellaceae b:Eggerthellales口 c:Bacteroidaceae口 d:Odoribacteraceae e:Prevotellaceae 口 f:Bacteroidales口 g:Bacteroidia 口 h:Streptococcaceae口 i:Acidaminococcaceae 口 j:Acidaminococcales O k:Oxalobacteraceae图11 LEfSe分析聚类图 Fig.11 LEfSe analysis of cluster graph 0.20 0.400.60 0.80 1.00 1.20 1.40M Porphyromonas_pogonae Lactobacillusjohnsonii Collinsella_stercoris GaboniajnassiliensisPrevotella_stercorea Clostridium _paraputrificum Turicibactersanguinis Marseillajnassiliensis Raoultibacterjnassiliensis Saccharqfermentans_acetigenes Parasutterellajsecunda odoribacterjsplanchnicus Eggerthella_sinensis Sphaerochaeta_coccoidesEubacterium_oxidoreducens Adlercreutzia_equolifaciens Bacteroides_stercoris Bamesiella_yiscericolaST Y基于16S rRNA基因测序数据使用PICRUSt软 件预测其功能基因含量,以评估各组微生物之间潜在 的功能差异,并采用kruskal test检验差异显著性,筛 选出差异显著(P0.05)的代谢通路并制作热图。如 图12所示，与正常对照组(CK)比较,酒精持续灌胃 后多条代谢途径出现了显著差异，其中三竣酸循环(TCA cycle),氨基酸降解(Amino Acid Degradation),碳1化合物利用及同化(Cl Compound Utilization and Assimilation)显著升高，而氨和聚氨降解(Amine and Polyamine Degradation),ermenta-tion),碳水化合物降解(Carboxylate Degradation),抗图10差异显著的菌种热图Fig.10 Heatmap of significantly differential species2.5.5差异物种分析及功能预测根据多级物种差 异判别(LEfSe)分析显示了四组间丰度差异显著的 物种，如图11所示,正常对照组(CK)中菌群结构主 要以伊格尔兹氏菌目(Eggerthellales)中的伊格尔兹 氏菌(Eggerthellaceae),拟杆菌门(Bacteroidetes)中 的臭 杆菌科(Odoribacteraceae),厚 壁菌门(Firmicutes)中的链球菌科(Streptococcaceae)为代 表;而酒精处理后的模型组(M)中菌群结构只剩拟杆 菌门中普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)占优势；I性对Carbohydrate Degradation Carboxylate Degradation Amino Acid Biosynthesis FermentationAmine and Polyamine DegradationAntibiotic Resistance RespirationElectron Transfer1.501.000.500.00-0.50-1.00-1.50Fatty Acid and Lipid DegradationAmino Acid DegradationTCA cycleCl Compound Ut